第六節(jié) 納豆激酶免疫脂質體
一、納豆激酶免疫脂質體的制備
制備三批納豆激酶脂質體，[50]平均包封率為53.44%（RSD=3.82%）。采用對甲基苯磺酰-L-精氨酸甲酯（TAME）法測定納豆激酶活性，活性單位為TAME ；U/mL。
取偶合劑EDCI將McAb SZ-63偶聯(lián)到納豆激酶脂質體表面。具體操作：在10mL脂質體懸液中加入5.0mg/mL EDCI溶液0.5mL和1.0mg/mL McAb SZ-63 0.1mL，置于冰水浴中磁力攪拌2h即可。
葡聚糖凝膠G-25柱（1.5cm×22cm）預先用0.1 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液平衡，將上述反應后的脂質體懸液上柱，每次2.0mL，用上述PBS洗脫，流速1.0mL/min。洗脫約17min后從流出的洗脫液出現(xiàn)乳光開始收集洗脫液，每瓶收集4mL，連續(xù)收集10瓶。收集的第1瓶洗脫液有明顯的乳白色乳光；第2瓶只有很淺的乳光，兩瓶流出組分均為納豆激酶免疫脂質體；第3瓶澄清流出組分已測不出納豆激酶活性。
二、制備免疫脂質體過程中納豆激酶活性的變化
1.納豆激酶溶液的長期穩(wěn)定性
用磷酸鹽緩沖液配制濃度為0.22mg/mL的納豆激酶溶液，將溶液加入具塞西林瓶中，置于4℃保存。分別于0、1、2、3、5、6、10、27天取樣，測定納豆激酶活性并計算其平均值和相對標準偏差。0天時測得活性為0.420 TAME U/mL，27天中納豆激酶活性平均值為0.434 TAME U/mL（RSD=6.42%）。可見，納豆激酶在上述條件下保存，活性穩(wěn)定。
2.旋轉蒸發(fā)時間對納豆激酶活性的影響
用PBS配制濃度為0.32mg/mL納豆激酶溶液，置于25℃恒溫水浴中以120 r/min旋轉蒸發(fā)，分別于0、30、60、90、120、150、180min取樣1.0mL，測定活性，結果見表4-12。
表4-12 旋轉蒸發(fā)時間對納豆激酶活性的影響（n=3）
由表4-12可見，25℃恒溫旋轉蒸發(fā)180min時納豆激酶活性保留率在94%以上，120min以內(nèi)活性保留率在95%以上。
3.EDCI對納豆激酶活性的影響
用磷酸鹽緩沖液配制濃度為0.25mg/mL納豆激酶水溶液，測得其活性為（0.468±0.025）TAME U/mL。將配制的溶液分為兩組，其中一組加入EDCI至終濃度為0.25mg/mL；另一組不加。兩組均置于4℃保存，24h后測定活性。結果，不含EDCI組納豆激酶活性為（0.459±0.018）TAME U/mL，含EDCI組活性為（0.450±0.020）TAME U/mL。可見，EDCI的加入對納豆激酶活性影響不大[50]。
4.攪拌對納豆激酶活性的影響
用磷酸鹽緩沖液配制濃度為0.25mg/mL納豆激酶水溶液，測得其活性為（0.450±0.021）TAME U/mL。將配制的溶液分為兩組，其中一組加入EDCI至終濃度0.25mg/mL；另一組不加。兩組均置于冰水浴中磁力攪拌2h，分別測定納豆激酶活性。結果，不含EDCI組測出的活性為（0.449±0.015）TAME U/mL，含ED-CI組為（0.477±0.019）TAME U/mL。可見，含EDCI的納豆激酶溶液在冰水浴中磁力攪拌2h對納豆激酶活性的影響不大。
5.葡聚糖凝膠G-25柱層析對納豆激酶活性的影響
取用PBS配制的濃度為0.25mg/mL的納豆激酶水溶液分成三組，測定其納豆激酶活性為（0.461±0.017）TAME U/mL。分別取上述三組溶液2mL上柱，以PBS為洗脫液，流速1mL/min，洗脫17min后開始收集洗脫液，每瓶收集4mL，連續(xù)收集10瓶。流出的組分依次為空白洗脫液、納豆激酶液、空白洗脫液。測定納豆激酶液流出段中納豆激酶的活性，計算得到納豆激酶的柱回收率平均值為99.73%（RSD=5.53%），說明柱層析對納豆激酶活性影響不大[50]。
三、納豆激酶免疫脂質體凍干品的制備
取過柱收集到的脂質體懸液10mL移至分子截留量為12 000 u（1 u=1 D）的透析袋中，放入培養(yǎng)皿，向透析袋上撒滿聚乙二醇（PEG）6000的干粉末，4℃保存。待脂質體懸液濃縮至約2mL，將懸液轉移出透析袋并分裝到西林瓶中，每瓶2.0mL，厚度約為10 mm，置于-40℃冰箱急速冷凍。轉移至凍干機中，啟動真空泵，當干燥箱內(nèi)的真空度達到0.1 mmHg以下時關閉冷凍機，緩緩加熱，使凍結產(chǎn)品的溫度逐漸升高至-20℃，藥液中的水分升華，24h后從凍干機中取出凍干品即得。
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