第二章　生物化學實驗

實驗一　氨基酸紙色譜

一、實驗目的

1.通過對氨基酸的分離和鑒定，掌握紙色譜的基本原理及操作方法。

2.通過實驗，理解氨基酸與茚三酮的顯色反應原理，掌握顯色反應現象。

二、實驗原理

色譜法又稱層析法，是一項重要的分離分析技術，利用混合物中各組分理化性質的不同，使各組分以不同程度分配在兩相中。

根據色譜的工作原理可分為：分配色譜、吸附色譜、親和色譜、離子交換色譜。根據色譜支持物的不同可分為：紙色譜、柱色譜、薄層色譜、凝膠過濾色譜。氨基酸的紙色譜屬于分配色譜，其原理是利用各種物質在兩種互不溶解的溶劑中分配系數的不同，從而達到分離的目的。分配色譜一般用于分離在水和有機溶劑中都有一定溶解度的混合物。

紙色譜的分配過程是一部分溶質隨有機相（展層溶劑）移動，離開原點進入無溶質區，并進行重新分配，不斷向前移動。隨著有機相不斷向前移動，溶質不斷地在兩相間進行可逆的分配（圖2-1）。一種物質在兩相中達到平衡時，在兩相中的濃度之比是一個常數，稱為分配系數（K_D）。

由于各種物質的分配系數（K_D）不同，隨展層溶劑移動的速率也不同，從而達到分離的目的。移動速度可用比移值（R_f）或遷移率表示：

對于水-正丁醇的溶劑體系，氨基酸極性越小，K_D值越大，R_f值也越大，一定時間內隨流動相遷移的距離越大，反之遷移距離越小。

三、器材和試劑

1.器材

展開槽，色譜濾紙（約15cm×15cm），電吹風機，噴霧器，毛細管，鉛筆，針線，烘箱等。

2.試劑

（1）氨基酸標準液　6mg/mL。

（2）未知氨基酸溶液　6mg/mL。

（3）展層劑　水飽和正丁醇（或苯酚）溶液，即4份水飽和的正丁醇和1份醋酸的混合物。將20mL正丁醇和5mL醋酸放入分液漏斗中，與15mL水混合，充分振蕩，靜置后分層，放出下層水層。取擴展劑倒入培養皿中備用。

（4）顯色劑　0.3%茚三酮丙酮溶液。

四、實驗內容

1.色譜濾紙的準備

用鉛筆在色譜濾紙上距離一端2～3cm處劃直線（記為色譜底邊點樣線），在直線上標記標準氨基酸和未知氨基酸點樣位置，并作上記號。

2.點樣（少量多次）

用毛細管平口端蘸取少量樣品溶液，點樣于濾紙的相應位置，要求樣品斑點直徑不超過0.3cm，干燥后再點樣，重復3次。注意樣品點不要吹得太干燥，否則，樣品物質的分子會牢牢吸附在色譜濾紙的纖維上，出現拖尾現象。

3.縫合成圓柱體（依據展開槽類型，選做）

小心將色譜濾紙沿垂直底邊的兩條邊，以針線縫合，制成圓柱體（圖2-2）。注意，縫合針線應靠近邊緣，不可出現在氨基酸色譜點可能色譜經過的區域。

4.展層

將濾紙放入展開槽，使濾紙底邊以下部分浸入液面，但不要使液面沒過點樣線。展層50～60min，取出濾紙，用鉛筆繪出溶劑前沿線（圖2-1）。

5.顯色

將濾紙吹干，用噴霧器把茚三酮溶液均勻細致地噴灑在濾紙點樣線和溶劑前沿有效面上，吹干后放在80℃烘箱中烘干顯色。

五、結果與分析

用鉛筆描出色斑輪廓，找出中心點。如果斑點形狀不規則或出現明顯的“拖尾”，則圈出顏色集中均勻的部分。

觀察記錄標準品和樣品氨基酸與茚三酮溶液反應后的顏色，測量色譜點和溶劑前沿距離，并計算各色斑的R_f值，對照氨基酸標準品，確定未知樣品中氨基酸種類。

六、思考題

1. R_f值的概念。

2.如何計算R_f值？影響該值的因素有哪些？

3.紙色譜分離氨基酸的原理是什么？

4.分析造成色斑拖尾現象的原因。

七、注意事項

1.點樣量要適當，點樣要均勻。

2.盡可能不要用手去觸摸濾紙有效面。

3.色譜分離時間根據色譜系統的具體情況而定，使分配系數相近的氨基酸分開。

4.噴茚三酮溶液時要均勻、適量，不可過多。