第三節　中藥藥動學研究

中藥藥動學作為中藥藥理學的分支學科，是在探索、實踐的基礎上經過不斷積累和發展逐漸形成的。中藥及其復方由于成分繁多或有效成分不明或缺乏定量檢測手段，且干擾因素多，曾一度認為中藥復方有效成分藥代動力學研究難以進行。由于藥效的變化取決于體內藥量的變化，因此可以通過測定藥效的經時過程來間接反映體內藥量的動態變化。基于此原理，1970年后出現了通過測定生物效應進行藥代動力學研究的方法。1985年后日本學者建立了測定方劑給藥后體內有效成分濃度的方法。近年來這方面的研究十分活躍，有學者提出了“復方效應成分動力學”“中藥復方指征藥物代謝動力學”等概念。歸納起來，中藥藥動學研究主要有以下幾種方法。

一、中藥體內過程研究方法

1.吸收研究方法　中藥大多經口服給藥，胃腸道是主要的吸收途徑，研究胃腸道吸收特性的方法有很多種，包括在體腸回流法、在體腸灌流法、外翻腸囊法、腸襻法、分離腸黏膜法、Caco-2細胞模型法等，這些方法的特點分述如下。

（1）在體腸回流法　主要用于中藥有效成分單體的吸收研究。動物經麻醉后向腸腔插管，用泵循環構成回路，使藥物在腸腔內循環灌流，定時測定流出液中藥物濃度的變化，求出藥物吸收量；同時通過腸系膜靜脈取血樣，測定吸收入血的藥量。該方法可以在不同時間測定灌注液內藥物的濃度變化，獲得藥物透過腸上皮細胞的情況。如對川芎嗪吸收特性的研究結果表明，其在結腸以上部位吸收良好，吸收窗較長，可以減少劑型設計的盲目性。但該方法容易將藥物濃度變化誤認為是藥物吸收，且藥物只能以液態進行實驗，不適合于緩釋、控釋制劑的研究。

（2）在體腸灌流法　本方法和在體腸回流法相似，是目前運用最廣泛的方法，國外采用最多的是單向灌流法，國內比較傾向于使用循環灌流法。該法是一種較好的研究腸吸收的方法。利用該方法不僅可以判斷藥物吸收的方式，還可以求出藥物吸收的動力學參數。

（3）外翻腸囊法　動物麻醉后取出腸段并外翻，置于營養液中，定時在腸管內外兩側取樣。本法是一種簡單有效的初步研究腸吸收的方法，也是用于研究生物膜轉運機制的方法。外翻腸囊法的優點是能觀察藥物透過腸壁的濃度，但無法計算較詳盡的吸收動力學參數，并且腸囊在體外環境與體內環境有較大差異，因此不能僅以該方法判斷藥物的吸收情況。

（4）腸襻法　在體腸回流的基礎上，增加腸系膜血管插管收集血樣品。本方法操作簡單，可分析藥物吸收入血的情況，測定藥物剩余量，但由于腸腔內容物存在，樣品處理較復雜。所以不適合大規模的藥物吸收評價。

（5）分離腸黏膜法　動物麻醉后取出腸管，分離腸黏膜并固定于擴散池上，用于分析藥物透過上皮細胞的情況。該方法由于黏膜易破損，使分離操作困難。但此法干擾因素少，快速準確，精度高，適于進行吸收機制的分析。

（6）Caco-2細胞模型法　本法是1989年提出用于腸吸收研究的體外細胞模型，Caco-2細胞的結構和生化作用類似于人小腸上皮癌細胞，可作為研究小腸表皮細胞藥物轉運和代謝的體外模型，也是目前研究藥物吸收最適合的模型。該方法具有快速、適于大量篩選、易于控制、干擾小、可持續檢測、規律性強、接近腸道環境等優點。但對供試樣品的要求較高，不能代替整體動物實驗。

