第一節(jié)　核酸電泳的原理

核酸在一定pH條件下，通常帶電荷，將其置于電場(chǎng)中，會(huì)以一定的速度向與其電荷性質(zhì)相反的電極遷移，遷移速度稱為電泳速率。

一、核酸電泳的原理

組成核酸大分子的核苷酸分子含有一個(gè)帶氨基基團(tuán)的堿基和三個(gè)磷酸基團(tuán)，因而核酸分子是一種兩性解離分子，在溶液的pH為3.5時(shí)堿基上的氨基解離，而三個(gè)磷酸基團(tuán)中只有一個(gè)磷酸基團(tuán)解離，此時(shí)分子相當(dāng)于帶正電的陽(yáng)離子，在電場(chǎng)中向負(fù)極泳動(dòng)；而當(dāng)溶液的pH為8.0～8.3時(shí)，核酸分子堿基上的氨基幾乎不解離，而三個(gè)磷酸基團(tuán)完全解離，此時(shí)核酸分子相當(dāng)于帶負(fù)電的陰離子，因此在電場(chǎng)中它就會(huì)向正極移動(dòng)，所以核酸電泳中常用中性或偏堿性的緩沖液進(jìn)行電泳。

帶電分子在電場(chǎng)中的移動(dòng)速率與樣品分子電荷密度、電場(chǎng)的電壓和電流成正比，與樣品的大小、介質(zhì)的黏度及電阻成反比。核酸是帶均勻電荷的生物大分子，不同大小和分子構(gòu)象的核酸分子電荷密度大致相同，因而在自由電泳的條件其對(duì)移動(dòng)速率影響不大，分子大小和構(gòu)象不同的核酸分子的遷移率差異很小，難以分開(kāi)。當(dāng)以適當(dāng)濃度的凝膠作為電泳支持介質(zhì)，凝膠具有分子篩效應(yīng)，在分子篩的作用下，使分子大小和構(gòu)象不同的核酸分子電泳速率出現(xiàn)較大的差異，從而達(dá)到分離核酸片段，檢測(cè)其大小的目的。

在一定強(qiáng)度的電場(chǎng)條件下，DNA分子的遷移速率取決于核酸分子的大小和本身的構(gòu)型。相對(duì)分子質(zhì)量小的移動(dòng)速率快，具有緊密構(gòu)型的分子比松散構(gòu)型的移動(dòng)速率快，但在中性或堿性時(shí)，單鏈DNA與等長(zhǎng)的雙鏈DNA的移動(dòng)速率大致相同。若將帶靜電荷Q的離子置于電場(chǎng)中，它的受力簡(jiǎn)單分析如下：

電荷引力：F引=EQ

根據(jù)Stokes公式，運(yùn)動(dòng)中的顆粒在溶液中受到阻力：F阻=6πrην

平衡時(shí)有F引=F阻，即EQ=6πrην

整理后得：ν=EQ/（6πrη）

式中：E，電場(chǎng)強(qiáng)度；r，球形粒子的半徑；η，溶液的黏度系數(shù)；ν，帶電粒子運(yùn)動(dòng)速度。

由上式可知，相同帶電顆粒在不同強(qiáng)度的電場(chǎng)里泳動(dòng)速度是不同的，為了便于比較，常用遷移率代替泳動(dòng)速度表示粒子的泳動(dòng)情況，遷移率為帶電粒子在單位電場(chǎng)強(qiáng)度下的泳動(dòng)速度。若以m表示遷移率：上式兩邊同時(shí)除以電場(chǎng)強(qiáng)度E，則得：m=Q/（6πrη）。

由于核酸、蛋白質(zhì)和氨基酸等生物大分子的電離度α受溶液pH影響，所以常用遷移率m和當(dāng)時(shí)條件下電離度α的乘積，即有效遷移率U表示大分子的泳動(dòng)情況：

