第七節　共刺激分子阻斷劑

共刺激分子是免疫細胞活化第二信號的提供者，對于免疫應答的發生是至關重要的。根據共刺激分子的結構可分為兩類：①TNF-TNFR超家族，包括CD27-CD27L、CD30-CD30L、CD40-CD40L、OX40-OX40L、4-1BB-4-1BBL、RANK-RANKL、TNFR-TNF、HVEM-LIGHT、Fas-FasL等；②免疫球蛋白超家族（immunoglobulin superfamily，IGSF），由三大類分子組成。CD28/B7家族：CD28-B7-1/B7-2、CTLA4-B7-1/B7-2、PD-1/PD-L1/PD-L2、ICOS-GL50、BTLA-HVEM；Tim家族：Tim1-4；黏附分子LFA-1/ICAM-1、CD2-LFA-2等。

一、CD28阻斷劑

目前最成功的共刺激分子阻斷劑是針對CD28共刺激信號的。Abatacept是CTLA-4細胞外區與修飾的IgG1Fc段的融合蛋白，可以阻斷CD80/86與CD28的結合，從而干擾細胞激活所需要的第2信號的傳導，導致T細胞對所遞呈抗原的耐受。目前該藥已完成用于類風濕關節炎Ⅲ期臨床試驗和治療牛皮癬性關節炎的Ⅱ期臨床試驗。盡管Abatacept在自身免疫病的治療方面作用顯著，但是對于移植排斥反應的抑制效果甚微，因此研究者表達了另一種CTLA阻斷劑Belatacept（LEA29Y），它是將Abatacept的兩個氨基酸殘基置換后的產物（L104E和A29Y）。Belatacept與Abatacept相比，與CD80和CD86的結合更為牢固，解離速率降低，藥物的體外活性提高了10倍，且能有效抑制移植排斥反應。目前該藥已完成治療器官移植的Ⅲ期臨床試驗。

二、CD154阻斷劑

B細胞的活化也需要雙信號刺激，抗原B表位與BCR結合提供第一信號，B細胞作為APC將抗原T表位呈遞給T細胞，活化的T細胞表達CD40L（CD154），與B細胞表面的CD40結合，為B細胞的活化提供協同刺激信號。CD154與CD40的結合對于B細胞的活化、增殖、分化及免疫球蛋白的產生、免疫球蛋白亞型轉換及記憶性B細胞的發育成熟具有重要意義，同時也為T細胞的活化提供協同刺激信號。研究證實，CD154-CD40在多種炎癥過程中發揮作用，無論是動脈粥樣硬化還是自身免疫性疾病，阻斷CD154-CD40之間的反應可能是治療上述疾病的重要途徑。

Deambrosis I等從噬菌體展示文庫中篩選到了9個環肽，它們能夠和小鼠骨髓瘤細胞J558L過表達的CD154結合，然而只有環7肽4.10（CLPTRHMAC）能夠識別CD154的活化結合位點，其效果與CD154單克隆抗體相當，改變4.10肽的氨基酸組成則該作用消失。4.10肽可抑制CD40介導的B細胞活化，降低B細胞CD80/86的表達水平，抑制IL-4引起的B細胞IgG的類型轉換，此外，該CD154阻斷肽還可抑制體外上皮細胞的移動及形成毛細血管樣結構，抑制人臍帶血來源的上皮細胞體內的血管生成能力。

三、BTLA/HVEM/LIGHT阻斷劑

皰疹病毒入侵介質（HSV-I entry mediator，HVEM）又稱LIGHTR，是TNFR-TNF家族中的一員，它可作為CD28/B7家族成員B、T淋巴細胞衰減因子（B and T lymphocyte attenuator，BTLA）的配體，傳到BTLA的抑制信號，負性調節T細胞的活化增殖，亦可作為本家族中LIGHT的受體，傳遞刺激T細胞活化增值的正性調節信號。因此BTLA/HVEM/LIGHT形成了一個精確調節T細胞活性的網絡，同時也為免疫活性藥物的開發提供了新靶點。

