第二節 連接酶
連接酶是能催化兩個核酸分子連接成一個分子或把一個核酸分子的首尾相連接的酶，此反應與ATP的分解反應相偶聯。
一、連接酶連接作用的分子機理
連接酶（ligase）舊稱“合成酶”，是1967年在三個實驗室同時發現的，最初發現于大腸桿菌中。它是一種封閉DNA鏈上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA鏈的5′-磷酸基與另一DNA鏈的3′-OH生成磷酸二酯鍵。但這兩條鏈必須是與同一條互補鏈配對結合的（T4 DNA連接酶除外），而且必須是兩條緊鄰DNA鏈才能被DNA連接酶催化成磷酸二酯鍵。常用的DNA連接酶有來自大腸桿菌的DNA連接酶和來自噬菌體的T4 DNA連接酶兩種，二者的作用機理類似。
T4 DNA連接酶作用過程分三步：第一步，T4 DNA連接酶與輔助因子ATP形成酶-AMP復合物；第二步，酶-AMP復合物結合到具有5′-磷酸基和3′-OH切口的DNA上，使DNA腺苷化；第三步，產生一個新的磷酸二酯鍵，把缺口封起來，同時釋放出AMP。
在生物體內，DNA連接酶在DNA復制、修復和重組中起著重要的作用，連接酶有缺陷的突變株不能進行DNA復制、修復和重組。在基因操作實驗中，DNA連接酶主要作用是將由限制性核酸內切酶“剪”出的DNA黏性末端重新連接起來，故也稱“基因針線”。
二、連接酶的種類
大腸桿菌DNA連接酶（E.coli DNA ligase）最先是從大腸桿菌細胞中分離純化得到，是由大腸桿菌染色體DNA編碼的相對分子質量為75000的多肽鏈。它只能催化黏性末端的雙鏈DNA的連接，不能催化平末端雙鏈DNA連接；需要NAD+作為輔助因子，活性較T4 DNA連接酶低，但是其連接背景低，連接更為準確。該酶對胰蛋白酶敏感，可被其水解，水解后形成的小片段仍具有可以催化酶與NAD+（而不是ATP）反應形成酶-AMP中間物的活性，但不能繼續將AMP轉移到DNA上促進磷酸二酯鍵的形成。
在大腸桿菌細胞中，約有300個分子的大腸桿菌連接酶，和DNA聚合酶Ⅰ的分子數相近，這也是比較合理的現象。因為DNA連接酶的主要功能就是在DNA聚合酶Ⅰ催化聚合，填滿雙鏈DNA上的單鏈間隙后封閉DNA雙鏈上的缺口。
T4 DNA連接酶（T4 DNA ligase）最早是從T4噬菌體感染的大腸桿菌中純化而得，是由T4噬菌體DNA編碼的相對分子質量為60000的多肽鏈。它能催化DNA末端的5′-磷酸基與另一個DNA末端的3′-OH連接成磷酸二酯鍵，在連接反應中以ATP為輔助因子。T4 DNA連接酶不僅可以連接雙鏈DNA，也可以使DNA-RNA和RNA-RNA黏性末端或平頭末端進行連接。與大腸桿菌DNA連接酶不同的是，T4 DNA連接酶既能連接黏性末端，也可以連接平端的雙鏈DNA，但是效率比黏性末端低很多。T4 DNA連接酶活性很容易被0.2 mol/L的KCl和精胺抑制，而NH4Cl可以提高大腸桿菌DNA連接酶的催化速率，而對T4 DNA連接酶則無效。需要注意的是，無論T4 DNA連接酶，還是大腸桿菌DNA連接酶都不能催化兩條游離的DNA鏈的末端相連接。T4 DNA連接酶容易制備，活力和連接效率高，所以在分子生物研究中的應用最為廣泛。
T4 RNA連接酶（T4 RNA ligase）來源和作用機理與T4 DNA連接酶相同，不同的是其作用的模板是RNA或單鏈的DNA，是一種ATP-依賴的可以催化單鏈RNA、單鏈DNA、單核苷酸分子間或分子內5′-磷酸末端與3′-OH末端之間形成磷酸二酯鍵的連接酶，連接時需要5′-磷酸基和3′-OH的存在。
