2.1　熒光分析法

熒光法根據光的波長范圍不同，可分為X射線熒光分析法、紫外-可見熒光分析法、紅外熒光分析法。根據待測物質的存在形式，又可分為分子熒光法和原子熒光法。本章主要介紹由分子產生的波長位于紫外-可見光區的熒光。

分子吸收一次光后受到激發，受激發的分子在去激發過程中再發射出波長比激發光波長更長的位于紫外-可見光區的二次光，這種光稱為（分子）熒光（fluorescence）。當激發光停止照射后，發光現象隨之消失。因此，熒光是一種光致發光。由于物質分子結構不同，所吸收光的波長及發射的熒光波長也不相同，利用這個性質可以鑒別物質；同種物質的濃度不同，所發射的熒光強度亦不同，利用這個性質可以對物質的濃度進行測定。利用熒光的波長和強度分別進行定性和定量分析的方法稱為熒光分析法。

2.1.1　熒光分析法基本概念

2.1.1.1　熒光及其產生

分子熒光是分子吸收輻射后從激發態的最低振動能級回到基態各振動能級時發射的光。

（1）分子的激發態——單線激發態和三線激發態

一個分子的外層電子能級包括基態S₀和各激發態S₁、S₂、…、T₁、T₂…，每個電子能級又包括一系列能量非常接近的振動能級，振動能級還包括一系列的轉動能級。

大多數分子含有偶數電子，在基態時，這些電子成對地存在于各個原子或分子軌道中，成對自旋，方向相反，電子凈自旋等于零：；其多重性M=2S+1=1（M為磁量子數）。因此，分子是抗（反）磁性的，即其能級不受外界磁場影響而發生分裂，稱為“單線（基）態”。

當基態分子成對電子中的一個吸收光輻射后，被激發躍遷到能量較高的軌道上，通常它的自旋方向不改變，則激發態仍是單線態，即“單線激發態”（或稱為單重激發態），用S₁、S₂…表示第一、第二電子激發單重態。如果電子在躍遷過程中，還伴隨著自旋方向的改變，這時便具有兩個自旋不配對的電子，電子凈自旋不等于零，而等于1（）；其多重性M=2S+1=3。即分子在磁場中受到影響而產生能級分裂，這種受激態稱為“三線激發態”（或稱三重激發態），用T表示；“三線激發態”比“單線激發態”能量稍低。但由于電子自旋方向的改變在光譜學上一般是禁阻的，即躍遷概率非常小，只相當于單線態至單線激發態躍遷過程的10^-7～10^-6（見圖2-1）。

（2）分子去激發過程及熒光的產生

室溫下，大多數分子處在基態的最低振動能級，處于基態的分子吸收能量（化學能或光能等）后被激發成為激發態。處于激發態的分子不穩定，在較短的時間內可通過不同途徑釋放出多余的能量，通過輻射或無輻射躍遷回到基態，這個過程稱為“去激發”。返回到基態時伴隨著光子的輻射，則有“發光”現象產生。若分子吸收輻射時被激發至第一或更高電子激發態任一振動能級，先以無輻射躍遷形式損失其振動能后下降至第一電子激發態的最低振動能級，然后再以光輻射形式躍遷到電子基態的任一振動能級，即產生熒光。分子熒光的產生過程如圖2-2所示。

熒光的產生過程分為四步：①處于基態最低振動能級的熒光物質分子受到光照射，吸收與其特征頻率相一致的光，躍遷到激發態的各振動能級；②被激發到激發態各振動能級的分子，通過無輻射躍遷，降落到第一電子激發態的最低振動能級；③處于第一電子激發態最低振動能級的分子，繼續躍遷至基態各振動能級，同時輻射光子（熒光）；④各基態振動能級的分子通過無輻射躍遷回到基態最低能級。

激發態的分子是不穩定的，它可能通過輻射躍遷和無輻射躍遷等去激發過程返回基態，其中以速度最快、激發態壽命最短的途徑占優勢。有以下幾種基本的去激發過程。

振動弛豫：同一電子能級中，處于高振動能級的溶質分子與溶劑分子間發生碰撞，電子由高振動能級轉至低振動能級，而將多余的能量以熱的形式發出。振動時間10^-13～10^-11s。