2.分布研究方法　通過在給藥后的吸收相、平衡相、分布相和消除相測定動物各組織臟器的藥物濃度，可以了解藥物在體內的主要分布組織、濃集組織、蓄積時間長的組織和器官及在藥效或毒性靶器官的分布情況，從而闡明藥物的分布規律。如研究馬錢子體內的分布實驗中，對小白鼠采用灌胃和腹腔注射兩種方法，取不同時間的血液、心、肝、脾、肺、腎、腦、肌肉等組織和器官，采用雙波長紫外分光光度法檢測士的寧的含量，結果表明，組織器官中士的寧的分布首位是心，其次為腎、肺、腦、肝、肌肉、脾，最后為血液。

3.代謝研究方法　中藥在體內所發生的化學變化，常常使藥物滅活，但也有部分是代謝活化或代謝物仍具藥理活性。因此對藥物代謝規律進行研究，有助于提高療效，減少不良反應。研究方法包括體內代謝研究方法和體外代謝研究方法。

（1）體內代謝研究方法　中藥給藥后，可對整體動物的血、尿、糞或膽汁等體液或組織進行分析，一般先用HPLC法，在樣品廣泛的色譜峰中尋找可能的代謝物，再用紫外、紅外、質譜、核磁共振等方法對有效成分的代謝物進行分析，闡明代謝物的結構，推斷可能的代謝途徑。

（2）體外代謝研究方法　與體內代謝研究相比，體外代謝研究有很多優點。一是可以排除體內研究時諸多因素的干擾，直接觀察到代謝酶對底物的選擇性代謝，為體內代謝研究提供依據。二是對于體內代謝轉化率低，且缺乏靈敏檢測方法的藥物來說，體外代謝不失為一種很好的研究手段。三是具有快速簡便的特點，適合于大批量中藥化合物的藥代動力學研究。四是不需要消耗大量的樣品和實驗動物，研究費用相對較低。但體外代謝研究也存在不足之處，如可能與體內代謝情況不完全一致，因此體外代謝研究無法代替體內代謝研究，兩者相輔相成。肝臟是中藥代謝的主要場所，涉及的代謝系統主要是細胞色素（cytochrome，Cyt）P450混合功能氧化酶系統。大多數藥物的Ⅰ相和Ⅱ相代謝反應都是在肝藥酶系統的參與下發生的，因此藥物的體外代謝模型主要是以肝臟為基礎，并以其特有的優勢和特點在藥物代謝的研究中得到廣泛應用。常用的體外肝代謝模型有以下幾種。

肝微粒體體外溫孵法：制備肝微粒體，輔以還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）再生系統，在體外模擬生理環境條件進行代謝反應，經過一定時間反應后，采用HPLC、HPLC-MS和HPLC-MS/MS測定溫孵液中原形藥物和其代謝產物，并對代謝產物進行初步分析和鑒定。該方法主要用于藥物代謝產物的結構鑒定和代謝途徑研究，預測藥物體內代謝清除率、藥物代謝的種屬和性別差異、對藥酶的影響、藥物代謝的相互作用等。與其他體外肝代謝方法相比，具有酶制備技術簡單、代謝過程快、結果重現性好、易于大批量操作、便于收集和積累代謝樣品等特點。但所得結果可能與體內代謝的不一致，一般僅用于預測體內代謝情況，尚需體內代謝研究的進一步證實。

重組P450酶體外溫孵法：該法與肝微粒體體外溫孵法的主要區別在于酶的制備和純度。基因重組P450酶是利用基因工程及細胞工程技術制備得到的純度較單一的P450同工酶。這一方法主要用于鑒別參與藥物代謝的P450同工酶、藥物代謝多態性和藥物代謝的相互作用研究。其最大的特點是通過比較基因重組的人和實驗動物肝臟P450酶對藥物的代謝情況，了解藥物代謝的種屬差異性。

肝細胞體外溫孵法：肝細胞體外溫孵法與肝微粒體法相似，是以制備的肝細胞輔以氧化還原型輔酶，在模擬生理環境條件下進行的代謝反應。在反應過程中定時從反應體系中取樣，監測細胞的活性、藥物及其代謝物的濃度，運用LC-MS和LC-MS/MS對代謝產物進行初步的結構鑒定。該法適用于研究蛋白及mRNA水平藥物代謝酶的誘導和酶的活性，在藥酶誘導研究中占據主導地位。主要不足之處是肝細胞制備技術復雜，且體外肝細胞活性僅能維持4小時，不利于儲存和反復使用。

