第一節 限制性核酸內切酶
限制性核酸內切酶（restriction endonuclease）簡稱限制性內切酶，有時也簡稱內切酶，是一類能從DNA分子中水解磷酸二酯鍵，從而切斷雙鏈DNA的核酸水解酶。它們不同于一般的脫氧核糖核酸酶（DNase），它們具有特定的核苷酸識別序列，酶切位點大多很嚴格，是體外剪切DNA片段的重要工具。
一、限制性內切酶的發現
限制性核酸內切酶的發現得益于對細菌限制和修飾現象（restriction and modification，簡稱R/M體系）的研究。在20世紀60年代，當人們在對噬菌體的宿主特異性的限制-修飾現象進行研究時就注意到這樣的現象：大多數的細菌對噬菌體的感染都存在一定的障礙（限制），即幾乎沒有一種噬菌體能感染兩種不同的細菌；某一種噬菌體感染某一細菌受到限制，但是當其感染后的子代噬菌體再重新感染同一菌株就不會再受到限制（表3-1），這種現象當時稱作寄主控制的專一性（host controlled specificity）。
表3-1 噬菌體感染不同菌株的感染率
細菌限制和修飾這種現象的分子生物學研究發現該現象是由兩種酶所決定的，并提出限制性內切酶和限制酶的概念，隨后從E.coli K中首次分離出限制性內切酶EcoB、EcoK。限制性內切酶和修飾酶的發現很好地解釋了細菌的限制和修飾現象，細菌可以抵御新病毒的入侵，而這種“限制”病毒生存的辦法則可歸功于細胞內部可降解外源DNA的限制性內切酶，而重新感染不受到限制則歸功于修飾的甲基轉移酶。例如，噬菌體λ（B）感染菌株K時由于受到EcoK核酸酶的攻擊，感染受到限制，菌株K得到保護。但是當進入菌株K所有的λ（B）被降解前可能受到了甲基化修飾，因而在菌株K內產生所有的子代的噬菌體都是受到甲基化修飾的，所以當噬菌體λ（B）的子代噬菌體再次感染菌株K時就不會受到EcoK核酸酶的攻擊，因而沒有感染受到限制。
微生物細胞內的限制性內切酶通常伴隨一到兩種修飾酶（甲基化酶），它起到保護細胞自身的DNA不被自身限制性內切酶破壞的作用。修飾酶識別的位點與相應的限制性內切酶相同，但其作用并不是切開DNA鏈，而是甲基化每條DNA鏈中的一個堿基。甲基化所形成的甲基基團能伸入到限制性內切酶識別位點的雙螺旋的大溝中，阻礙限制性內切酶發揮作用，從而保護了DNA不被內切酶切割。這樣，限制性內切酶和它的“搭檔”修飾酶一起組成限制-修飾（R-M）系統。在一些R-M系統中，限制性內切酶和修飾酶是兩種不同的蛋白，它們各自獨立行使自己的功能；另一些R-M系統本身就是一種大的限制-修飾功能復合酶，由不同亞基或同一亞基的不同結構域來分別執行限制或修飾功能。
1965年阿爾伯首次從理論上提出了生物體內存在著一種具有切割基因功能的限制性內切酶，并于1968年首次從E.coli K中分離出Ⅰ型限制性內切酶EcoB和EcoK。1970年美國約翰·霍布金斯大學的史密斯于偶然中發現，流感嗜血桿菌（Haemophilus influ-enzae）能迅速降解外源的噬菌體DNA，其細胞提取液也可降解E.coli的DNA，但不能降解自身DNA，從而找到HincⅡ（HindⅡ）限制性內切酶。這是首次分離出了Ⅱ型限制性內切酶；同年內森斯使用Ⅱ型限制性內切酶首次完成了對基因的切割。HincⅡ限制性內切酶位點和切割位點如下：