熒光發射：當分子處于單重激發態的最低振動能級時，去活化過程的一種形式是在10^-9～10^-7s左右的短時間內發射一個光子返回基態，這一過程稱為熒光發射。

外轉移：激發態熒光分子與溶劑分子或其他溶質分子相互作用（如碰撞）而以非輻射形式去激發回到基態的過程。

內轉換：內轉換指的是相同多重態等能態間的一種無輻射躍遷過程。當激發態S₂的較低振動能級與S₁的較高振動能級的能量相當或重疊時，分子有可能從S₂的振動能級以無輻射方式過渡到S₁的能量相等的振動能級上，這一無輻射過程稱為“內轉換”。當兩個電子能級的振動能層間有重疊時，則可能發生電子由高能層以無輻射躍遷方式躍遷到低能層的電子激發態。

系間跨（竄）躍：當電子單線激發態的最低振動能級與電子三線激發態的較高振動能級相重疊時，發生電子自旋狀態改變的S-T躍遷，這一過程稱為“系間跨躍”。通常含有高原子序數的原子（如Br₂、I₂的分子）中，由于分子軌道相互作用大，系間跨躍較為常見。

磷光發射：第一電子三線激發態最低振動能級的分子以發射輻射（光子）的形式回到基態的不同振動能級，此過程稱為“磷光發射”。

從表面上看，磷光的波長較熒光的波長稍長，發生過程較慢，約為10^-4～10s。

由于三線態-單線態的躍遷是禁阻的，因此三線態壽命比較長，若沒有其他過程同它競爭時，磷光的發生才有可能；同樣由于三線態壽命較長，因而發生振動弛豫及外轉移（外轉換）的概率也高，失去激發能的可能性大，以致在室溫條件下很難觀察到溶液中的磷光現象。因此，試樣采用液氮冷凍降低溫度去活化才能觀察到某些分子的磷光。

上述各去激發過程可用圖2-3表示。

處于激發態的分子，除可以通過上述的光輻射、熱輻射方式外，還可通過化學反應和電離等不同途徑回到基態，哪種途徑的速度快，哪種途徑就優先發生。例如發射熒光時受激分子去活化過程與其他過程相比較快，則熒光發生概率高，強度大；而發射熒光時受激分子去活化過程與其他過程相比較慢，則熒光很弱或不發生。

2.1.1.2　熒光的激發光譜和發射光譜

熒光為光致發光，因此，熒光物質都具有兩個特征光譜，即激發光譜和熒光光譜。

激發光譜：固定熒光測量波長（發射波長），改變激發光的波長，測量不同波長激發光λ_ex照射下熒光強度的變化，記錄熒光強度I_F與激發光波長的關系曲線。從激發光譜圖上可找到發生熒光強度最強的激發波長λ_ex，選用λ_ex可得到強度最大的熒光。

發射光譜：即熒光光譜，固定激發光波長和強度，記錄在不同波長λ_em下所發射的熒光強度I_F，所得關系曲線即不同波長下熒光強度的分布。

圖2-4為蒽的激發光譜和發射光譜。

熒光物質的最大激發波長λ_ex和最大發射波長λ_em是鑒定物質時定性的依據，也是定量測定時獲得高靈敏度的條件。根據熒光產生的性質，熒光發射波長λ_em>熒光激發波長λ_ex。

激發光譜與吸收光譜的關系：兩種曲線經常相似，甚至說激發光譜是吸收光譜的復制品。在峰值處，吸收最多，發射熒光強度最大。但前者是熒光強度與波長的關系曲線，后者是吸光度與波長的關系曲線，性質不同。

熒光光譜和吸收光譜的關系：對比圖2-5中蒽的熒光光譜曲線和吸收光譜曲線可以看出，①吸收光譜有兩個吸收帶，而熒光的譜帶數較少。因為熒光發生是由第一電子激發態的最低振動能級開始的，既使物質分子被激發至更高能級，也得先通過無輻射躍遷回到第一激發態，再向下躍遷產生熒光。②能級躍遷圖還可看出熒光的波長比吸收光第一吸收帶波長要長。③熒光光譜與吸收光譜第一吸收帶的形狀基本相似，且呈“鏡像對稱”關系（如圖2-6所示）。吸收光譜第一吸收帶形狀主要由第一激發態中能級分布決定；熒光光譜主要由基態中的能級分布決定，基態的能級分布與第一激發態能級分布情況類似，故其形狀相似。