離體肝灌流法：與肝微粒體法、肝細胞體外溫孵法比較，該法保留著完整細胞的天然屏障和營養液的供給，能在一段時間內保持肝臟的生理生化功能；同時具有離體系統的優點，能夠排除其他器官組織的干擾，可控制受試物質的濃度，定量觀察受試藥物對肝臟的作用。適合于定量研究藥物體外代謝的行為和特點，但其對實驗設備和技術有一定要求，限制了其應用。目前肝灌流主要有兩種形式：循環型和一過型。循環型在體系上更接近體內循環，灌流液需要量也少；一過型可以提供大量的灌流液樣品，能直接評價外來物經肝臟后的損失及穩態下代謝物的生成，易于建立劑量－反應關系。

肝切片法：肝切片不僅完整地保留所有肝藥酶及各種細胞器的活性，而且保留了細胞與細胞間的聯系及一定的細胞間質，因此使用肝切片法比使用游離肝細胞孵育或培養更能反映藥物在體內生理情況下的真實代謝過程，適合于比較不同組織器官的代謝差異和代謝的種屬差異。因具有Ⅰ相和Ⅱ相代謝途徑，故所得結果與體內較接近，且可以在較長的時間內保持代謝活性（可達8～24小時）。其不足之處是需要一些特殊的設備（如切片機）。

4.排泄研究方法　中藥經吸收、分布、代謝后，最終以原形物或代謝物從腎、膽汁、胃腸道等途徑排出體外。故研究內容及方法包括尿和糞便的排泄、膽汗排泄兩部分。

（1）尿和糞便的排泄　中藥腎排泄是體內排泄的最主要方式，糞便排泄是由膽汁排泄經肝腸循環后的剩余部分和經胃腸道排泄的總和。因此，收集一段時間的尿、糞便，測定其濃度，即可獲得中藥從尿、糞便的排泄情況。

（2）膽汁排泄　動物麻醉后做膽管插管引流，待動物清醒后以各種途徑給藥，并以合適的時間間隔分段收集膽汁，測定其中藥原形物及代謝物，以此可獲得中藥從膽汁的排泄情況。

二、中藥血藥濃度研究方法

中藥血藥濃度研究方法分為直接血藥濃度法、中藥效應成分血藥濃度法、群體血藥濃度及毒代動力學血藥濃度法等方法。

1.直接血藥濃度法　適合于已分離提純的中藥活性成分的藥代動力學研究，與通常的化學藥物的藥代動力學研究方法完全相同。所獲得的資料只能說明活性成分本身的藥代動力學特點，未必能夠反映含有這種成分的中藥及其復方的藥代動力學特征。

2.中藥效應成分血藥濃度法　此法在中藥藥動學研究中應用較多。其方法是給予單味中藥或中藥復方，不同時間測定血中有效成分濃度，計算這些成分的藥代動力學參數，用以說明中藥單、復方的吸收、分布、代謝和排泄等特點。該法與直接血藥濃度法比較，結果更接近于中藥的臨床實際情況。目前中藥效應成分的藥代動力學研究往往測定其中的幾個成分。如茵陳五苓散以6，7-二甲基香豆素為指標，銀黃制劑以黃芩苷和綠原酸為指標，小柴胡湯以甘草次酸和黃芩苷為指標，大黃煎液以蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚為指標等。但中藥及其復方可能是由多種成分共同發揮作用的，僅測定其中的幾種有效成分來代表整個中藥及其復方的藥代動力學是不夠全面的，還需研究其他成分的藥代動力學特性，探索其中主要成分由于中藥配伍而導致的變化規律與藥效關系，才能較全面掌握中藥作用的本質。近年來隨著HPLCMS和HPLC-MS/MS等分析技術的應用，有望在不久的將來能揭示中藥及其復方中多種活性成分和其他成分在體內的藥動學與藥效學之間的變化規律。