T4 RNA連接酶主要用于RNA和RNA之間的連接，不僅可以進行RNA分子間的連接，也可以進行RNA分子（最短8個堿基）的環化連接和tRNA修飾；可以用于RNA和單核苷酸之間的連接，單核苷酸必須為5′和3′均磷酸化的形式，這常用于RNA的3′末端標記；可以用于DNA和RNA之間的連接，當DNA提供5′-磷酸基，RNA提供3′-OH時，連接效率較高，當DNA提供3′-OH,RNA提供5′-磷酸基時，連接效率非常低。此外，T4 RNA連接酶也可以用于DNA和DNA之間的連接，但連接效率非常低，主要用于DNA的環化連接，例如，5′RACE中的cDNA環化。
早期的T4 RNA連接酶是從T4噬菌體感染的大腸桿菌中純化得到，純度和活力都較低。目前商品化的T4 RNA連接酶由大腸桿菌重組表達，有些供應商（如NEB）有兩種T4 RNA連接酶產品，一種是T4 RNA連接酶Ⅰ（ssRNA連接酶），英文名稱為T4 RNA ligaseⅠ（ssRNA ligase），其表達基因的來源為T4噬菌體的T4 RNA連接酶Ⅰ截短型基因，其用途主要用于前面所述的單鏈模版連接。另外一種T4 RNA連接酶產品是T4 RNA連接酶Ⅱ（T4 RNL2截短型），英文為T4 RNA ligaseⅡ。T4 RNA連接酶Ⅱ可特異性地將DNA或RNA的預腺苷酰化5′末端連接到RNA 3′末端，連接時不需要ATP，但需要預腺苷酰化底物。T4 RNL2截短型的表達基因來自T4 RNA連接酶Ⅱ基因的前249個核苷酸，與全長的T4 RNA連接酶2不同，T4 RNL2截短型不能將底物的5′末端腺苷酰化，無法將RNA或DNA的5′磷酸末端連接到RNA的3′端，因為此酶只能利用腺苷酰化的引物，可以有效地降低連接背景，在基因操作實驗中該酶可用于micro RNAs克隆中接頭連接的優化。
熱穩定DNA連接酶（thermostable DNA ligase）最早是從嗜熱高溫放線菌（Thermoactinomyces thermophilus）中分離純化得到的，其在85℃高溫下仍能保持連接酶的活性，而且在重復多次升溫到94℃之后仍然保持連接酶的活性，所以稱為熱穩定DNA連接酶。該酶可用于要求高溫反應條件的連接反應。目前市場上多種商品化的熱穩定連接酶都來源于大腸桿菌重組菌株，但其表達的基因來源于不同的嗜熱菌，因此商品的熱穩定連接酶都是根據其基因來源的微生物進行命名的，如來源于Thermus filiformis菌株稱為Tfi DNA連接酶；來源于Thermus aquaticus HB8菌株的稱為Taq DNA連接酶；來源于Thermococcus sp.9°N菌株稱為9°NTM DNA連接酶。
熱穩定DNA連接酶可以催化磷酸二酯鍵的形成，使雜交到同一互補靶DNA鏈上的兩條緊鄰的寡核苷酸鏈的5′-磷酸末端和3′-OH末端通過磷酸二酯鍵連接，相當于對雙鏈DNA分子中的缺口進行連接，活性需要NAD+，其最適反應溫度一般在45～65℃，其中9°NTM DNA連接酶基因克隆自極度耐熱的海底超嗜熱古菌（Thermococcus sp.9°N）——一種發現于北緯9°，2500m深的海底火山口處的嗜熱菌，該酶在45～90℃范圍內均能保持很高的活性。一般在95℃半衰期超過1 h，在65℃超過50 h，所以其可以用于連接酶鏈反應（ligase chain reaction,LCR）。