能夠表達BTLA胞外區片段的pcDNA3.1在真核表達體系體內注射，可表達可溶性BTLA胞外片段，競爭性結合HVEM，阻斷BTLA的免疫抑制信號，提高機體免疫應答程度，加強Hsp-70肽類腫瘤疫苗的抗腫瘤效果。Han L等構建了表達可溶性BTLA的真核表達載體，與Hsp-70抗原肽、Hsp-70肽類腫瘤疫苗協同作用，增強小鼠的抗腫瘤免疫應答，對宮頸癌具有明顯的抑制功能。Gurka S等開發了一系列BTLA特異性抗體，得到了抗體的F（ab）2段，篩選出能夠特異性封閉BTLA的抗體，可用于BTLA-HVEM相互作用的體內研究，也可能對機體免疫應答具有調節作用。

LIGHT除了與HVEM結合外，還可與另一受體淋巴毒素（lymphotoxin，LT）β受體LTβR結合，傳遞免疫激活信號和促進炎癥反應。LTβR與免疫球蛋白的可溶性融合蛋白LTβR-Ig可以阻斷LIGHT與LTβR的相互作用，抑制炎癥反應，改善CIA小鼠的癥狀。但是HVEM與免疫球蛋白的融合蛋白HVEM-Ig卻發揮相反的作用。Pierer M等試圖用HVEM-Ig治療CIA小鼠模型，但結果顯示，HVEM-Ig能夠促進小鼠T細胞活化，促進IL-6和IFN-γ的分泌，加重小鼠病情。

四、ICOS阻斷劑

誘導性協同刺激分子（inducible co-stimulator，ICOS）是CD28家族中的成員，與CD28組成型表達不同，該分子只誘導性表達于活化的T細胞，主要是Th2細胞而非Th1細胞。天然T細胞主要依賴CD28分子提供協同刺激信號，ICOS則在CD28之后發揮作用，促進活化的T細胞分泌細胞因子，如IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ等。ISCO可上調CD154的表達，促進T細胞增殖。ICOS還通過促進IL-10的分泌，對B細胞向記憶性B細胞和漿細胞的分化以及免疫球蛋白的分泌具有促進作用。

近年來發展的ICOS阻斷性抗體，如人類全長型的抗體JTA-009、小分子類抗體B7RP-1-Fc和其他ICOSL特異性單抗，可封閉ICOS的作用，抑制小鼠急性抑制物抗宿主反應及抑制排斥反應，抑制CIA小鼠多功能Th1/Th17細胞的聚集，減輕CIA的病理損傷程度。利用ICOS與Ig的融合蛋白ICOS-Ig亦可阻斷ICOS的作用，抑制T細胞的功能。

五、PD-1阻斷劑

PD-1/PD-L1作為免疫球蛋白超家族協同刺激分子的重要成員，參與自身免疫、移植免疫以及腫瘤免疫等機體免疫調節過程。PD-1是一個主要表達在活化T細胞上的抑制性受體，與其配體PD-L1結合，可顯著抑制T細胞的活化和增殖，并調節細胞因子的表達和分泌。PD-1的阻斷性抗體可能提高機體免疫應答水平，與腫瘤疫苗合用可提高機體抗腫瘤免疫應答強度。Sakuishi K等研究發現，荷瘤小鼠的CD8+腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）高表達Tim3，而所有Tim3+的TIL均有PD-1+。Tim3+PD-1+的TIL免疫功能低下，對IL-2的反應性低，加之腫瘤細胞高表達Tim3和PD-1的配體（galectin-9和PD-1L），造成Tim3+PD-1+的TIL不能有效發揮抗腫瘤作用。用抗Tim3抗體和抗PD-1L抗體處理，可增強荷瘤小鼠免疫應答，抑制腫瘤生長，延長小鼠生存時間。