2.1.1.3　熒光效率

又稱熒光量子產率，是熒光物質的重要發光參數，其值由下式得到：

熒光效率與物質化學結構及化學環境有關，而幾乎與激發波長及稀溶液濃度無關。

2.1.1.4　熒光猝滅

處于激發態的熒光分子與其他分子相互作用引起熒光強度降低甚至熒光消失的現象，稱為熒光猝滅（也稱熄滅）。引起熒光強度降低或熒光消失的物質稱為熒光猝滅劑。

引起溶液中熒光物質熒光猝滅的因素很多，主要如下。

①碰撞猝滅　是猝滅的主要原因。指處于激發態的熒光分子M^*與猝滅劑Q發生碰撞后，使激發態分子以無輻射躍遷方式回到基態，因而產生猝滅：

②能量轉移　M^*與猝滅劑作用后，能量發生轉移，猝滅劑被激發。

能量轉移在熒光分析中常被用于提高檢測的靈敏度。在測定熒光效率不高的化合物時，使激發態的待測物將能量轉移給高熒光效率的試劑，可以大大提高熒光強度。

2.1.1.5　化學發光

在化學反應過程中，某些化合物接受能量而被激發，從激發態返回基態時，發射出一定波長的光。

2.1.2　熒光強度及影響因素

2.1.2.1　熒光強度與溶液濃度的關系

熒光是由物質吸收激發光的能量后發射產生，因此，溶液的熒光強度I_f與溶液吸收激發光的程度有關：

式中，K^*為常數，取決于熒光物質的熒光效率?；I₀為入射光（激發光）的強度；I為入射光被吸收后的透射光的強度。

根據朗伯-比耳定律：

式中，ε為摩爾吸光系數；b為吸收池厚度；c為熒光物質的濃度。

則

而

則

若溶液為稀溶液，2.303εbc<0.05，上式括號內第一項以后的各項均可忽略不計，則有近似式：

當I₀固定時，I_F=Kc，此式即為熒光分析定量關系式。

注意：

①僅在低濃度條件下，I_F與c成正比；

②I_F∝ε（I₀、b、c、K^*固定時），吸收越大，熒光強度越大；另一方面，吸收光譜與ε有關，故熒光光譜曲線與吸收光譜曲線形狀相似；

③I₀大時I_F大，增強激發光強度可提高靈敏度。

熒光分析法根據熒光的波長和強度來進行分析。因此，熒光分子的熒光性質是進行熒光分析的關鍵。然而，有的化合物有熒光，有的沒有；有的熒光強，有的熒光弱。因此，如何將無熒光的物質轉化成有熒光的物質，將弱熒光的物質轉化成強熒光物質，對于熒光分析非常重要。研究發現，有機物熒光的產生與其結構間存在一定的關系。

2.1.2.2　有機物的熒光與其結構的關系

有機化合物的熒光與其結構有密切的關系，影響有機物熒光效率的主要因素有：躍遷類型、共軛效應、分子共平面效應和取代基效應。

（1）躍遷類型

大多數熒光物質具有π、π^*及n、π^*電子共軛結構，熒光的產生都是分子先經歷π→π^*或n→π^*激發，然后經過振動弛豫或其他無輻射躍遷，再發生π^*→π或π^*→n躍遷而得到熒光。其中π^*→π躍遷有較大的熒光效率，能產生較強的熒光，是產生熒光的主要類型。這是因為：①π→π^*的摩爾吸光系數ε通常比n→π^*的大2～3個數量級，躍遷概率大；②　π→π^*躍遷的激發單線態與三線態間的能量差別比n→π^*的大得多，電子不易形成自旋反轉，S-T系間跨躍概率很小，因此，π→π^*躍遷的壽命短，為10^-8～10^-7s（而n→π^*躍遷壽命為10^-7～10^-5s），不易發生其他非熒光的去激發，從而有利于熒光的發射。

所以，那些具有π→π^*共軛雙鍵的分子才能發射較強的熒光；且π電子共軛程度越大，?越大，熒光強度就越大，λ_ex與λ_em產生較大紅移。

（2）共軛效應

容易實現π→π^*激發的芳香族化合物易產生熒光，因此，增加體系的共軛程度，熒光效率也增大。原因是具有共軛體系的有機物分子具有較大的摩爾吸光系數ε。

（3）分子共平面效應

熒光分子的共平面性增加，共軛體系大，有利于π→π^*躍遷。例如，熒光素呈平面構型，氧橋把兩個環固定在一個平面上，其結構具有剛性，它是強熒光物質；而酚酞分子由于不易保持平面結構，故不是熒光物質。