從此以后，越來越多的限制酶被純化和分類，并且許多種類已經在實踐中得到應用。1986年下半年發現600多種限制酶和近百種甲基化酶，到1998年純化分類的3000多種限制性內切酶中，有30%是New England Biolabs（NEB）公司發現的，已發現的限制性內切酶中超過200種有特異識別序列。目前商業化的限制酶超過500種，其中包括來源于大腸桿菌的EcoRⅠ和EcoRⅡ，以及來源于Heamophilus influenzae的HindⅡ和HindⅢ，它們成為在基因操作實驗中廣泛使用的限制性內切酶。更詳細的內切酶相關信息推薦到NEB的官方網站上查詢。
二、限制性內切酶的種類
隨著越來越多的限制性內切酶被發現，以及更多內切酶的蛋白被測序表明，限制性內切酶的變化多種多樣，若從分子水平上分類，應當遠遠不止我們現在知道的三種。例如從大小上來說，它們可以小到如PvuⅡ由157個氨基酸組成，也可以比1250個氨基酸的CjeⅠ更大。因此傳統上限制性內切酶的分類是將限制性內切酶按照亞基組成、酶切位置、識別位點、輔助因子等因素劃分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三大類，雖然也有分出 Ⅳ型的說法，但是現在大多主張分為前三類。
Ⅰ型限制性內切酶有識別位點，但沒有特定的酶切位點，在分子結構上它是多個亞基組成的蛋白復合體，兼有限制性內切酶和修飾酶活性，能識別專一的核苷酸順序，并在識別點附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，而是隨機的。類型Ⅰ的限制與修飾系統種類很少，只占1%左右，如EcoK和EcoB，是由R亞基和M亞基兩個亞基組成，并各作為一個獨立亞基存在于酶分子中，分別執行限制酶和甲基化酶功能。此外，還有負責識別DNA序列的S亞基，分別由hsdR、hsdM和hsdS基因編碼，屬于同一個操縱子控制，EcoK編碼基因的結構為R2M2S,EcoB編碼基因的結構為R2M4S2。
EcoB酶的識別位點如下，鏈中的A*為甲基化位點，N表示任意堿基。
TGA*（N）8TGCT
EcoK酶的識別位點如下，鏈中的A°為可能的甲基化位點。
AA℃（N）6GTGC
但是EcoB酶和EcoK酶的切割位點在識別位點1000 bp以外，且無特異性。
以前人們認為Ⅰ型限制性內切酶是很稀有的，但現在通過對基因組測序的結果發現，這一類酶其實很常見。由于Ⅰ型限制性內切酶沒有固定的酶切位點，切割長短不一而無特異性，不產生確定的限制性片段和明確的跑膠條帶，無法用于分析DNA結構或克隆基因，在DNA重組技術或基因工程中沒有多大用處，因而盡管Ⅰ型酶在生化研究中很有意義，在基因操作中不具備實用性。
Ⅱ型限制與修飾系統在細菌中所占的比例最大，達93%，Ⅱ型限制性內切酶能識別專一的核苷酸順序，并在識別的序列順序的內部或者外部的固定位置上切割雙鏈DNA。從分子結構上來說Ⅱ型酶是最簡單的，一般是同源二聚體（homodimer），由兩個彼此按相反方向結合在一起的相同亞單位組成，每個亞單位作用在DNA鏈的兩個互補位點上。修飾酶是單體，修飾作用一般由兩個甲基轉移酶來完成，分別作用于其中一條鏈，但甲基化的堿基在兩條鏈上是不同的。Ⅱ型限制酶識別回文對稱序列，在回文序列內部或附近切割DNA，產生帶3′-OH和5′-磷酸基團的DNA產物，需Mg2+的存在才能發揮活性，相應的修飾酶只需S-腺苷甲硫氨酸（SAM）。Ⅱ型限制性內切酶識別序列主要為4～6 bp，或8 bp以上且呈二重對稱的特殊序列，但有少數酶識別更長的序列或簡并序列，有些酶識別序列是隔開的，切割位置因酶而異。
