第六節　轉錄因子阻斷劑

轉錄因子（transcription factor）是起正調控作用的反式作用因子，是轉錄起始過程中RNA聚合酶所需的輔助因子。只有當轉錄因子識別DNA上的特定序列并與之結合，才能啟動特定基因的轉錄。目前研究認為，轉錄因子在人體各種應答調節機制中廣泛存在，也廣泛參與人類疾病的發生發展過程，因而也就成為疾病治療的關鍵靶點之一。

一、NFAT阻斷劑

活化T細胞的核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）是一類參與T細胞活化、細胞因子（如IL-2、IL-4、IFN-γ等）分泌、細胞表面分子（如CD40L等）表達的轉錄因子，對于機體的免疫應答至關重要。靜息狀態下，NFAT存在于胞漿內，被NFAT激酶磷酸化，處于無活性狀態。當細胞表面受體接收到活化信號，導致PLC-γ活化，PLC-γ催化PIP2分解產生IP3。IP3促進鈣庫中的鈣釋放，進而打開胞膜上的鈣通道，使胞內鈣濃度升高。鈣與CaM結合，激活鈣調磷酸酶-CaN，可使NFAT去磷酸化，進而進入細胞核，啟動基因轉錄。目前已知的NFAT家族的5個成員包括：NFAT1、NFAT2、NFAT3、NFAT4和NFAT5，其中NFAT1-4已明確接受CaN的調節，NFAT1、NFAT2和NFAT4表達于淋巴細胞內，對于淋巴細胞的功能調節是至關重要的。

傳統的免疫抑制劑如環孢素（CsA）和FK506可作用于NFAT的上游分子CaN，通過抑制CaN的活性，阻斷NFAT去磷酸化與活化。CsA的擬似物ISA247是一種新型免疫抑制劑，與CsA作用原理相同，但比CsA的抑制活性更高，毒副作用更小。ISA247治療銀屑病的Ⅱ期和Ⅲ期臨床試驗結果顯示，該藥對于慢性中重度銀屑病患者具有良好的治療效果，毒副作用小，有助于提高患者生存質量。Erdmann F等從眾多2，6-雙取代-嘧啶衍生物中，篩選得到了新型的CaN抑制劑CN585（圖1-15A）。CN585可抑制CaN活性，抑制NFAT活化，抑制T細胞的活化與細胞因子的分泌。CN585可能成為治療自身免疫性疾病的新方法。

圖1-15　NFAT阻斷肽

A.CN585；B.RCAN1；C.NFAT

阻斷CaN與NFAT結合的分子歷來是免疫抑制劑研究的重點。近幾年的研究表明，體內存在著多種內源性CaN抑制因子，包括CaN調節蛋白（RCAN）家族，它們能在生理條件下與CaN相互作用，抑制其磷酸酶活性。人類體內目前已知的RCAN包括三個成員：RCAN1、RCAN2、RCAN3。RCAN1具有兩個CaN結合區域：CIC（Calcipressin的CaN抑制子）和PxIxIT（圖1-15B）。與之不同的是，RCAN3與CaN的結合僅通過CIC區域完成。盡管RCAN蛋白可能具有以上兩個CaN結合區域，但是對于T細胞而言，只有CIC區域負責抑制CaN與NFAT的結合及T細胞的活化，且該CIC區域具有如下保守序列：LGPGEKYELHA（G/A）T（D/E）（S/T）TPSVVV HVC（E/D）S。依據RCAN蛋白CIC保守序列，Mulero MC等合成了一系列的多肽，其中包括RCAN1198-218和RCAN3183-203，氨基酸序列分別為KYELHAATDTTPSVVVHVCES和KYELHAGTEST PSVVVHVCES。實驗表明，兩個多肽均可與CaN的A亞基（CnA）高親和力結合，抑制NFAT與啟動子的結合，發揮免疫抑制活性。但出乎意料的是，RCAN1198-218和RCAN3183-203卻不能抑制CaN的磷酸酶活性，這可能是因為兩個多肽與CnA的結合位點并非其活性部位，它們可通過其他特殊的機制抑制CaN-NFAT信號傳導。

