第三節　肝癌微環境的分子病理學檢測

在肝癌微環境中,肝癌細胞不僅與基質細胞發生相互作用,還可與細胞外基質成分相互作用,從而影響肝癌的生長和轉移,在這過程中有許多肝癌微環境相關分子參與,如缺氧誘導因子、膜離子轉運體、炎癥因子、生長因子和蛋白水解酶等。 因此,應用分子生物學等技術檢測這些肝癌微環境相關分子的變化有助于肝癌的臨床診斷與預后判斷。

一、肝癌微環境的分子病理學檢測技術

目前,應用于腫瘤微環境研究的分子病理學檢測技術主要包括有芯片技術、聚合酶鏈反應、原位雜交、免疫組織化學技術、ELISA、組織低氧檢測技術及組織pH 成像技術等。

(一)芯片技術

芯片技術包括有基因芯片、蛋白芯片及組織芯片等技術。

基因芯片(gene chip)也稱DNA 芯片、微陣列(microarray)或生物芯片(biochip)。 基因芯片主要用于檢測細胞全部基因在特定時刻的表達譜。 通過將腫瘤細胞總mRNA 反轉錄為cDNA 再雜交到具有不同基因探針的DNA 芯片上,就可得到不同基因在不同條件(如腫瘤低氧或低pH 等)下的表達情況。該方法可用于發現與肝癌微環境相關的特定類型基因,并可應用于肝癌臨床診斷等。

蛋白質芯片技術是一種新型蛋白質分析技術,它在很小的固相支持物(載體)表面固定大量蛋白探針(可以是抗原、抗體、受體、配體、酶或底物等),形成高密度排列的蛋白質點陣,將生物分子的特異結合性和高分辨光學成像技術相結合,僅需微量樣品,即可以同時檢測不同的生物分子和目標分子間的相互作用。 它能直接測量血漿等樣品,可應用于高通量檢測與肝癌微環境相關的分泌蛋白等。

組織芯片技術(tissue microarray)是將數十個甚至數千個不同個體組織標本集成在一張固相載體上所形成的組織微陣列,是DNA 芯片技術的發展和延伸。 通過組織芯片與基因芯片和蛋白芯片的有機結合,對肝癌微環境相關新基因的發現及蛋白質表達譜等的研究均有著重要的作用。

(二)聚合酶鏈反應

聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)是一種將特定DNA 片段在體外快速擴增的方法。該方法操作簡便,在數小時內可使幾個拷貝模板序列甚至一個DNA 分子擴增至107～108 倍。 近年來,在經典PCR 技術基礎上又發展起了定量PCR 及原位PCR 等技術。 應用定量PCR 等技術可研究不同條件下肝癌微環境相關特定基因的表達變化情況。

(三)原位雜交

原位雜交技術(in situ hybridization,ISH)是分子生物學、組織化學及細胞學相結合而產生的一門技術,其基本原理是將放射性或非放射性的外源核酸分子(即探針)與染色體、細胞或組織上待測DNA或RNA 互補配對,結合特定的核酸分子,經一定的檢測手段將待測核酸在染色體、細胞或組織上的位置顯示出來。 該技術包括有基因組原位雜交(genome in situ hybridization,GISH)、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)及原位PCR 等。

(四)免疫組織化學技術

免疫組織化學(immunohistochemistry,IHC)是利用抗體與抗原特異性結合的特性,通過化學反應使標記抗體的顯色劑(如熒光素、酶、金屬離子、核素等)顯色,對組織細胞內抗原進行定位、定性及定量研究。 可應用該技術對特定微環境相關分子在肝癌組織的定位及表達情況進行分析。

(五)ELISA

酶聯免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)簡稱酶聯免疫法或ELISA法,它的基本原理是利用抗體與抗原特異性結合的特性,檢測時加入酶標記的抗體或抗原分子,進一步通過與酶底物反應顯色來間接檢測目標分子的表達量。 該方法可應用于檢測肝癌微環境中的分泌蛋白、細胞因子等,在臨床診斷及預后監測中起重要作用。

(六)腫瘤組織低氧檢測技術

測定實體瘤內的氧壓力對判斷患者預后有較高的臨床應用價值。 其測定方法包括有體內氧電極測定法、生物還原藥物(如硝基咪唑類等)測定法及放射自顯影技術等,其中利用放射性核素18F、62Cu、123I等標記的缺氧組織顯影劑進行SPECT(single-photon emission computed tomography)或PET(positron emission computed tomography)顯影技術可對腫瘤組織內低氧情況進行定性和定量檢測,是目前檢測腫瘤內低氧狀態較成熟的技術。 此外,也可通過檢測低氧細胞內源性標志物(如HIF-1α 等)來間接反映腫瘤組織的缺氧情況等。