3.群體血藥濃度法　此法是通過應用藥代動力學基本原理結合統計學分析研究某一群體藥代動力學（population pharmacokinetics，PPK）的方法。通常血藥濃度采樣只有幾個點，利用其稀疏數據來研究群體的特征和變異性。其參數一般可通過統計學中的單純集合法（naive pooled data，NPD）、標準二步法（STS）、迭代二步法（ITS）、非線性混和效應模型法（nonlinear mixed effect model，NONMEM）等進行求算，其中以NONMEM法最為常用。PPK可以將固定效應對基礎藥代動力學參數的影響模型化，從而發現新的定量關系，也可以估算出個體間變異，對于治療藥物監測給藥方案的設計與優化有較大的參考價值，還可以估算產品的變異和測定方法的變異性等。目前有關中藥PPK方面的研究有一些應用實例。如通過大鼠灌胃給予不同劑型的雙黃連后，用HPLC法測定血漿中黃芩苷濃度，用WinNonlin和NONMEM統計方法分別計算非房室模型藥代動力學參數和PPK參數。結果雙黃連的劑型顯著影響黃芩苷的藥代動力學參數，其中微乳制劑給藥后Cmax與AUC的值較大。再如將大鼠分別靜脈注射和灌服芍藥苷或阿魏酸提取物及其不同組成的復方冠心Ⅱ水煎液，HPLC法測定其血漿中芍藥苷和阿魏酸濃度，以NONMEM法分別對芍藥苷和阿魏酸的血藥濃度數據進行PPK解析。結果表明，芍藥苷、阿魏酸的體內過程均可用二室口服吸收模型進行表述。

4.中藥毒代動力學血藥濃度法　毒代動力學是涉及藥代動力學和毒理學研究的邊緣性分支學科。它運用藥代動力學的原理和方法定量研究毒性劑量下藥物在動物體內的過程和特點，探討藥物毒性發生和發展的規律性。毒代動力學有別于經典的藥代動力學和毒理學，其主要區別在于毒代動力學所用劑量遠遠高于臨床所用劑量，且多為重復多次給藥，側重點是闡明藥物的致毒機制和毒性發生發展的變化規律，有助于了解藥物的全身暴露情況，在臨床給藥劑量確定、毒性種屬差異比較和藥物安全性評價等多方面具有重要意義。

中藥毒代動力學研究分為單劑量、多劑量和長期毒性、組織分布、致癌毒性、生殖毒性、遺傳毒性等的毒代動力學研究。如應用HPLC-熒光分析方法研究了大黃酸的毒代動力學特征，采用與長期毒性試驗相同的劑量，在灌胃給藥第1天、連續給藥26周和連續給藥39周時進行毒代動力學試驗，測定不同時間點的血漿大黃酸濃度，用統計矩方法估算大黃酸在犬體內的毒代動力學參數。結果表明，在研究的劑量范圍內，大黃酸在犬體內的毒代動力學過程是基本一致的，各劑量間AUC及Cmax的比例均接近1∶2∶4。對于同一劑量，單次給藥和多次給藥后的AUC和Cmax沒有顯著性改變，說明大黃酸在犬體內蓄積程度較輕。

三、中藥生物效應研究方法

中藥生物效應研究方法主要有藥理效應、毒理效應和微生物測定等研究方法。

1.藥理效應法　藥理效應法是以中藥的效應強度，包括量效關系、時效關系為基礎的藥代動力學研究方法。與血藥濃度法不同，藥理效應法以效應為測定指標。目前，對于有效成分不明的中藥及其復方的藥代動力學研究，多傾向于使用藥理效應法。常用方法有效量半衰期法、效應作用期法等。