LCR屬于一種探針擴增技術，是依賴靶核苷酸序列的寡核苷酸探針的連接技術。這種方法應用4種寡核苷酸探針（即兩對互補的引物），當它們在體外結合到靶序列上以后，用耐熱DNA連接酶將它們連接起來。
LCR的基本原理是：首先加熱至一定溫度（94～95℃）使DNA變性，雙鏈打開，然后降溫退火（65℃），這時引物與之互補的模板DNA復性退火，如果與靶序列雜交的相鄰的寡核苷酸引物與靶序列完全互補只留下一個缺口，DNA連接酶即可連接封閉這一缺口，則LCR反應的三步驟（變性—退火—連接）就能反復進行，每次連接反應的產物又可在下一輪反應中作模板進行再連接反應，從而使目標靶序列得到擴增。若連接處的靶序列有點突變，引物不能與靶序列精確結合，缺口附近核苷酸的空間結構發生變化，連接反應不能進行，也就不能形成連接產物，目標靶序列就沒有得到擴增。1991年Backman和Bara-ny分別用耐熱DNA連接酶進行了LCR試驗，耐熱DNA連接酶可以在熱循環中保持活性，提高連接反應的特異性，排除了背景擴增和免除了不斷補充酶的煩瑣程序，使LCR具有了實用性。
LCR反應識別點突變的特異性高于普通的PCR反應，其特異性首先取決于引物與模板的特異性結合，其次是耐熱連接酶的特異性。LCR連接反應溫度接近引物的Tm，因而識別單核苷酸錯配的特異性極高，擴增效率與PCR相當，用耐熱連接酶做LCR只用兩個溫度循環，94℃min變性和65℃復性并連接，循環30次左右就可以進行檢測了，其產物的檢測也較方便靈敏，可以把擴增產物進行凝膠電泳后放射自顯影或者利用酶免疫檢測法。LCR作為一種新的DNA體外擴增和檢測技術，比PCR具有更高的敏感性和特異性。主要用于點突變的研究與檢測、靶基因的擴增、微生物病原體的檢測及定向誘變等，還可用于單堿基遺傳病多態性及單堿基遺傳病的產物診斷，微生物的種型鑒定，癌基因的點突變研究等。
正是LCR反應特異性高于普通的PCR反應，ABI公司的SOLiD第二代高通量測序技術采用LCR技術進行測序反應，也稱連接法測序“Sequence by Ligation”。
注意：雖然熱穩定連接酶活性是定義為對黏性末端的連接反應，但是其連接反應的特性與其他DNA連接酶（如T4 DNA連接酶）有很大差異（表3-6），用途也不相同，因此不能把熱穩定連接酶作為DNA連接酶的替代品。
表3-6 不同連接酶的比較
三、連接酶的單位定義
連接酶單位最早是1968年由Weiss提出的，稱為Weiss單位（Weiss Unit），現也稱PPi單位。Weiss單位定義為：在37℃下，20 min催化1 nmol/L的32P從焦磷酸根上置換到[γ，β-32P]ATP分子上所需的酶量，現在大多數廠商仍使用這種單位。由于Weiss單位定義中測試的是T4 DNA連接酶中除連接功能外的另一種磷酸基團交換功能，并且測試溫度高達37℃，與實際連接反應相比，無論在哪一方面都有一定的差距，于是，1970年Modrich與Lehman提出了真正度量連接功能的d（A-T）環化單位，又稱外切酶抗性檢測。d（A-T）環化單位的定義為：30℃下30 min將100 nmol/L的d（A-T）（約2 kb長）轉化成抗外切酶的形式。
與Weiss單位相比，d（A-T）環化單位更接近實際，但仍有一定的問題，例如，環化單位測試中用的是純AT片段，與實際連接中4種堿基隨機排列不符，再者，如果連接酶將片段連接成多聚體而未環化時，仍可能被外切酶所切，除此之外，與實際上大多數連接反應使用的溫度16℃相比，30℃的反應溫度仍顯得偏高。