又如：

（4）取代基效應

芳香族化合物的環上具有不同取代基時，熒光強度（效率）和熒光波長都發生改變。

①（芳環上）給電子基團的取代基團使π共軛程度升高，一般可增強熒光。由于這些基團上孤對電子的電子云幾乎與芳環上的π電子軌道平行，因而實際上它們共享了共軛π電子，形成了p-π共軛，擴大共軛體系。如烷基、—OH、—NH₂、—OR、—NR₂等，同時熒光光譜紅移。例如苯的部分含給電子取代基的衍生物的熒光效率和熒光波長見表2-1。

②（苯環上）吸電子取代基以及鹵素取代基（F^-除外）通常減弱熒光，甚至使熒光猝滅。如：—NO₂、—COOH、—CHO和—NN—等。這類基團都會發生躍遷，屬于禁阻躍遷，所以摩爾吸光系數小，熒光發射也弱，而系間跨躍較為強烈，同樣使熒光減弱。例如，苯的部分含吸電子取代基的衍生物的熒光效率為：氟苯0.16、氯苯0.05、溴苯0.01、碘苯0.00、硝基苯0.00、苯甲酸0.00。

此外，取代基位置對芳烴的熒光也有影響。鄰位、對位取代者通常增強熒光；間位取代者抑制熒光（—CN取代者例外）。如：

③熒光分子發生電離后，熒光性質也會發生變化，但機理不詳。例如苯酚陰離子無熒光，苯胺陽離子也無熒光，但兩個苯環相連的化合物，又表現出相反的性質，分子形式無熒光，離子化后顯熒光。如1-萘酚-6-磺酸無熒光，但其羥基發生陰離子化后產生藍色熒光。

④取代基為原子序數高的原子，能夠增加體系間跨躍的發生，使熒光減弱甚至猝滅。如Br、I。

2.1.2.3　金屬離子螯合物的熒光

熒光分析中利用形成金屬離子螯合物對金屬離子進行檢測。常見的金屬離子螯合物熒光的產生分為兩種類型。

（1）螯合物中配位體的發光

絕大多數發光螯合物屬于該類型。許多有機試劑雖然具有共軛雙鍵，但由于不是剛性結構，分子不處于同一平面，因而不發出熒光。若這些化合物和金屬離子形成螯合物，隨著分子剛性增強，平面結構增大，常會發出熒光。

如2，2'-二羥基偶氮苯與Al³⁺反應生成螯合物：

如：

又如8-羥基喹啉本身有弱的熒光，但其Mg²⁺、Al³⁺等螯合物有很強的熒光，這是螯合物分子的剛性和共平面性都增加的原因。

這類螯合物中Mⁿ⁺通常為硬酸結構：Be²⁺、Mg²⁺、Al³⁺、Zr⁴⁺。

（2）螯合物中金屬離子的發光

這類發光先是螯合物中配位體L吸收激發光產生π→π^*躍遷被激發成為L^*，接著L^*把能量轉移給M，導致M的d→d^*、f→f^*躍遷被激發，接著產生d^*→d、f^*→f躍遷返回基態，發射熒光。這類發光M通常有不飽和次外層電子，如Cr³⁺（d³）與乙二胺形成的螯合物以及Mn²⁺（d⁵）與8-羥基喹啉-5-磺酸形成的螯合物都產生d^*→d躍遷熒光。

能夠與金屬離子形成熒光絡合物的有機螯合劑，絕大多數是芳香族，且芳環上有兩個官能團。試劑常見的有席夫堿類（—CHN—）、蒽醌類（如）、8-羥基喹啉及衍生物、偶氮類（—NN—，如熒光鎵試劑）、黃酮類（母體結構：）、大環化合物（卟啉，冠醚等）。

