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  • 中藥藥理學
  • 彭成
  • 3552字
  • 2019-12-27 17:56:13

第三節 中成藥學研究方法

中成藥在我國制藥行業中獨具特色,已成為創新藥物的重要源泉,目前國家已批準上市的中成藥有9000多種,且隨著傳統醫藥在世界范圍內“回歸自然”的呼喚中復蘇,以及在全社會高度重視和發展中醫藥的大背景下,有必要運用現代科學技術,深入開展中成藥的挖掘研究,科學地闡釋中成藥的有效性和安全性。目前中成藥的研究內容非常廣泛,具體研究方法可參考相關章節內容,本章主要從中成藥的物質基礎研究和作用機制研究做一簡單介紹。

一、中成藥的物質基礎研究

中成藥的化學成分是其發揮藥效的物質基礎。目前中成藥藥效物質基礎的研究思路主要有兩種:一是中成藥體外化學成分的研究;二是中成藥體內血清藥物化學的研究。

1.體外化學成分的研究 傳統化學成分分離法是研究中成藥物質基礎最經典的方法。即按植物藥研究思路,將中成藥經過植物化學成分提取、分離、純化、結構鑒定得到的單一化合物,輔以活性篩選確定藥理活性;或者利用已有藥理模型對分離得到的每個部位進行活性追蹤,從而對最終得到的化合物進行結構鑒定。如對當歸龍薈丸治療慢性粒細胞白血病的篩選中,發現其中主要有效藥物是青黛,進一步對青黛進行化學成分分離、活性驗證,發現其有效成分為靛玉紅。

2.體內血清藥物化學的研究 不管中成藥中含有多少種化學成分,但只有進入血液的成分才有可能發揮作用,成為有效成分。中藥血清藥物化學即以中藥給藥后的血清為研究對象,通過先進的分析技術,從血清中分離、鑒定進入血液的移行成分,結合藥理學的研究結果,將入血成分與藥效學指標變化相結合,應用聚類分析、主成分分析、逐步回歸分析等多元統計分析方法,研究血清中移行成分與傳統藥效的相關性,以闡明中藥的藥效物質基礎。例如,利用UPLC-HDMS方法分析大鼠口服生脈散后含藥血清樣品,對比空白血清的成分異同,確定大鼠口服生脈散后的血中移行成分,并利用質譜數據表征血中移行成分的結構,最終分析鑒定了18個血中移行成分,其中5個為代謝產物,13個成分為生脈散的原型成分,血中移行成分及代謝產物可能為生脈散的體內直接或間接作用物質,對其進行深入的研究將有助于闡明生脈散的有效成分及作用機制。

此外,還有學者提出譜-效關系結合法的研究思路。指紋圖譜是基于對中藥物質群整體作用的認識,借助于波譜和色譜等技術獲得中藥化學成分的光譜或色譜圖,是鑒別中藥真實性、評價質量一致性和產品穩定性的可行模式。中成藥指紋圖譜較單一化學成分的質量控制方法,具有信息量大、特征性強、整體性和模糊性等特點。譜-效關系是指將中藥指紋圖譜或特征圖譜中化學成分的變化與其療效變化相結合,研究其相關性,找出與藥效活性相關的藥效物質群。如利用GC-MS建立桃紅四物湯低極性部位指紋圖譜,結合小鼠痛經模型,研究桃紅四物湯抑制小鼠痛經有效部位的譜效關系,結果表明,亞油酸在延長扭體潛伏期和減少扭體次數方面起主要作用,十八碳烯酸、花生酸、二十七烷對鎮痛效果有一定的協同作用。

二、中成藥的作用機制研究

中成藥盡管長期在臨床應用,療效可靠、作用肯定,有扎實的理論與實踐基礎,但其作用機制尚不十分清楚,成為制約中成藥創新發展的主要因素。因此,闡明中成藥的作用機制,已成為目前中成藥研究關注的焦點,目前主要的研究思路有以下幾種。

1.基于整體動物的作用機制研究 采用疾病動物模型、證候動物模型、病證結合動物模型及模式動物等整體動物模型,在研究中成藥主要藥效的基礎上,結合相關疾病的分子生物學基礎,應用分子生物學技術,從分子水平探討中成藥的作用機制。例如,采用氣管內滴注脂多糖(LPS)致小鼠急性肺損傷模型,探討連花清瘟膠囊作用機制。在常規光鏡下觀察肺組織病理形態變化、透射電鏡下觀察肺泡上皮超微結構的基礎上,應用流式細胞術檢測外周血T細胞中TNF-α陽性表達細胞百分率,免疫組化法檢測肺組織間隙連接蛋白43(Cx43)、閉鎖蛋白和閉鎖小帶蛋白(ZO-1)的表達,RT-PCR法檢測肺組織中單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)mRNA表達,免疫印跡法檢測肺組織中中性粒細胞彈性蛋白酶、NF-κB、IκBα、IKKβ的蛋白表達。結果顯示,連花清瘟膠囊可能通過抑制炎癥細胞浸潤,改善肺泡上皮細胞和肺血管內皮細胞連接蛋白的表達,抑制IKK/IκB/NF-κB信號轉導系統,減少炎癥因子的表達等機制緩解LPS所致的急性肺損傷。