每個NFAT分子的C端或N段都有兩個或更多的剪接體和一個保守的中間核心區域。核心區域內包括兩個保守的串聯結構域，一個調節結構域（又稱NFAT同源結構域，NHR）和一個DNA結合結構域。NFAT調節結構域的C段和N段分別具有一個CaN結合區域，是NFAT功能調節的關鍵部位。N端的CaN結合區域包含一個保守的氨基酸序列PxIxIT（圖1-15C），其中x可謂任意氨基酸。根據此保守區域合成的多肽VIVIT（氨基酸序列：MAGPHPVIVITGPHEE）可抑制NFAT與CaN的相互作用，抑制NFAT的去磷酸化和抑制T細胞NFAT依賴的基因轉錄，如IL-2、IL-13、TNFα等。11R-VIVIT是VIVIT的衍生物，它在VIVIT的C端加上了11個精氨酸殘基，以輔助VIVIT進入真核細胞。最近研究表明，11R-VIVIT能夠通過抑制NFAT活化，治療壓力誘導的心臟肥大。

除了PxIxIT保守序列外，NFAT調節結構域-C端有另一個CaN結合位點，具有LxVP的保守序列。Martínez-Martínez S等人根據人類NFAT1、NFAT2、NFAT3、NFAT4的LxVP基序合成了一組多肽，結構依次為：DQYLAVPQHPYQWAK、ESILLVPPTWPKPLV、 DQFLSVPSPFTWSKP、 MDYLAVPSPLAWSKA，依次命名為LxVPc1、LxVPc2、LxVPc3、LxVPc4。同時合成了包含NFAT1、NFAT2、NFAT3、NFAT4的Px-IxIT基序的一組多肽。試驗結果顯示，LxVPc1、Lx-VPc3、LxVPc4能取代NFAT與CaN的結合，其活性強于相應的PxIxIT肽，其中LxVPc1可抑制NFAT1和NFAT2兩種蛋白與CaN的結合，抑制CaN的催化活性及NFAT的轉錄活性。出乎意料的是，同樣具有LxVP基序的LxVPc2并不能與CaN結合。其原因可能是與LxVP基序中的Leu相連的第三位氨基酸為芳香族氨基酸（Phe和Tyr），對于此類多肽與CaN的結合是很重要的，LxVPc1、LxVPc3、LxVPc4中該位置均為芳香族氨基酸（Phe或Tyr），只有Lx-VPc2為Ile。此外，只有LxVPc2中與LxVP基序Pro相連的8位氨基酸是Pro，這種連續的Pro可能干擾了多肽與CaN的結合。在LxVPc1中，13位的Trp也是不可取代的，若發生W13A的突變則多肽活性消失。因此，若將LxVPc2中的氨基酸作I3Y或P13W的突變，其與CaN的結合能力上升，若同時進行雙突變，則活性更高。

二、FoxP3抑制劑

CD4+CD25+調節性T細胞（T regulatory cell，Treg）是體內具有免疫抑制活性的T細胞亞群，可通過直接接觸、分泌細胞因子等方式抑制多種免疫細胞如DC、T細胞、B細胞等的功能。Foxp3對于CD4+CD25+調節性T細胞的發育及功能是至關重要的，Foxp3缺乏的小鼠不能產生CD4+CD25+Treg細胞，且易患頭屑狀炎性疾病，而將正常CD4+CD25+Treg細胞轉移至Foxp3缺乏的小鼠可以預防這種疾病。Casares N等研究者利用GST融合蛋白釣取的方法，從噬菌體展示多肽庫中篩選得到了一個能與Foxp3結合的多肽P60（RDFQSFRKMWPFFAM）。P60可進入細胞抑制Foxp3向核內轉移，降低其抑制NFκB和NFAT功能的能力，抑制Treg的免疫調節功能。此外，P60還可抑制T效應細胞Foxp3和Il-10mRNA的轉錄，促進CD3單克隆抗體誘導的IFN-γ的轉錄，促進效應T細胞的活化。體內注射P60可增強腫瘤肽類疫苗的生物活性，增強其誘導的抗腫瘤免疫應答。該多肽將來有可能成為腫瘤的輔助方法之一。