（1）效量半衰期法　該法是以中藥的藥理效應為指標，先分別求出該中藥的量-效關系（dose–effect relationship，D-E）和時-效（time-effect relationship，T-E）關系，再根據D-E關系將T-E中的E轉化成效應相關的量，從而求出時-量（time-dose relationship，T-D）關系。求得的T-D關系，即可繪制T-D曲線，進行模型分析和計算藥代動力學的相關參數。該方法的關鍵之一是能找出靈敏、定量反映中藥藥效的指標。若指標反應迅速且可逆，如血壓、HR等，則可在同一對象上連續觀察；若指標反應慢或不可逆，如發汗、抗感染等，則每個對象上只能觀察一個實驗點。其方法是：①建立D-E關系：劑量的選擇一般應處于ED15～ED85之間。取對數劑量為橫坐標，藥效強度為縱坐標，可直接求測D-E關系。②建立T-E關系：選擇較大劑量（ED85左右）給藥，定時測定給藥后效應經時變化。③建立T-D關系：將劑量（D）轉化為對數劑量（lgD），用lgD對效應E做直線回歸求得截距Ad及斜率Bd，則E=Ad+Bd×lgD，lgD=（E－Ad）/Bd。將T-E關系中各時間點的E以相應的D代替，則得出T-D關系。在T-D關系中，可按血藥濃度法分析中藥的房室模型和計算其相關的藥代動力學參數。

（2）藥效作用期法　量效半衰期法需要建立量效曲線和時效曲線，比較麻煩。如利用藥效作用期法，則比較方便。該法系以藥效作用期作為藥理效應強度指標。其方法為在ED20～ED80范圍內按一定比率確定3～5個不同劑量，分別給藥，測定藥效持續時間。以作用期為縱坐標，對數劑量為橫坐標做圖，并按線性回歸擬合一條直線，直線斜率為bp，其參數效量半衰期［t1/2（ED）］=0.301bp。

2.毒理效應法　本法與藥理效應法類似，同屬于生物測定法，但觀察指標為藥物的毒性作用，最常用者為動物死亡。毒理效應法分為急性累計死亡率法及LD50補量法。

（1）急性累計死亡率法　其方法為：①建立D-P直線：按常規將小鼠分為5～7組（每組10只），通常采用腹腔注射給藥，藥后記錄各組死亡率，得D-P直線（D為給藥劑量，P為累計死亡概率單位），求出LD50及LD90。②確定劑量和給藥間隔時間：劑量因D-P直線斜率而不同，通常用1/2LD90，兩次給藥劑量相同，這樣兩次給藥理論上產生的最大死亡率應為0.9，可避免小鼠全部死亡。給藥間隔一般取0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、48、72小時中的6～8個時間點，必要時可增設5、10、15分鐘時間組。③測定兩次給藥后的死亡率：按以上原則將小鼠分為5～8組，每組20～40只，均給藥兩次，首次腹腔注射LD90的一半，各組分別于預定間隔時間再重復給藥一次，觀察各組累計死亡率至不再出現死亡為止（中藥大多為3～5天），記錄死亡時間、死亡情況及雌雄小鼠死亡數。④確定T-Dt關系：先求出體存量Dt。Dt為各組第一次腹腔注射后經過用藥間隔時間的體內含量，公式為Dt=Dc－D0（Dc為P的相當劑量，D0為腹腔注射劑量），體存量百分率（%）=（Dt /　D0）×100%。就各組間隔時間（橫軸）和Dt或lgDt做圖則得T-Dt曲線，據此可分析中藥的消除動力學、房室模型，并計算藥代動力學參數。

此外，可計算中藥口服給藥時的F值，F=LD50（po）/LD50（ip），通過雌雄小鼠死亡總數的比值可看出中藥毒性有無性別差異。

（2）LD50補量法　本法是在急性累計死亡率法基礎上改進而成。改進之處是將二次腹腔注射同量藥物變為第一次腹腔注射某量基礎上，不同時間后，求測降低的LD50（t），間隔時間越短，LD50（t）降低量越大。第一次用藥后不同時間的體存量Dt=LD50－LD50（t）。以首次給藥后間隔時間對對數體存量做圖。由對數體存量-時間曲線擬合房室模型，計算藥代動力學參數。本法優點是結果更精確，誤差小，死亡指標在曲線中段。但使用動物數成倍增加，分組、給藥及時間把握上更復雜。