在Ⅱ型限制性內切酶中存在一些特殊的類型，比如FokⅠ和N.AlwⅠ，它們在識別位點之外切開DNA。這些酶相對分子質量大小居中，約為400～650個氨基酸左右，它們識別連續的非對稱序列，有一個結合識別位點的域和一個專門切割DNA的功能域。這類酶一般被分為Ⅱs型（typeⅡs），約占5%。Ⅱs型內切酶與Ⅱ型內切酶具有相似的輔因子要求，但識別序列是非對稱，也是非間斷的，長度為4～7 bp，切割位點可能在識別位點一側的20 bp范圍內。一般認為這些酶主要以單體的形式結合到DNA上，但與臨近的酶結合成二聚體，協同切開DNA鏈，因此一些Ⅱs型的酶在切割有多個識別位點的DNA分子時，活性可能更高。
在Ⅱ型限制性內切酶中還有一個特殊的類型，該酶僅僅切割雙鏈DNA中的一條鏈，造成一個切口，這類限制酶也稱切口（或切刻）內切酶（nicking endonuclease），如N.BbvCⅠA識別序列和切割位點如下：
為了區分，這類酶在命名時前面要加一個N。
Ⅱ型限制性內切酶的識別和切割的核苷酸都是專一的，所以總能得到同樣限制性酶切DNA片段，切割長短是固定，電泳可以獲得明確的電泳條帶，這種限制性內切酶是DNA重組技術中最常用的工具酶之一，是商業化酶的主要部分。
除了Ⅰ型和Ⅱ型內切酶外，還有一類界于Ⅰ與Ⅱ之間的Ⅲ型限制性內切酶，例如EcoPⅠ，在細菌中含量很少所占比例不到1%。Ⅲ型內切酶是一類集限制和修飾功能于一體的酶，相對分子質量較大，通常由850～1250個氨基酸組成，由M和R兩個亞基組成蛋白質復合物，其中M亞基具有識別與修飾的功能，R亞基具有核酸酶的活性。Ⅲ型內切酶需要在Mg2+以及輔助因子ATP和SAM的條件下才能呈現對DNA分子的切割活性。有些Ⅲ型內切酶在反應過程中可能會沿著DNA分子移動，并從識別序列的一側單鏈切割DNA，如EcoP1和EcoP15，它們的識別序列分別是AGACC和CAGCAG，切割位點則在下游24～26 bp處，由于是單鏈切割，很少能產生完全切割的DNA片段；而另一些Ⅲ型內切酶，如BcgⅠ，識別序列為CGANNNNNNTGC，在識別位點的兩端切開DNA鏈，產生一小段含識別序列的片段。這些酶的氨基酸序列各不相同，但其結構組成是一致的，與Ⅰ型一樣，Ⅲ型內切酶識別序列是不連續的，切割位點是不固定，因此不產生特異性的限制性DNA片段電泳條帶，在基因操作中不具備實用性。
三種類型的內切酶比較見表3-2。
表3-2 三種類型內切酶的比較
在基因操作中所說的限制性內切酶或修飾酶，除非特指，一般均指Ⅱ型酶。
三、限制性內切酶的命名
按照國際命名法，限制性內切酶屬于水解酶類。其分布極廣，幾乎在所有細菌的屬、種中都發現至少一種限制性內切酶，多者在一個屬中就有幾十種，例如，在嗜血桿菌屬中（Haemophilus）現已發現的就有22種。為了避免限制性內切酶的混淆，1973年，Smith和Nathans對內切酶的命名提出建議，以對限制性內切酶命名進行規范，1980年，Roberts對限制性內切酶的命名進行分類和系統化?，F在通用的命名原則是：
名稱由3～4個字母組成，方式是：屬名+種名+株名+序號。
第一個字母，斜體，大寫，取自來源細菌屬名的第一個字母。
第二字母，斜體，小寫，取自來源細菌種名的第一個字母。