為了衡量實際連接條件下的酶活力，NEB公司提出了接近實用條件的黏性末端連接單位（cohesive end ligation unit），也稱為NEB單位，其定義為：20μL 1×T4 DNA連接酶反應緩沖液中，16℃反應條件下，30 min能使5′端濃度為0.12μmol/L（約300μg/mL）的經HindⅢ消化的λDNA片段連接上50%所需的酶量。
由于目前Weiss單位和黏性末端連接單位都有廠商在使用，兩個單位之間的換算關系為：1 NEB單位=0.015 Weiss單位，或者1 Weiss單位=67 NEB單位。
四、連接酶使用注意事項
在單一DNA分子的連接反應體系中，在連接酶單位定義的底物濃度內，DNA的濃度高，其末端之間的連接概率也高，連接產物量也會上升。在實際的基因操作實驗中，連接都是在兩個或兩個以上的DNA分子間進行的，末端之間就會產生相互的競爭，所以末端的濃度會直接影響到連接產物的分子構型。連接產物的構型有兩種：一種是線性的，是由不同的分子間的末端首尾相連接而成的線性DNA分子；另一種是環狀的，是由同一個DNA分子或者多個DNA分子連接成大的線性分子，然后進一步首尾末端環化連接而成。
連接產物（重組DNA分子）的分子構型不僅與連接DNA濃度有關，而且與連接DNA分子的長度有關。在一定的濃度范圍內，小分子的DNA片段比大分子的容易發生分子內環化，所以在進行質粒的單酶切連接反應中，需要通過去磷酸化處理來防止質粒的自身環化。同樣道理，在質粒的連接反應中，兩個質粒分子間連接的概率比質粒分子內環化低很多；而長度恒定的DNA分子，降低濃度反而有利于分子的環化。對于重組DNA的連接反應往往是直線性的載體分子和外源的線性分子之間的連接，其希望的目的連接產物是載體分子和單個插入片段的重組子，所以不僅要考慮分子反應體系中總的DNA濃度，也要考慮載體末端和插入片段末端的比例。在一定總DNA濃度的范圍內，對于具有相同的黏性末端的載體和插入片段的連接，形成載體和插入片段重組分子的比例會隨著插入片段濃度的提高而快速增加，但達到一定的峰值后會緩慢下降。可見要求得到環化的有效連接產物，DNA濃度不可過高，一般不會超過20 nmol/L，如果是線性化的連接產物，DNA的濃度可以高些，至少是接近推薦的濃度。在用大質粒載體進行大片段克隆時，以及在雙酶切片段的連接反應中，DNA濃度還應降低，甚至是DNA的總濃度低至幾個nmol/L。有研究表明，T4 DNA連接酶對DNA末端的表觀Km為1.5 nmol/L，所以，連接時DNA濃度不應低于1 nmol/L，即應具有2 nmol/L的末端濃度。對于質粒性載體，為了降低載體分子間的環化，載體DNA的濃度不宜過高，外源DNA末端的濃度應該大于載體末端濃度的2倍以上；但是對于λ噬菌體載體一類的線性載體，重組子相對分子質量過大或過小都不能被包裝，所以期望的連接產物為線性的重組單體雜合分子，這時載體（com的左臂和右臂）和外源片段的可連接末端的比例接近1:1。
載體不同的酶切方式及處理方式，也會影響到連接產物中重組雜合分子的比例。載體用兩種內切酶進行酶切處理，其重組雜合率比用單酶切的高；將載體進行回收純化的重組雜合率比不經過回收的高，單酶切載體經去磷酸化處理的重組雜合率比不進行去磷酸化處理的高。