U=mα

代入m得：U=αQ/（6πrη）。

從上面公式可以看出，影響分子帶電量Q及電離度α的因素如溶液的pH、影響溶液黏度系數(shù)的因素如溫度、分子的半徑r等，都會(huì)影響有效遷移率，因此，電泳應(yīng)盡可能在恒溫條件下進(jìn)行，并選用一定pH的緩沖液，所選用的pH以能擴(kuò)大各種被分離組分所帶電荷量的差異為好，以利于各種成分的分離。

二、核酸電泳的載體

核酸電泳中常用的電泳介質(zhì)是瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠，瓊脂糖凝膠電泳方便快速，用于檢測(cè)和分離純化，分辨力在0.1～50 kb之間；聚丙烯酰胺凝膠，分辨率高，可以用于測(cè)序，分辨力在1 bp～1 kb之間。

1.瓊脂糖凝膠

瓊脂糖（agarose,Gel）是從瓊脂中提純出來(lái)的，主要是由D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖連接而成的一種多糖。瓊脂糖凝膠是一種大網(wǎng)孔型凝膠。總的說(shuō)來(lái)，瓊脂糖凝膠具有以下特點(diǎn)：含水量大，最高可達(dá)99%以上，使被電泳的核酸分子近似于自由電泳，但是分子的擴(kuò)散度比自由電泳小；瓊脂作為支持體，凝膠的制備簡(jiǎn)便，電泳條帶均勻、區(qū)帶整齊、分辨率高、重復(fù)性好；電泳速度快，電泳時(shí)間較短；透明而不吸收紫外線，可以直接用紫外檢測(cè)儀作定量測(cè)定；對(duì)蛋白質(zhì)的吸附極微，區(qū)帶易染色，樣品易回收，有利于制備。

瓊脂糖凝膠的制作是將瓊脂糖粉懸浮于緩沖液中，通常使用的濃度是1%～3%，加熱煮沸至溶液變?yōu)槌吻澹⑷肽０搴笫覝叵吕鋮s凝聚即成。瓊脂糖之間以分子內(nèi)和分子間氫鍵形成較為穩(wěn)定的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，這種交聯(lián)的結(jié)構(gòu)使瓊脂糖凝膠有較好的抗對(duì)流性質(zhì)。瓊脂糖凝膠的孔徑可以通過(guò)瓊脂糖的最初濃度來(lái)控制，低濃度的瓊脂糖形成較大的孔徑，而高濃度的瓊脂糖形成較小的孔徑。盡管瓊脂糖本身沒(méi)有電荷，但一些羰基可能會(huì)被羧基、甲氧基特別是硫酸根不同程度的取代，使得瓊脂糖凝膠表面帶有一定的電荷，引起電泳過(guò)程中發(fā)生電滲以及樣品和凝膠間的靜電相互作用，影響分離效果。市售的瓊脂糖有不同的提純等級(jí)，主要以硫酸根的含量為指標(biāo)，硫酸根的含量越少，提純等級(jí)越高。

瓊脂糖凝膠可以用于蛋白質(zhì)和核酸的電泳支持介質(zhì)，尤其適合于核酸的提純、分析。由于DNA、RNA分子通常較大，所以在分離過(guò)程中會(huì)存在一定的摩擦阻礙作用，這時(shí)分子的大小會(huì)對(duì)電泳遷移率產(chǎn)生明顯影響。

瓊脂糖凝膠電泳操作簡(jiǎn)單，但瓊脂糖凝膠垂直式電泳應(yīng)用得相對(duì)較少，通常是制成水平式板狀凝膠，在強(qiáng)度和方向恒定的電場(chǎng)下電泳，一般也多為實(shí)驗(yàn)室采用。在核酸電泳中使用低濃度的熒光嵌入染料染色，在紫外線下至少可以檢出1～10 ng的DNA條帶，從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。瓊脂糖凝膠構(gòu)成的分子篩的網(wǎng)孔大小不同，分離DNA片段大小的范圍也不同，不同濃度瓊脂糖凝膠可分離DNA片段長(zhǎng)度從100 bp至約50 kb，而在脈沖電場(chǎng)下可以分離10000 kb以上的DNA分子。