第三字母，斜體，小寫，取種名的第二個字母，且小寫；若種名有詞頭，且已命名過內切酶，則取詞頭后的第一字母代替。
第四字母，若有株名，株名則作為第四字母，是否大小寫，根據原來的情況而定。
順序號，若在同一菌株中分離了幾個限制性核酸內切酶，則按先后順序用羅馬數字Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，……來代表。
如限制性內切酶HindⅢ，Hin指來源于流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae），d表示來自菌株Rd，Ⅲ表示序號（表3-3）。以前在限制性內切酶和修飾酶前加R或M，且菌株號和序號小寫，但現在限制性內切酶名稱中的R省略不寫。
表3-3 限制性核酸內切酶的命名實例
四、Ⅱ型限制性內切酶的序列識別特性
Ⅱ型限制性核酸內切酶識別序列的長度一般為4～8個堿基，最常見的是4個或6個堿基，少數也有識別5個或者7、9、10、11個堿基的。某一DNA含有某一內切酶識別位點的理論個數與內切酶識別堿基的個數、堿基組成及DNA的堿基組成有關，可以進行估算。
如果識別位置在DNA分子中分布是隨機的，不考慮內切酶和DNA的堿基組成，那么每隔4n bp（n，酶識別序列的長度）就有一個識別位點，就是說限制性內切酶識別的堿基數決定了當一種DNA分子被這種酶降解后的片段的大小。如當識別序列為4個和6個堿基時，平均每44=256個和46=4096個堿基中會出現一個識別位點，通過公式計算就可以預測一段DNA可能被切割成多少個片段，但這只是理論的估算。實際上，很多物種的（G+C）%含量都不是等于50%的，因此DNA序列中四種堿基不是完全相等的，識別相同堿基數的不同的內切酶，在同一DNA序列上的出現的頻率是不一樣的。
例如，某一段DNA序列的（G+C）%含量為60%，用同樣是識別6個堿基的內切酶KpnⅠ和EcoRⅠ來切割，兩個酶的識別序列在這一序列上出現的頻率是不一樣的，得到的片段數目也不一樣?？梢酝ㄟ^以下方法計算得到。
KpnⅠ和EcoRⅠ的識別序列分別是AGGCCT和GAATTC。
（G+C）%含量為60%得知各堿基含量：A%=T%=20%，G%=C%=30%，
序列AGGCCT出現的頻率為：
1/（20%A×30%G×30%G×30%C×30%C×20%T）≈3086；
序列GAATTC出現的頻率為：
1/（30%G×20%A×20%A×20%T×20%T×30%C）≈6944。
由上可知，在（G+C）%含量為60%的DNA序列上，識別序列AGGCCT的KpnⅠ大約3086 bp就會出現一個識別位點，而識別序列GAATTC的EcoRⅠ大約6944 bp才會出現一個識別位點，兩者相差1倍以上。
不同限制性內切酶具有自己特異性的識別序列，大多數Ⅱ型限制性內切酶都以同源二聚體的形式結合到DNA上，因而Ⅱ型內切酶的識別序列一般都是對稱回文結構序列，但有少數的酶是以一單聚體結合到DNA上，其識別序列為非對稱序列，如MboⅡ。
一些Ⅱ型限制性內切酶識別的序列是連續對稱回文結構，如EcoRⅠ識別序列為GAATTC；而一些酶識別是不連續的對稱回文結構序列，如BglⅠ識別的序列為GCC-NNNNNGGC（N為任意堿基），但其真正具有特征的識別序列是GCC和GGC。