(七)組織pH 成像技術

該方法是將磁共振成像(MRI)與碳-13 標記的碳酸氫鹽靜脈注射聯合使用,從而測定體內組織pH。 在碳酸酐酶的催化作用下,碳酸氫鹽可與二氧化碳反應影響組織pH 值,根據Henderson-Hasselbalch 方程,標記的碳酸氫鹽與二氧化碳的比例可用來計算pH 值。

二、肝癌微環境相關分子

(一)肝癌低氧微環境相關分子

細胞缺氧引起的主要結果之一是缺氧誘導因子(hypoxia inducible factors,HIFs)的穩定性增加。 腫瘤微環境缺氧可使腫瘤細胞中HIFs 穩定性增加,HIFs 主要通過與糖酵解、血管新生、細胞增殖及轉移等相關基因調控區域的缺氧反應元件(HREs)相結合,調控這些基因的表達,從而引起腫瘤細胞存活、黏附、遷移及侵襲能力的改變。 研究表明HIF-1α 在肝癌組織中的表達高于癌旁組織,且其表達水平與肝癌預后呈負相關。 缺氧時,HIF-1 可誘導血管內皮生長因子(VEGF)的表達,促進腫瘤血管新生和腫瘤生長。 同時,缺氧可影響轉移相關的關鍵基因,從而促進腫瘤細胞發生轉移,例如HIF-1 可通過上調Snail 等E-cadherin 抑制因子,從而下調E-cadherin 表達而促進腫瘤細胞轉移。 此外,缺氧可通過誘導己糖激酶Ⅱ等代謝相關基因的表達,從而刺激肝癌細胞的生長。

(二)肝癌酸性微環境相關分子

腫瘤酸性微環境的形成可能主要與腫瘤細胞缺氧和糖酵解代謝增強有關。 腫瘤細胞主要通過一些膜離子轉運體(如囊泡型H+-ATPase 和Na+/H+交換體等)來維持這種腫瘤酸性微環境。

1.囊泡型H+-ATPase

囊泡型H+-ATPase(Vacuolar H+-ATPase,VHA)普遍存在于真核生物中,是一種由多亞基組成的ATP 酶,包含有V1 和V0 兩個功能域。 V1 位于胞漿,由8 種不同亞基組成(3A、3B、C、D、E、F、2G、H),具有水解ATP 的功能;V0 位于胞膜,由6 種不同亞基組成(a、d、e、c、c′和c″),發揮質子運輸通道作用。 在肝癌中,研究發現V-ATPase 在肝癌組織的表達量明顯高于癌旁組織,且V-ATPase 高表達與肝癌患者預后差密切相關。 體內外實驗發現,應用RNAi 技術下調VHA 表達可抑制腫瘤細胞V-ATPase 活性,降低肝癌細胞的運動和侵襲能力,且能抑制人肝癌細胞移植瘤的生長與轉移。

2.Na+/H+交換體

Na+/H+交換體(Na+/H+exchangers,NHE)是存在于哺乳動物細胞質膜上的離子轉運體。 NHE 蛋白家族共有9 種亞型,命名為NHE1～9,其中NHE1～5 位于細胞膜表面,而NHE6～9 分布于胞內的細胞器表面。 在這些亞型中NHE1 最為重要,其廣泛存在于各種組織細胞。 研究表明,NHE1 在肝癌組織中的表達明顯高于癌旁組織,且NHE1 表達增高與肝癌瘤體增大、血管浸潤及預后差相關。

此外,肝癌細胞還可通過上調碳酸酐酶Ⅸ(carbonic anhydrase Ⅸ,CA-Ⅸ)及單糖轉運體4(monosaccharide transporter 4,MCT4)等來調節內堿外酸的酸性微環境。 有研究發現肝癌組織中MCT4 高表達的患者總生存期及無病生存期明顯縮短。