由于瓊脂糖凝膠是通過(guò)氫鍵的作用形成的，因此過(guò)酸或過(guò)堿等破壞氫鍵形成的方法常用于凝膠的再溶化，如NaI或者NaClO4能夠?qū)⒛z的溶解，有些凝膠回收試劑盒就是利用這一原理來(lái)將凝膠溶化，因此不必使用低熔點(diǎn)的瓊脂糖來(lái)進(jìn)行DNA的回收。

由于瓊脂糖凝膠的彈性較差，難以從小管中取出，所以一般來(lái)說(shuō)，瓊脂糖凝膠不適用于管狀電泳，管狀電泳通常采用聚丙烯酰胺凝膠。

2.聚丙烯酰胺凝膠

聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide gel）是一種人工合成的大分子物質(zhì)，由丙烯酰胺（Acr）在N,N，N′，N′-四甲基乙二胺（TEMED）和過(guò)硫酸銨（AP）的催化下聚合形成長(zhǎng)鏈，并通過(guò)交聯(lián)劑N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺（Bis）交叉連接而成，其網(wǎng)孔的大小主要由Acr與Bis的相對(duì)比例決定。

聚丙烯酰胺用于DNA電泳的原理和瓊脂糖電泳相似，和瓊脂糖適合分離大片段DNA分子相比，聚丙烯酰胺凝膠對(duì)于5～500 bp小片段的DNA分子分離效果最好。核酸的聚丙烯酰胺凝膠電泳一般采用垂直裝置，用于測(cè)序和分子標(biāo)記。

和瓊脂糖相比，聚丙烯酰胺凝膠分辨率更高，變性聚丙烯酰胺凝膠能將相差1 bp的DNA片段電泳分開(kāi)，可用于分析和制備小于1 kb長(zhǎng)度的DNA片段，也可用于DNA測(cè)序和AFLP、微衛(wèi)星等分子標(biāo)記等檢測(cè)。聚丙烯酰胺凝膠回收的DNA樣品純度高，可用于嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)，如引物合成和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)回收樣品。此外，聚丙烯酰胺凝膠機(jī)械強(qiáng)度高于瓊脂糖，不容易損壞；其電泳速度很快，可容納相對(duì)大量的DNA，但制備和操作比瓊脂糖凝膠煩瑣。

三、核酸電泳的指示劑

核酸分子無(wú)法直接肉眼觀測(cè)，所以電泳過(guò)程中常使用有顏色的指示劑來(lái)指示樣品的遷移過(guò)程，通過(guò)指示劑和相應(yīng)核酸分子的關(guān)系來(lái)判斷電泳的進(jìn)程。核酸電泳常用的指示劑有溴酚藍(lán)和二甲苯青FF，溴酚藍(lán)呈藍(lán)紫色，相對(duì)分子質(zhì)量為670；二甲苯青FF呈藍(lán)色，相對(duì)分子質(zhì)量為554.6，其荷電量比溴酚藍(lán)少，在凝膠中遷移率比溴酚藍(lán)慢。兩種指示劑都較小，凝膠中對(duì)它們分子篩效應(yīng)小，近似于自由電泳，因此在不同濃度的凝膠中，它們遷移速度基本相同。以0.5×TBE為緩沖液，在0.6%、1%、2%的瓊脂糖凝膠電泳中，溴酚藍(lán)的遷移率分別與1.0、0.6、0.15 kb的雙鏈線性DNA片段大致相同。以0.5×TBE為緩沖液，在0.1%瓊脂糖凝膠電泳中遷移率相當(dāng)于4 kb的雙鏈線性DNA片段。在5%的PAGE遷移率相當(dāng)于260 bp的雙鏈線性DNA的遷移率，在5%含7～8 mol/L尿素聚丙烯酰胺中相當(dāng)于130 bp單鏈DNA的遷移率。指示劑在凝膠的遷移率可以參照表2-1，表2-2。

表2-1　各指示劑在不同濃度聚丙烯酰胺凝膠的遷移率

注：*在1×TBE緩沖液中濃度。

表2-2　各指示劑在不同濃度瓊脂糖凝膠的遷移速率

注：*在0.5×TBE緩沖液中濃度。