一些Ⅱ型限制性內切酶識別的序列中的一個或幾個堿基是可變的，如HaeⅡ識別序列為RGCGCY（R=A或G,Y=C或T）[2]，這類內切酶稱為可變酶，它們識別序列的長度往往≥6個堿基。
一些識別簡并序列的限制酶包含了另一種限制酶的功能，如EcoRⅠ識別和切割位點為G↓AATTC,ApoⅠ識別和切割位點為R↓AATTY（R=A或G,Y=C或T），因此ApoⅠ可識別和切割EcoRⅠ的序列，這種現象也稱為“同功多位”。
一種酶的識別序列包含于另一些酶的識別序列之中的內切酶稱為嵌套酶（Subset酶）。如BamHⅡ的識別序列是GGATCC,Sau3AⅠ識別的是BamHⅠ識別序列中間的GATC 4個堿基。
Ⅱ型限制性內切酶對DNA的切割位置大多數在識別序列內部，例如EcoRⅠ的識別序列和切割位點為
，它切割雙鏈DNA的兩個切點都在識別序列的內部。有些內切酶的切割位置在識別序列的外部，切割位置在識別序列外部的又可以分成在兩端、兩側和單側。在兩端是指酶切割雙鏈DNA的位點分別在識別序列最外一個堿基的外側，例如Sau3AⅠ
；在兩側是指切割雙鏈DNA的兩個切點分別在識別序列的兩側，例如
，其切割位點與識別序列有一個以上的堿基分割；在外側是酶切點雙鏈DNA的兩個切點都是在識別位序列位點外的一側，例如BbvⅠ和HgaⅠ等。切割位點在兩側的內切酶還有一類特殊的，與其他酶不同，它們不是只產生一個斷點，而是在識別位點的兩側各切開一個斷點，并得到一段DNA小片段，例如BcgⅠ和BsaXⅠ等。識別位點與切割位點不一致，且切割點在識別位點外側10個堿基左右，如MboⅡ切割位點在下游第8個堿基，FokⅠ切割位點在識別位點下游第9個堿基。這類識別位點與切割位置不一致的內切酶被稱為遠距離裂解酶（distant cleavage）。
五、Ⅱ型限制性內切酶的切割特性
識別序列為對稱回文結構序列且切割位點在識別序列內的內切酶（平端酶除外），切割雙鏈DNA后形成兩條單鏈帶有幾個伸出核苷酸的切口，它們之間正好互補配對，這樣的切口叫黏性末端（cohesive end），這樣形成的兩個末端是相同的，也是互補的。黏性末端可以分為5′黏端和3′黏端，在對稱軸5′側切割產生5′黏端，如EcoRⅠ；在對稱軸3′側切割產生3′黏端，如PstⅠ。兩種不同的限制性內切酶切割后存在以下3種情況：
①識別序列不同，切割位點不同，產生酶切片段的末端不同，如EcoRⅠ和PstⅠ；
②識別序列相同，但是切割位點不同，產生酶切片段的末端不同，如KpnⅠ和Asp718Ⅰ；
③識別序列不同，但是切割位點相同，產生酶切片段的黏性末端是相同的，如BglⅡ和BamHⅠ。切割能產生相同黏性末端的內切酶被稱為同尾酶（isocaudiners），同尾酶產生的黏性末端可以進行黏性末端連接，但是連接后產生的新序列不能都被原來的酶識別。
注意：所有平端酶產生的末端均是相同的，并可以相互進行連接，但一般不把它作為同尾酶來研究，所以平端酶不能被稱為同尾酶。