(三)肝癌炎性微環境相關分子

肝纖維化是肝癌的高風險因素之一,慢性肝損傷引起的炎性環境促進了肝纖維化的進程,并最終導致了肝癌的發生發展。 肝癌的發生發展與炎癥相關因子白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)及腫瘤壞死因子α(TNF-α)等有重要聯系。 IL-6 是一種具有多種生物學功能的炎癥因子,在肝細胞損傷時由肝kupffer 細胞產生,刺激肝細胞代償性增殖。 血清IL-6 濃度在肝纖維化時期即可增高,而肝癌患者血清中IL-6 濃度增高往往提示該患者的預后較差。 由于雌激素可抑制kuppfer 細胞分泌IL-6,因此部分解釋了肝癌的發生存在性別差異。 近期研究顯示,IL-6 與肥胖引起的肝癌密切相關,在肥胖小鼠體內IL-6 與腫瘤壞死因子(TNF)的表達量增高,并通過激活下游STAT3 與ERK 信號通路,從而促進了肝內腫瘤的形成。 TNF-α 同樣也是一種具有多種生物學功能的炎癥因子,主要由kuffper 細胞及其他免疫細胞分泌,通過激活下游NF-κB 及Akt 信號通路在肝再生中發揮重要作用。 類似的,IL-1 通過促進MyD88 接頭蛋白依賴的肝細胞代償性增生參與了肝再生進程。 同時IL-1 也促進了肝星狀細胞的增殖、激活、分化為肌纖維母細胞,此外還刺激肝星狀細胞分泌、激活基質金屬蛋白酶9(MMP9)等多種基質金屬蛋白酶。

(四)肝癌微環境相關分泌性蛋白

1.生長因子　在肝癌微環境中,肝癌細胞可自分泌或通過周圍基質細胞旁分泌一些生長因子如TGF-β、FGFs、HGF、PDGF 及VEGF 等,從而影響肝癌生長與轉移。 其中對TGF-β 在肝癌發生發展中作用的研究較多。 TGF-β1 以非激活形式釋放入細胞外基質,被腫瘤微環境中大量存在的MMP-2 或MMP-9 激活。 激活狀態的TGF-β1 通過與TGF 受體Ⅱ結合,使TGF-βR Ⅰ磷酸化,通過Smad-2 和Smad-3 激活下游信號通路。 TGF-β1 在肝癌組織及周圍基質中表達量增高,并且在肝纖維化及肝癌發生過程中起重要作用。 TGF-β 通常通過抑制細胞增殖、激活凋亡相關信號通路等方式,在癌前狀態起腫瘤抑制因子的作用。 TGF-β1 通過募集周期蛋白依賴性激酶抑制劑實現抑制增殖作用,通過下調抗凋亡蛋白及抑制c-Myc 表達實現促凋亡作用。 TGF-β的腫瘤抑制作用不僅僅針對肝細胞自身,它同樣對腫瘤基質細胞分裂及腫瘤相關炎癥有抑制作用。 但不同情況下,TGF-β1 的腫瘤抑制作用可能轉變為促進腫瘤生長作用。 已有相關研究表明,肝細胞分泌的TGF-β 原本通過磷酸化Smad3 的C 末端發揮抑癌作用,而在HBx 及HCV 激活JNK 信號通路的條件下可轉變為促癌因子,并通過促使Smad3 形成鏈接磷酸化Smad3 發揮作用。 已有研究證實TGF-β1可上調Snail 的表達,降低E-cadherin 的表達,進一步說明了它參與了細胞的上皮間質轉化過程(EMT過程)。 與這些分子水平的結論相符,TGF-β1 在細胞水平表現出促進腫瘤的侵襲、血管浸潤(通過對整合素β1 的修飾及增加整合素α3 的表達)、血管新生(通過產生VEGF)、腫瘤與基質間的對話及轉移(通過增加結締組織生長因子)的作用。 TGF-β1同樣也通過激活PDGF 信號通路促進了EMT 的過程。 TGF-β1 通過調節促癌miRNA 的表達促進了肝癌發展進程。 暴露在TGF-β1 中的肝細胞miR-181b表達量增加,該miRNA 在肝癌中促進了肝癌細胞的增殖、存活、遷徙和轉移。 類似的,TGF-β 還能誘導產生miR-23a、miR-27a 及miR-24,這些miRNA 同樣促進了肝癌細胞的增殖與存活。

除TGF-β 外,PDGF、血管內皮生長因子(VEGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)和肝細胞生長因子(HGF)等其他肝素結合性生長因子在肝癌的發生發展中同樣發揮著重要作用。 PDGF 促進了肝纖維化及細胞增殖,在肝星狀細胞轉變為肌纖維母細胞的過程中發揮重要作用。 Campbell 等研究發現轉基因小鼠肝臟中血小板衍生生長因子C(PDGFC)的過表達可通過激活Erk 和PKB/Akt 信號通路促使肝星狀細胞增殖活化,導致組織纖維化加劇,進而演變為肝細胞癌。 肝細胞癌是一種高血管質的腫瘤,因此血管新生是肝癌發生發展中的關鍵步驟。VEGF 是正常組織及癌組織中調節血管新生的重要因子。 在炎癥環境下,VEGF 因NF-κB 信號通路處于激活狀態而表達量增多。 VEGF 不僅僅在調節血管上皮細胞增殖方面起重要作用,它還能通過下游的Akt/mTOR 通路促進表達VEGF-A 受體的腫瘤細胞的增殖。 FGFs 是一類與組織新生、創傷愈合及血管新生相關的生長因子。 肝癌中FGFs表達異常,并且通過激活下游Erk 和AKT 信號通路促進了血管內皮細胞及癌細胞的增殖。 HGF 是一類表達在肝星狀細胞或肌纖維母細胞的生長因子,研究表明它能通過肌纖維母細胞促進肝癌細胞的增殖與侵襲,進而調節腫瘤與細胞基質的交互作用。