2.基于體外實驗的作用機制研究 采用細胞模型,應用基因組學、轉錄組學及蛋白質組學等技術,體外探討中成藥的“多成分、多靶點、多通路”整合調節機制,鑒于中成藥粗制劑中雜質可能對實驗結果的準確性產生影響,近年來,常采用血清藥理學的方法。血清藥理學方法即以含中藥血清為受試物,通常指動物經口給藥后間隔一定的時間采血,分離含中藥血清進行體外實驗。例如,研究心脈通顆粒對原代培養大鼠心肌細胞H2O2損傷的抗氧化作用,應用心脈通含藥血清干預12小時后,再加H2O2致心肌細胞損傷。6小時后檢測心肌細胞形態學的改變,MTT法檢測細胞活性的改變,細胞免疫組織化學法檢測蛋白激酶B(PKB/Akt)的表達,RT-PCR檢測蛋白激酶B(PKB/Akt)和內皮細胞型一氧化氮合酶(e NOS)的基因表達變化。結果顯示,心脈通顆粒能夠增強心肌細胞抗氧化損傷能力,保持細胞的形態和功能,抑制細胞凋亡,其機制可能是通過干預PKB/AKT-e NOS信號傳導途徑實現的。

3.基于網絡生物學的中成藥作用機制研究 2004年Barabasi等提出網絡生物學的概念,認為通過建立網絡模型,可以將復雜生物系統的相互作用抽象表達成網絡,通過分析復雜網絡的成分關系和特性來獲得對生物體活動機制和功能更多的認識。網絡生物學是用生物網絡(包括基因調控網絡、蛋白交互網絡、新陳代謝網絡和信號轉導網絡等)描述研究對象的生物學性質,分析因果關系,認識生命活動規律的科學。

用網絡生物學方法獲取疾病生物網絡的功能模式、網絡模體及潛在的藥物靶點,構建復雜疾病的生物網絡。中成藥通過其含有的多個有效組分同時作用于多個藥物靶點,從不同水平調節疾病信號通路以治療疾病。例如,采用網絡生物學方法,探討復方丹參的多成分-多靶點-多疾病相關性。首先選擇方中丹參酮ⅡA、丹酚酸B、原兒茶醛、丹參素、隱丹參酮、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及龍腦等9個活性成分,從PubMed中檢索出與這些成分相關的所有文獻,經對蛋白與基因信息標準化,獲取與9個活性成分相關的基因信息。然后從人類孟德爾遺傳數據庫中,搜尋與心血管疾病相關的所有基因,用于比對來源于文獻的數據。最后采用Cytoscape軟件建立包括活性成分、基因、疾病3類節點的多成分-基因-疾病網絡模型,通過建立疾病-基因-活性成分、疾病-基因-疾病、活性成分-基因-活性成分、基因-活性成分-基因、基因-疾病-基因5種連接,構建起完整的網絡圖。網絡分析表明,丹參酮ⅡA、丹酚酸B、原兒茶醛、丹參素、隱丹參酮、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及龍腦等9個活性成分可調控PPARG、ACE、KCNJ11、KCNQ1、ABCC8等42個心血管相關疾病基因表達,涉及糖尿病高胰島素型低血糖癥等30種疾病。

4.基于代謝組學的作用機制研究 代謝組學(metabonomics),為生物體在病理生理刺激和遺傳因素改變的條件下,在不同時間、多方位定量檢測其代謝變化,通過測定整個機體的系統代謝圖譜以探討基因功能調控機制的學科。其核心思想在于運用現代分析技術定量地測定生物體在不同狀態下(生理病理狀態、藥物干預前后等)參與物質傳遞、能量代謝和信息傳導等代謝調控的小分子代謝物質即代謝物組的變化,并利用模式識別將這種應答與體內生物學事件相關聯,定位事件發生的靶器官,從而確定生物標記物,表征或揭示生物體在特定時間、環境下整體的功能狀態。

代謝組學動態地對活體內外的非損傷組織、器官進行無損傷、幾乎接近生理條件的分析方法,與中醫的“司外揣內”理論體系相近似,其研究思想與傳統中醫藥強調人與自然協調統一的整體觀及其診療模式不謀而合,可作為中醫藥研究的一種新方法、新途徑。代謝組學其整體、動態、綜合分析的特點,對于揭示中成藥整體調控作用具有獨特的優勢。

代謝組學是繼基因組學、轉錄組學、蛋白質組學后系統生物學的另一重要研究領域。它主要是應用現代分析儀器與分析手段,定性定量研究生物樣品,包括生物體液(如血液、尿等)、細胞提取物、細胞培養液和組織等中的內源性代謝產物,結合模式識別等化學信息學技術,分析生物體在不同狀態下的代謝指紋圖譜的差異,獲得相應的生物標志物群,從而揭示生物體在特定時間、環境下的整體功能狀態。例如,采用代謝組學的方法,研究六味地黃丸干預甲亢陰虛大鼠模型的作用機制。實驗選用SD大鼠皮下注射L-左甲狀腺素鈉350μg/kg建立甲亢陰虛模型,給予六味地黃丸干預3周,同時以正常大鼠作為對照,采用UPLC-QTOF-MS技術對不同組大鼠的血清進行分析。結果顯示,甲亢陰虛大鼠體內三羧酸循環發生障礙,糖、脂質、氨基酸代謝均出現紊亂,小分子代謝物草酰乙酸、磷酸二羥基丙酮、乙基葡糖苷酸、甘油三酯、溶血磷脂、膽固醇等明顯上調,而六味地黃丸干預后,這些物質的水平出現明顯下調,代謝紊亂得到一定的改善。

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