理論上連接酶最適反應溫度為37℃，此時連接酶的活性最高，但是黏性末端的連接中，一般末端都只有4個堿基是互補配對的，在37℃，黏性末端分子形成配對結構的氫鍵結合不穩定，因此連接反應一般在4～16℃間進行，傳統上將連接溫度定為16℃，時間為4～16 h。對于一般的黏性末端來說，20℃，30 min就足以取得相當好的連接效果，當然如果時間充裕的話，20℃60 min能使連接反應進行得更完全一些；對于平末端是不用考慮氫鍵問題的，可使用較高的溫度，使酶活力得到更好的發揮。
T4 DNA連接酶活性依賴ATP，反應緩沖液中ATP的濃度在0.5～4 mmol/L之間，較多用1 mmol/L。研究發現，ATP的最適濃度為0.5～1 mmol/L，過濃會抑制反應。例如，5 mmol/L的ATP會完全抑制平末端連接，黏性末端的連接也有10%被抑制，所以一般平末端連接要求的ATP較黏性末端連接的濃度低。此外，在緩沖液中還有DTT，它能提供一定的還原能力。值得注意的是，由于ATP極易分解，含有ATP的緩沖液應于-20℃保存，溶化取用后立即放回冰箱保存。連接緩沖液體積較大時，最好分小管貯存，防止反復凍融引起ATP分解，從而導致連接實驗的失敗。與限制性內切酶緩沖液不同的是，含ATP的連接緩沖液長期放置后往往失效，所以也可自行配制不含ATP的緩沖液（可長期保存），臨用時加入新配制的ATP母液。PEG能提高T4 DNA連接酶的連接效率，所以有些產品會在緩沖液中加入一定濃度的PEG或者附帶有專門的含有PEG的緩沖液。
通常在連接反應中使用的DNA濃度比酶單位定義的底物濃度低10～20倍，因此，黏性末端DNA連接的酶用量在0.1單位時就可以達到很好的連接效果。由于大多廠商提供的連接酶濃度往往是高濃度的，從這個意義上講，常規的黏性末端的連接反應體系中酶量的加入往往是過量的。有些廠商會提供低濃度和高濃度的連接酶產品，進行黏性末端連接時需先行稀釋，稀釋液的成分與酶保存緩沖液相同或類似，稀釋液中的酶能在長時間保持活力，也便于隨時取用。平末端的連接效率比黏性末端連接的效率低，所以酶用量要比黏性末端連接大10倍以上，并使用低濃度的ATP，延長連接反應的時間。
在實際的連接實驗中，很多因素包括實驗操作的因素都會影響到連接的重組率或成功率，相對小片段的連接會比大片段的連接容易，因此很多影響連接成功的因素容易被忽略。在實際的連接實驗中也發現5 kb以下載體和3 kb以下的片段相互連接很容易，對于雙酶切處理的載體甚至不需要進行回收純化都可以很容易獲得理想連接結果；而大于15 kb以上的載體和外源片段的連接，或者要克隆8 kb以上的片段，連接就會變得十分困難。因此，從某種程度上來說，在遵循原則的條件下，經驗的積累比嚴格按照數據計算來確定連接反應中載體和模板DNA的濃度顯得更為有效。實際上離子濃度、EDTA、雜蛋白和存留有活性的酶，特別是去磷酸化酶等影響酶切的因素多會影響到連接的效果，尤其在大片段DNA的連接中，高質量的酶及化學試劑顯得更為重要。一些操作也會影響到連接的效果，例如，對載體的回收純化大多數都是采用瓊脂糖凝膠電泳進行，瓊脂糖的質量不僅影響到DNA的回收率，而且它含有一些多糖能夠和DNA結合，在電泳膠回收時DNA不容易被去除，并會對后續的DNA連接反應產生影響，而且回收的過程對DNA黏性末端也會有損傷。所以對于大片段DNA而言，使用純度較高的瓊脂糖對于后續大片段DNA的連接也是十分重要的。此外，平端的連接對離子濃度很敏感，回收的時候多洗滌，可以采取添加PEG，減少ATP的用量和擴大酶量，22℃連接2 h后再4℃連接過夜，盡可能縮小連接反應的體積（最好不超過10μL，在5～6μL最佳）等措施。