2.基質金屬蛋白酶　基質金屬蛋白酶(MMPs)于19 世紀60 年代首次發現,它是一種鋅依賴的肽鏈內切酶。 MMPs 在炎癥進程中參與了組織的重構及調控過程。 現今已知的人MMPs 總計共23 種,不同的基質環境中的各類腫瘤細胞分泌產生各種不同的MMPs。 MMPs 的主要亞型有以下幾類:①膠原酶(collagenases),如MMP-1、MMP-8、MMP-13;②白明膠酶(gelatinases),MMP-2、MMP-9;③間質溶解酶(matrilysins),MMP-7、MMP-26;④膜型MMPs(membrane type MMPs),MMP-14～17、MMP-24～25;⑤基質溶解素(stromelysins),MMP-3、MMP-10～11。

MMPs 促進了組織重構,炎癥反應,在多種癌癥中促進了腫瘤細胞的生長,侵襲和轉移,并且MMPs作為腫瘤微環境的重要調節因子,在肝癌發生發展中起重要作用。 腫瘤侵襲往往是由于MMPs 蛋白水解酶活性升高,引起細胞外基質降解,促進腫瘤細胞播散而引起的。 近期研究表明MMPs 的作用不僅僅能引起細胞外基質的降解,還能調節腫瘤細胞相關信號通路。 MMP-2,-9 及-14 能激活TGF-β1,后者是肝癌中上皮細胞間質化的關鍵調節因子。 TGF-β1 同時也能反向激活MMPs。 TGF-β1 通過調節MiR-181b 上調MMP-2 與MMP-9 的表達,從而促進肝癌細胞的侵襲轉移。 MMPs 同時也抑制了腫瘤細胞的凋亡。 例如Fas 配體,通常與Fas 受體結合從而啟動凋亡信號,而MMP7 能使其裂解從而阻斷凋亡信號的啟動。 MMP-2、MMP-9 與MMP-14 通過調節血管生成因子(VEGF)促進肝癌的血管新生。MMPs 通過調節炎癥因子及趨化因子參與炎癥反應,促進腫瘤的發展進程。 MMP9 在肝癌中高表達,并且往往與包膜浸潤相關。 同時,MMP-9 還通過促進骨橋蛋白(OPN)前體轉化為活性形式促進肝癌的侵襲轉移。

3.可作為臨床診斷及預后判斷的分泌蛋白甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)是白蛋白家族的一種糖蛋白,在胚胎早期的卵黃囊中高表達,出生后18 個月即降低,在正常人血液中濃度較低,僅5～10g/L,而在肝癌發生時重新升高。 AFP 是現今最常用的肝細胞癌血清學診斷標志物,并且被用于對高危患者的監測篩查。 但相關研究表明,AFP 對肝癌的檢測靈敏度僅25%～65%,在早期肝細胞癌中則更低,并且在其他肝臟疾病,如肝炎及肝硬化中也有不同程度的升高,降低了檢測的特異性。

近期一項大規模臨床多中心試驗結果顯示分泌蛋白DKK1 對肝細胞癌,尤其是早期肝細胞癌具有較好的診斷價值,同時可彌補AFP 對肝細胞癌診斷能力的不足,其在AFP 陰性肝癌患者中仍具有較高的診斷靈敏度。 而DKK1 與AFP 聯合應用,可將肝細胞癌的總體檢出率提高至88%。

隨著各種組學技術和高通量技術的發展,一系列新型可能作為候選肝癌標志物的異常分泌蛋白相繼被發現并研究,如小扁豆凝集素反應性AFP(lectin lens culinaris agglutinin reactive AFP,AFP-L3),異常凝血酶原(des-γ-carboxyprothrombin,DCP),蛋白多糖3(glypican-3,GPC3),高爾基蛋白73(golgi protein 73,GP73),骨橋蛋白(osteopontin,OPN)等。