2.1.2.4　實驗條件對熒光強度的影響

（1）激發光源

激發光強度I₀增大，熒光強度增大，靈敏度增加。

（2）溶劑的影響

溶劑的影響可分為一般溶劑效應和特殊溶劑效應兩種，前者指的是溶劑的折射率和介電常數的影響；后者指的是熒光體和溶劑分子間的特殊化學作用，如氫鍵的生成和化合作用。一般溶劑效應是普遍的，而特殊溶劑效應則取決于溶劑和熒光體的化學結構。特殊溶劑效應所引起熒光光譜的移動值，往往大于一般溶劑效應所引起的移動值，由于溶質分子與溶劑分子間的作用，使同一種熒光物質在不同溶劑中的熒光光譜可能會有顯著的不同。有的情況下，增大溶劑的極性，將使n→π^*躍遷的能量增大，π→π^*躍遷的能量減小，從而導致熒光增強，熒光峰紅移。8-巰基喹啉在四氯化碳、氯仿、丙酮和乙腈四種不同極性溶劑中的情況就是一例（見表2-2）。但也有相反的情況，例如苯胺萘磺酸類化合物在戊醇、丁醇、丙醇、乙醇和甲醇五種醇中，隨著醇的極性增大，熒光強度減弱，熒光峰藍移。因此，熒光光譜的位置和強度與溶劑極性之間的關系，要看各種熒光物質與溶劑的不同而異。

如果溶劑和熒光物質形成了化合物，或者溶劑使熒光物質的電離狀態改變，則熒光峰位置和強度都會發生較大的改變。

（3）溶液黏度和溫度

黏度大，溫度低，可減小碰撞引起的熒光猝滅，熒光強度增大。溫度對熒光強度的影響較敏感，因此熒光分析時一定要控制好溫度。溫度上升使熒光強度下降，其中一個主要原因是分子的內部能量轉化作用。當激發分子接受額外熱能時，有可能使激發能轉換為基態的振動能量，隨后迅速振動弛豫而喪失振動能量。另一個原因是溶液溫度下降時，介質的黏度增大，熒光物質與溶劑分子的碰撞也隨之減少。相反，隨著溫度上升，碰撞頻率增加，使外轉換的概率增加。

（4）溶液pH

如果熒光物質含有酸性或堿性基團，則溶液pH的變化會使熒光物質各種型體的不同比例發生變化，從而對熒光光譜的形狀和強度產生影響，所以需要嚴格控制溶液的酸度。

（5）熒光猝滅、自猝滅和自吸收

溶解氧能引起幾乎所有的熒光物質產生不同程度的熒光猝滅現象，因此，在較嚴格的熒光實驗中必須除O₂。

熒光物質的濃度較大時，激發態分子之間碰撞增多，在碰撞中引起能量損失，產生自猝滅，使熒光強度減小。

熒光被基態分子吸收，則引起自吸收，亦使熒光強度減小。

2.1.3　儀器裝置

熒光分析所用的儀器是熒光分析儀，由以下部分組成：激發光源、樣品池、單色器、檢測器、顯示系統。圖2-7是熒光分光光度計基本部件示意圖。

光源發出的光經第一單色器（激發光單色器），得到所需I₀，經溶液吸收后，向各個方向發射熒光。為了消除入射光及散射光的影響，在入射光的垂直方向檢測I_F，經第二單色器（熒光單色器）消除了共存的其他光線的干擾，得到相應熒光。

（1）激發光源

熒光計中的光源要比吸收法光度計中光源強度大、穩定性高。為適應不同的元素測定，要求適用波長范圍寬。常用的光源有高壓汞燈、碘鎢燈、氙弧燈、激光光源等。

高壓汞燈：發射較窄的光譜帶，提供線光譜（線光譜的光源強度隨λ變化大），在365nm、405nm、436nm有發射峰，尤以365nm譜線最強，一般濾光片式的熒光計多采用它為激發光源。

碘鎢燈：提供連續光譜，波長范圍為300～700nm。

氙弧燈：通常就叫氙燈。氙弧燈是目前熒光分光分度計中應用最廣泛的一種光源。它是一種電弧氣體放電燈，外套為石英，內充氙氣；提供連續光譜，光強大，在200～800nm波長范圍內可以使用，其中300～400nm段強度相近。