來源不同、命名也不同的限制酶具有相同的識別序列和切割位點，產生相同末端的內切酶稱為同裂酶（isoschizomer）或異源同工酶，例如，HpaⅡ和MspⅠ來源不同，識別序列和切割位點均為C↓CGG。對于同裂酶的定義存在著不同觀點，有觀點認為來源于不同微生物，但能識別相同DNA序列的限制性內切酶，切割位點可以相同也可以不同。如Acc65Ⅰ和KpnⅠ的識別序列均為GGTACC，但它們的切割位點不同，分別為GGTAC↓C和G↓GTACC，它們也被稱為同裂酶；SmaⅠ和XmaⅠ它們識別序列均為CCCGGG，但SmaⅠ切后產生平末端，而XmaⅠ切后產生黏性末端，它們也被稱為同裂酶。也有觀點認為同裂酶應該分為完全同裂酶和不完全同裂酶，像HpaⅡ和MspⅠ有相同的識別序列和切割位點是完全同裂酶；而有相同的識別序列，但切割位點不同是不完全同裂酶，也稱異工酶。在國內外的資料，同裂酶的英文以isoschizomer表示占絕大多數，只有極少數國內資料將其表示為isocaudomer，對前面所提的不完全同裂酶，國外都一致稱為neoschizomer。
同裂酶之間的性質有所不同，如對離子強度、反應溫度以及對甲基化堿基的敏感性等方面可能有所差別，有一些同裂酶對于切割位點上的甲基化堿基的敏感性有所差別，可用來研究DNA甲基化作用。
一些內切酶在識別序列的回文對稱軸處同時切割DNA的兩條鏈，斷裂DNA的末端為平末端，如HaeⅢ（GG↓CC）、SmaⅠ（CCC↓GGG）和EcoRⅤ（GAT↓ATC），這類限制性內切酶也稱為平端酶。不同平端酶產生的DNA平末端是相同的，可任意相互連接，但連接效率較黏性末端低。
有些內切酶識別序列的堿基數為奇數的非對稱序列，如BbvCⅠ，它的識別序列和切割位點為CC↓TCAGC，其切割的DNA產物的末端為非對稱的序列。
能識別簡并序列的可變酶，其識別序列中可能有非對稱的序列，切割DNA產物可以產生非對稱末端。如AccⅠ，它的識別序列和切割位點為GT↓MKAC（M=A或C,K=G或T），由于識別堿基可變的，也就是說它可識別4種序列，其中GTAGAC和GTCTAC都為非對稱序列，而GTCGAC和GTATAC是對稱的。
識別序列為間隔的不連續序列的內切酶，如DraⅢ，其識別序列和切割位點為CACNNN↓GTG，間隔區域的序列是任意堿基的，切割DNA產物也可以產生非對稱末端。
切割位置在識別序列外部的內切酶，如EarⅠ，其識別序列切割位點分別是
，切割DNA產物可以產生非對稱末端。
需要注意的是，如果內切酶識別序列是連續的且切割位點在識別序列內部的，它切割不同DNA的末端是可以相互連接的。如果是能識別簡并序列的可變酶、識別間隔序列的內切酶和切割位置在識別序列外部的內切酶，由于存在堿基的可變性，它們切割不同DNA產生的末端有可能是不相同的，這時是不能相互連接的。
六、限制性內切酶對其他基質DNA的作用
研究發現有些限制性內切酶除了分解雙鏈DNA分子，還能夠降解其他類型的核酸分子。EcoRⅠ、HindⅢ、SalⅠ、MspⅠ、AluⅠ、TaqⅠ和HacⅡ等能分解DNA-RNA雜交分子；Hha l、Sfa l、MbaⅡ、HinfⅠ、HpaⅡ、PstⅠ、BluⅠ、AvaⅠ、HacⅡ、DdeⅠ、Sau3AL、AccⅡ和Hpa l等能切割單鏈DNA。目前還沒有發現AluⅠ、BbvⅠ、DpnⅠ、FnuDⅡ、FokⅠ、HpaⅡ、Hph、MboⅠ、MboⅡ、MspⅠ、Sau3AⅠ和SfaNⅠ能切割單鏈DNA的活性。雖然有些內切酶能降解單鏈DNA，但其效率和穩定性都較差，如HhaⅠ、HinP1Ⅰ和MnlⅠ切割單鏈DNA的效率是雙鏈DNA的50%，HaeⅢ切割單鏈DNA的效率是雙鏈的10%，而BstNⅠ、DdeⅠ、HgaⅠ、HinfⅠ和TaqⅠ切割單鏈DNA的效率是雙鏈的1%。