急性死亡率法最大的優點是普適性。因以死亡為指標，具有非特異通用性質，只要能使動物急性致死的藥物都可用本法估計藥代動力學參數。該法簡便易行，不需要特殊儀器；觀察到的死亡前癥狀可以推測中藥作用性質，死亡時間可反映中藥起效快慢，并可判斷毒效的性別差異。缺點是毒效與藥效不相平行，毒效成分可能不是藥效成分，故不能代表治療劑量下的藥代動力學規律，所測的參數具有一定的片面性。

3.微生物指標法　微生物法已廣泛用于抗菌藥物的效價測定，其原理主要是含有試驗菌株的瓊脂平板中抗菌藥擴散產生的抑菌圈直徑大小與抗菌藥濃度的對數呈線性關系。故可利用這一原理選擇適宜的敏感菌株測定體液中抗菌中藥的濃度，然后按照藥代動力學原理確定房室模型，并計算其參數。該法簡便易行，但特異性不高，測定的結果包括具有抗菌活性的代謝物。

四、PK-PD結合研究方法

藥代動力學（pharmacokinetics，PK）和藥效動力學（pharmacodynamics，PD）是按時間同步進行的兩個密切關聯的動力學過程，各有側重。但在相當長的時間內對兩者的研究是分別進行的，兩者之間的內在聯系被忽視，使得PK-PD的研究存在一定局限性。隨著PK和PD研究的不斷深入，人們逐漸意識到這一問題，進而提出了PK-PD模型，用于綜合研究體內藥物動力學過程與藥效量化指標的動力學過程，將兩種不同形式過程整合為統一體，其本質是一種藥量與效應之間的轉換過程。利用這一模型有助于全面和準確地了解藥物效應隨劑量（或濃度）及時間的變化規律。

近年來，隨著人工神經網絡及微透析技術的發展，PK-PD模型的研究及其應用取得了較大進展，但仍然面臨許多問題和挑戰。首先是如何尋找和選擇合適的藥效指標來評價藥物的療效，因為許多藥物的效應在體內是無法直接進行連續定量測定的，常常借助于生物標志物來反映藥物的效應，因此必須要明確這些生物標志物的變化與疾病的狀態和進程之間的關聯性，以便使研究更契合臨床實際；其次是如何解決具有多靶點和（或）多組分特性藥物的PK-PD結合研究。有學者在研究血藥濃度和效應的過程中發現，血藥濃度和效應之間并非簡單的一一對應關系，即效應峰值明顯滯后于血藥濃度峰值，若以效應對濃度做圖可得到逆時針滯后環曲線。根據這一現象，1979年Sheiner等在經典的藥代動力學模型理論基礎上，提出一個假想的效應室，使之與血漿室（中央室）相聯系，且結合傳統的藥效學，組合出一種新的PK-PD結合模型，成功地解釋了筒箭毒堿藥效滯后于血藥濃度的現象。目前大多數藥物的效應滯后環都可以通過這種模型得到滿意解釋，從而證實了效應室的存在。

在中藥藥動學研究中，由于化學成分非常復雜，以其中的一個或幾個化學成分為檢測指標，測得的藥代動力學特征不一定能代表整個的體內過程。因此研究人員開始采用PK-PD模型進行中藥藥動學研究。如通過構建藥動學網絡和藥效學網絡在內的神經網絡結構體系，以大鼠冠脈結扎引起的急性心肌缺血為病理模型，考察丹參素對肌鈣蛋白T（troponin T，TnT）、高半胱氨酸（homocysteine，Hcy）和還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）等指標的影響，結果顯示網絡結構對心血管作用的貢獻率有所不同，其中丹參素血藥濃度對GSH的影響最大，然后依次是TnT和Hcy。通過神經網絡的PK-PD結合模型來研究和評價丹參素的心血管活性，發現其具有多靶點的作用特征。

由于現有的PK-PD模型只適合于作用機制明確且成分單一的化學藥物，而中藥的作用常常具有多組分和多靶點的特點，這極大地限制了PK-PD模型在中藥藥物動力學研究中的應用。因此有必要開拓新的研究思路，提出并建立符合中藥作用特點的PK-PD模型，這將有助于闡明中藥作用的物質基礎及其作用機制，為中藥現代研究提供新理論和新方法。