激光光源：發光強度大，能極大地提高熒光分析的靈敏度。

（2）樣品池

通常用石英材料制成長方體形（方形），四面均為光透明面。熒光樣品池要求散射光較少。低溫熒光測定時在樣品池外可套一個液氮的透明石英真空瓶。

（3）單色器

熒光分光光度計中有2個單色器，分別用于選擇激發光波長和熒光波長。

一般熒光計的單色器常采用濾光片，精密儀器常采用光柵，位置同濾光片，但單色性更好。第一單色器位于光源與樣品池之間，用于分離出所需要的激發光，選擇最佳激發波長；第二單色器位于樣品池與檢測器之間，用于濾去溶劑散射光、容器表面散射光、雜質發出的光等，分離出熒光發射波長的光。

（4）檢測器

一般儀器采用硒光電池；精密儀器通常采用光電倍增管作為檢測器。為了消除入射光和散射光的影響，熒光的測量通常在與激發光成直角的方向上進行。

2.1.4　熒光分析測定方法、特點和應用

2.1.4.1　常規的熒光分析法

（1）直接測定法

如果待測物本身能發熒光，可通過測量其熒光強度以測定其濃度。

反應通式為：M+LML

如酸性條件下8-羥基喹啉與Al³⁺反應，生成熒光配合物。

常用的有機熒光試劑有：8-羥基喹啉、安息香、茜素黃R、黃酮醇、二苯乙醇酮等。

（2）間接測定法

有些物質本身不發熒光，或者因熒光量子產率很低而無法進行直接測定，可采用間接測定法。間接測定的方法有多種，可按待測物的具體情況來選擇，主要有以下幾種。

①熒光猝滅法　待測物本身雖然不發熒光，但卻具有能使某種熒光化合物的熒光猝滅的能力，可通過測量熒光化合物熒光強度的下降程度間接測定待測物的濃度。

反應通式為：M+LML

如試劑2-（2'-羥苯基）苯并噻唑本身具有綠色熒光，而與Cu²⁺反應生成配合物后，熒光猝滅，根據熒光強度減小的量可對Cu²⁺進行測定。

又如N與對氨基苯甲酸反應生成重氮鹽后，熒光強度減弱：

②熒光衍生法　某些不發熒光的待測物，可以通過特定的化學反應，轉化為適于測定的發熒光的物質。

如維生素B₁本身不發熒光，但可在堿性溶液中用鐵氰化鉀等氧化劑將其氧化為發熒光的硫色素而進行測定。

③敏化熒光法　若待測物不發熒光，但可通過選擇合適的熒光試劑作為能量受體，在待測物受激發后，通過能量轉移的方法，將激發能傳遞給能量受體，使能量受體分子被激發，再通過測定能量受體的發光強度對待測物進行間接測量。

如在濾紙上用萘作敏化劑測定低濃度的蒽時，蒽的檢測限可提高3個數量級。

2.1.4.2　同步熒光分析法

常規的熒光分析法在分析復雜混合物時常會遇到光譜重疊、不易分辨的困難，需預分離且操作繁瑣。1971年，Lloyd首先提出了同步熒光光譜技術。和常規熒光分析法相比，同步熒光分析法具有譜圖簡化、選擇性提高、光散射干擾減少等特點，并且不需要預分離，操作簡便、節省分析成本、縮短分析時間，尤其適合對多組分混合物的分析。

同步熒光分析法與常規熒光分析法的最大區別是同時掃描激發和發射兩個波長，由測得的熒光強度信號與對應的激發波長（或發射波長）構成光譜圖，稱為同步熒光光譜。同步熒光法按光譜掃描方式的不同，可分為恒（固定）波長法、恒能量法、可變角法和恒基體法四種類型。

（1）恒波長同步熒光分析法

恒波長同步熒光分析法是在掃描過程中使激發波長和發射波長彼此間保持固定的波長間隔Δλ（Δλ=λ_em-λ_ex=常數），即通常所說的同步熒光法，這是最早提出的一種同步掃描技術。在恒波長同步熒光法中，Δλ的選擇十分重要，它直接影響到同步熒光光譜的形狀、帶寬和信號強度。在可能條件下，選擇等于斯托克斯位移的Δλ。