在分子水平上來看，內切酶幾乎不可能識別并切開單鏈DNA，而某些內切酶之所以能夠降解單鏈DNA，一般認為是因為這些內切酶識別了這些單鏈DNA上多個回文結構之間堆積形成的暫時性雙鏈結構。因此，內切酶對單鏈DNA的切割受很多因素的影響，這些因素包括：DNA上識別位點的數目，這些位點之間的距離，單鏈DNA堆積形成二聚體的穩定性（富含GC的底物要比富含AT的單鏈DNA底物切割效率高），以及在識別位點之外有多少個保護堿基序列，等等，因此內切酶對單鏈DNA的切割穩定性和重復性差，在基因重組中沒有太多實際用途。
七、Ⅱ型限制性內切酶的星號活性
內切酶星號活性（star activity）也稱為次級活性或者第二活力，其定義為：在非標準的反應條件下，內切酶切割與識別位點相似但不完全相同的序列，得到不同的酶解片段的酶活性稱為星號活性。酶的星號活性在酶的名稱右上角加一個星號（*）表示，如EcoRⅠ*。
EcoRⅠ的星號活性實例：
正常：識別GAATTC 6個核苷酸序列。
異常：可識別AATT 4個核苷酸序列。
現象：酶切產物電泳出現的DNA條帶數比正常情況下多。
有觀點認為，這種星號活性可能是內切酶的一種普遍特性，如果提供相應反應條件，所有內切酶都會出現非特異性切割。產生星號活力的實質是：單堿基替換、識別序列外側堿基縮短以及單鏈切割。早期研究表明，在低鹽濃度、高pH條件下，EcoRⅠ可能切割NAATTN序列；后來研究表明，只要識別中心的四堿基序列AATT，不出現A/T替換，它可以切割其他任何單堿基替代序列。
NEB已證實下列酶存在星號活性，ApoⅠ、AseⅠ、BamHⅠ、BssHⅡ、EcoRⅠ、EcoRV、HindⅢ、HinfⅠ、PstⅠ、PvuⅡ、SalⅠ、ScaⅠ、TaqⅠ、XmnⅠ。
容易產生星號活性的因素主要有以下幾方面：
①甘油濃度過高，較高的甘油濃度是引起星號活性的常見原因。甘油濃度以體積分數表示，有些酶在甘油濃度＞5%時就引起信號活性；在限制性內切酶的濃度與DNA數量的比值為50 U/μg DNA時，甘油的含量為7.5%，便能引起星號活性；當用酶濃度較低至10 U/μg DNA時，甘油含量高于15%或以上，也會引起星號活性。
②酶與底物DNA比例過高，會引起星號活性。不同的酶，比例不同，通常酶用量＞100 U/μg DNA時就可能引起星號活性?？梢妼嶒炛袘褂帽M量少的酶，這樣可以避免過度消化；也可以降低甘油濃度，加酶量一般不超過反應體積的10%。
③離子強度也有影響。不合適的低鹽濃度（＜25 mmol/L）會引起星號活性。
④陽性離子的變化也有影響。Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等陽離子替換Mg2+會引起星號活性，如將反應緩沖液中Mg2+改為Mn2+時，可促使EcoRⅠ和HindⅢ產生星號活性。
⑤溶液中pH的變化，高pH（＞pH 8.0）時容易引起星號活性，如用EcoRⅠ酶解時，反應體系中的pH由2.5升高到8.5時也會出現星號活性。
⑥有機溶劑殘留的影響，DMSO、乙醇、乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、Sulphalane等有機溶劑的存在都可以引起星號活性。