六、ICAM-1/LFA-1阻斷劑

細胞間黏附分子-1（ICAM-1）屬于免疫球蛋白超家族的黏附分子，正常狀態下，內皮細胞鮮有表達，但當內皮細胞受到炎性細胞因子（如TNFα和IL-1β）刺激后，可呈現高表達。ICAM-1通過與其配體LFA-1識別，介導白細胞的黏附和浸潤。此外，ICAM-1/LFA-1也是一對重要的共刺激分子，參與T細胞活化過程中的免疫突觸形成并提供協同刺激信號。鑒于ICAM-1/LFA-1對于免疫系統的重要作用，研究者合成了多種抑制分子來阻斷兩者之間的相互作用，這些分子主要包括兩類：單克隆抗體和肽類抑制劑。

LFA-1是β2組整合素的成員，由CD11a/CD18組成。Efalizumab是一種人源化抗CD11a單克隆抗體，目前已經用于多種自身免疫性疾病的治療。最近研究發現，可抑制同種異基因淋巴細胞或抗CD3單抗誘導的正常人外周血單個和細胞的增殖，同時對牛皮癬患者外周血單個核細胞也有同樣的抑制活性。最近，Efalizumab治療牛皮癬的臨床試驗陸續完成，其中包括一項有1255例患者入組的Ⅲ/Ⅳ期臨床試驗，結果再次證明Efalizumab對于牛皮癬具有顯著療效。Turgeon NA和Posselt AM的臨床實驗結果表明，Efalizumab能夠有效抑制1型糖尿病患者胰島細胞移植后的免疫應答，顯著增加胰島細胞抑制成功率，幫助患者擺脫對胰島素的依賴。此外，用Efalizumab治療的患者未出現白細胞減少、貧血、口腔潰瘍和腹瀉等不良反應，與傳統免疫抑制方案相比，Efalizumab的毒副作用輕微。

cIBC和cIBR是來源于ICAM-1N段D1結構域的環十二肽cIBC和cIBR（圖1-16），可有效抑制T細胞的黏附。cIBC和cIBR均具有PRGG基序，該基序處于一個β片層二級結構中，并且具有和ICAM-1 D1結構域中A’和B-β鏈之間的β轉角相似的結構，這是它們能與LFA-1結合的關鍵。cIBC和cIBR與LFA-1結合的位點不同，前者與LFA-1Ⅰ區域的266～272氨基酸殘基結合，該區域點靠近金屬離子依賴的黏附位點，而cIBR可與一個叫作L-site的口袋結合，遠離cIBC的結合部位。cIBR可抑制cIBC與LFA-1的結合，但反過來cIBC不能抑制cIBR的作用，可見cIBR具有多個LFA-1結合位點。

2008年，Iskandarsyah等對cIBR進行了一系列改進，期望得到活性更高、分子量更小的ICAM-1/LFA-1阻斷肽。改進主要集中在以下三個方面：①用Cys替代N端的Pen；②采用新的成環方法，如用Lys側鏈與Glu側鏈環化取代原來的Pen和Cys環化；③去掉C端的某些氨基酸已得到更小環肽。由此得到的一系列環肽（表1-1）。

實驗結果證實，用C替換cIBR第一位的氨基酸殘基Pen得到的cIBR-1，其抑制T細胞黏附的活性與cIBR相似，但用D-Arg替換三位氨基酸殘基R（cIBR-1），則活性明顯升高。分別用K和E替換1和12位氨基酸，并改變成環方式，得到了cIBR-3。cIBR-3顯示出較強的生物學活性，甚至超過其母體cIBR。cIBR-4是在cIBR-1的基礎上加入了Leu殘基，而cIBR-5、cIBR-6、cIBR-7則是在cIBR-1的基礎上去掉了C端的某些氨基酸。cIBR-4抑制T細胞黏附的活性強于cIBR-1，cIBR-7的活性強于cIBR-1、cIBR-6，與cIBR-3、cIBR-4相當。2009年，Bimo AT等正式報道了cIBR-7，在cIBR的結構基礎上合成的寡肽cyclo（1，8）-CPRGGSVC。cyclo（1，8）-CPRGGSVC保留了關鍵基序PRGG，去除了C端的幾個氨基酸，與其母體cIBR相比，不但活性稍有提高，而且減小了體積，降低了疏水性，以便于利用疏水性藥物為載體進行投遞。