圖2-8為Δλ=3nm時蒽的同步熒光光譜，與圖2-4的激發光譜和發射光譜相比，同步光譜明顯變窄。

恒波長同步熒光法可用于多組分多環芳烴的同時測定、藥物分析、蛋白質、氨基酸測定等。

將導數技術與同步熒光技術聯用可使測定的靈敏度提高。如用導數同步熒光法可直接測定尿樣中的洛美沙星、3種B族維生素、尿液腎上腺素和去甲腎上腺素等。

（2）恒能量同步熒光分析法

恒能量同步熒光法是在同時掃描激發波長λ_ex和發射波長λ_em的過程中保持兩者為一個恒定的能量差（波數差）。該法以熒光體的量子振動躍遷的特征能量為依據來進行同步掃描，若選擇一固定能量差Δν等于某一振動能量差，則在同步掃描中，當激發能量和發射能量剛好匹配一特定吸收-發射躍遷條件時，該躍遷處于最佳條件，由此產生的同步光譜可達最大強度。

圖2-9為Δν=1400cm^-1時蒽的恒能量同步熒光光譜。

恒能量同步熒光法的光譜可以定量形式來表達并用來選擇掃描參數，從而為體系的參數優化提供便利。它除了具有恒波長同步熒光法的一般優點外，還具有一個顯著的優點是可根本解決拉曼散射的干擾問題。如該法可用于多種多環芳烴的測定，絕對檢測限達7×10^-13g，線性動態范圍達5個數量級。

（3）可變角同步熒光分析法

可變角（或可變波長）同步熒光法是在測量同步光譜時，使激發、發射兩個單色器以不同的速率或方向同時掃描。該方法可分為線性與非線性兩類。線性可變角同步熒光法的掃描路徑表現在等高線圖中為一條不為45°的直線；而非線性可變角同步熒光法其掃描路徑表現在等高線圖中為折線或任意曲線。非線性可變角同步熒光掃描時，要求激發、發射兩個單色器能以不同的速率和不同的方向進行掃描。該方法能使掃描路徑方便地有選擇性地通過各點，因而獲得極佳的光譜分辨。

圖2-10是苯并［a］芘的熒光等高線光譜示意圖，圖中每條等高線上的各個點具有相等的熒光強度。該圖的垂直剖面（即固定激發波長）相當于發射光譜，水平剖面（即固定發射波長）相當于激發光譜。

（4）恒基體同步熒光分析法

恒基體同步熒光法是1994年由Murillo-Pulgarin等提出的。它可看成是非線性可變角同步熒光法的一種，其掃描路徑在等高線圖中表現為一曲線，但該曲線是基體（將干擾物視為基體）的等熒光強度線。該方法一般與導數技術聯用，沿著等高線掃描，再結合導數技術就可以消除基體的干擾。

恒基體同步熒光法的基本原理是：在等高線圖上把基體的熒光強度相等的各點連接起來形成等高線（等熒光強度線），沿著基體的等高線掃描，則在整個掃描過程中基體的熒光強度相等。由于整個掃描過程基體的熒光強度一致，當結合導數技術微分后，基體的導數信號為零。在混合物中沿著測定路徑（干擾物或基體的等高線）掃描時所得的信號通常是混合物的總的熒光信號，既包括待測物的信號，又包括干擾物（基體）的信號。但由于是沿干擾物（基體）的等高線掃描，熒光信號求導后，就消除了干擾物（基體）的干擾，掃描所得的導數信號則是被測物的凈信號。

圖2-11為恒基體同步熒光法的原理示意圖。

2.1.4.3　熒光分析的靈敏度和選擇性

熒光法的靈敏度比光度法高2～3個數量級。試樣濃度低時，由于光度法測定時吸光度A=lg（I₀/I），其中I與I₀都較大，其微小差別很難準確測量。而熒光法測量的是純信號（熒光猝滅法除外），只要能扣除背景值就能通過提高儀器放大倍數來提高靈敏度，增強I₀也可。熒光分析法的第二個特點是選擇性好，體現在不同的物質可以選擇不同波長的光進行激發，同時不同的物質發射的熒光波長不同，因此比較容易排除其他物質的干擾。

2.1.4.4　熒光分析法的應用

（1）無機化合物的熒光分析

由于自身發射熒光的無機化合物種類極少，因此往往利用含π電子共軛結構的有機試劑與熒光較弱或不顯熒光的無機化合物共價或非共價結合形成有熒光的化合物來進行測定。與有機試劑形成配合物后進行熒光分析的元素已達到六十余種，很多無機陽離子和陰離子的測定都用此方法。如Al、Au、B、Be、Ca、Cd、Cu、Eu、Ga、Ge、Hf、Mg、Nb、Pb、Rh、Ru、S、Se、Sn、Si、Ta、Th、Te、W、Zn、Zr　等。

某些元素雖不與有機試劑組成發出熒光的配合物，但這些元素的離子可以從發出熒光的其他金屬有機配合物中取代有機試劑或金屬離子以組成更為穩定的配合物或難溶化合物，從而導致溶液熒光強度降低，由熒光降低的程度來測定該元素的含量。采用熒光猝滅（熄滅）法進行測定的元素有F、S、Fe、Co、Ni等。Cr、Nb、U、Te等元素可在液氮溫度（-196℃），用低溫熒光法進行分析。此外，銅、鈹、鐵、鈷、鋨及過氧化氫，可采用催化熒光猝滅（熄滅）法進行測定。

表2-3和表2-4列出了一些無機離子和有機化合物的熒光測定方法。

（2）有機化合物的熒光分析

脂肪族有機化合物分子結構較為簡單，本身能產生熒光的很少，只有與其他有機試劑作用后才可產生熒光。芳香族化合物因具有共軛不飽和體系，多能產生熒光，可用熒光法直接進行分析。這些物質包括有機化合物類（如多環胺類、萘酚類、吲哚類、多環芳烴、氨基酸、蛋白質等）、藥物（如嗎啡、喹啉類、異喹啉類、麥角堿、麻黃堿等）、維生素（如維生素A、維生素B₁、維生素B₂、維生素B₆、維生素B₁₂、維生素E、維生素C、葉酸等）、甾族化合物、抗生素、酶、輔酶等。

此外，還可將待測有機物與熒光試劑反應，生成有熒光或強熒光的產物進行分析。常見的熒光試劑有熒光胺，用于脂肪族或芳香族伯胺類分析；鄰苯二甲醛和茚三酮，用于伯胺類及大多數氨基酸分析；間苯二酚，用于醛糖的熒光分析。

（3）核酸檢測

遺傳物質如脫氧核糖核酸（DNA），自身的熒光效率很低，一般條件下幾乎檢測不到DNA的熒光。因此，常選用某些熒光分子作為探針，通過探針標記分子的熒光變化來研究DNA與小分子及藥物的作用機理，從而探討致病原因及篩選和設計新的高效低毒藥物。目前，典型的熒光探針分子為溴化乙錠（EB）。此外也使用釕的配合物等。在基因檢測方面，已逐步使用熒光染料作為標記物來代替同位素標記，從而克服了同位素標記物產生的污染、價格昂貴及難保存等的不足。

要求DNA標記所用的熒光染料吸收光譜應盡量靠近可見光發射光譜的紅光區，避免DNA自身的藍色熒光干擾，且熒光強度足夠大；對于DNA測序中所用的標記熒光染料，應該不影響DNA片段在電場中的泳動。

目前用于DNA序列的熒光染料主要是呫噸類和菁類化合物，熒光多為黃、綠、紅色，熒光量子產率較高。

呫噸（xanthene）類熒光染料主要是熒光素和羅丹明類的染料。菁類熒光染料為近紅外吸收的熒光染料，用于半導體激光器激發，近年來頗受人們的關注。許多菁類熒光染料符合這個要求。菁類熒光染料的水溶性較好，與DNA作用的條件緩和，DNA與染料的結合物穩定性好，而且能很好地抑制由于染料分子聚集而引起的熒光猝滅現象。

用于DNA檢測的其他類型熒光染料還有多種。1，8-萘酰亞胺類染料能與DNA相互作用，是一種DNA嵌入劑，穩定性好，量子產率較高，是很有用的生物標記物。1，8-萘酰亞胺類染料作為熒光探針標記已被廣泛使用。二氟化硼二吡咯烷（BODIPY）類染料是電中性的，又具有親脂性，很容易溶解在非極性溶劑和細胞膜中。BODIPY比其他熒光化合物有更高的吸收強度和熒光產率，本身還有很深的顏色。

（4）識別分子對蛋白質的影響

近幾年隨著藥學的飛速發展，研究藥物分子和蛋白質的相互作用機理對于了解藥效和毒副作用是非常重要的，利用同步熒光光譜技術可以檢測蛋白質中發內源熒光的氨基酸殘基所處微環境的變化，考察藥物分子對蛋白質構象的影響。