由此可見，只有在相當特殊的條件下，才會產生星號活性，而在正常條件下，使用酶配套的緩沖液，一般的內切酶就不會出現星號活性。抑制星號活性的方法有：盡量用較少的酶進行完全消化反應，這樣可以避免過度消化以及過高的甘油濃度；盡量避免有機溶劑（如制備DNA時引入的乙醇）的污染；將離子濃度提高到100～150 mmol/L（若酶活性不受離子強度影響）；將反應緩沖液的pH降到7.0，二價離子用Mg2+等。
八、DNA的分子結構及構型對酶切效率的影響
DNA分子結構對限制性內切酶的活性有很大影響，例如，HaeⅢ，EcoRⅠ，MSPⅠ和HindⅢ需要酶切位點呈雙鏈狀態，并且至少有兩圈雙螺旋結構才能被切割，即使有些酶能分解單鏈DNA，其切割位點仍然需要呈雙鏈分子結構。
限制性內切酶切割線性DNA時，對識別序列兩端的非識別序列也有長度的要求，也就是說在識別序列兩端必須有一定數量的核苷酸，否則限制性內切酶將難以發揮切割活性。用20個單位（units）限制性內切酶切割1 mg標記的寡核苷酸做測試時，發現不同的酶對識別序列兩端的長度有不同的要求（表3-4）。相對來說，EcoRⅠ對兩端的序列長度要求較小，在識別序列外側有一個堿基對時，2 h的切割活性可達90%，而AccⅠ和HindⅢ對兩端的序列長度要求較高。用線性DNA片段（線性載體）檢測末端長度對切割的影響時，同樣發現識別序列的末端長度對酶切效率有明顯影響，且不同的酶對末端長度的要求是不同的。因此在設計PCR引物時，如果要在5′末端引入一個酶切位點，為了保證能夠順利切割擴增的PCR產物末端的酶切位點，必須要在引物的5′末端加上能夠滿足酶切要求的堿基數目，也稱保護堿基。
表3-4 DNA末端長度對酶切效率的影響
由于末端長度對酶切效率的影響，對于多克隆上相鄰酶切位點，選擇不同的酶組合及不同的酶切順序，酶切效率會有很大的差異。例如，下面一質粒多克隆上XhoⅠ、EcoRⅠ和PstⅠ三個相鄰酶切位點（圖3-1），用不同的酶組合和不同酶切順序，酶切效率不同。
圖3-1 XhoⅠ、EcoRⅠ和PstⅠ三個酶切位點相鄰
如果第一次酶切用EcoRⅠ，酶切效率為100%，第二次用XhoⅠ，酶切效率為97%；而如果第二次用PstⅠ，則酶切效率只有37%。如果第一次用XhoⅠ，酶切效率為100%，第二次用EcoRⅠ，酶切效率為100%；如果先用PstⅠ，再用EcoRⅠ進行酶切，其效率則只有88%。可見對于多克隆位點，如果兩個內切酶的位點相臨近，要進行雙酶切時，不同酶切順序，酶切效率會有很大的差異，了解末端長度對切割的影響還可幫助在雙酶切多克隆位點時選擇合適酶切順序和合適的組合。
DNA的超螺旋結構對酶切效率也有影響，完全酶解超螺旋結構DNA所需的酶量要比已經酶切成線性的DNA所需的酶量多，不同的限制內切酶受超螺旋結構影響的程度不同，如SalⅠ受影響大于BamHⅠ（表3-5）。
表3-5 不同酶受超螺旋結構的影響
九、內切酶的位點優勢效應
某些限制性內切酶對同一DNA分子上的多個識別位點的切割效率不同，這種現象被稱為內切酶的位點優勢效應。例如，λDNA分子上有5個EcoRⅠ識別位點，然而EcoRⅠ并不是隨機切割λDNA分子上的5個識別位點，λDNA右側位點的切割速率比中間位點快10倍；HindⅢ對λDNA不同位點的切割速率則有14倍的差異；SacⅡ在λDNA上有4個識別位點，其中3個位于序列中間，1個位于靠近右末端（第40，386位堿基），中間3個位點的切割速率是末端位點的50倍。
位點優勢效應與限制性內切酶的特性有關，有些酶只能切割含有兩個識別序列的雙鏈DNA分子。例如，BspMⅠ、SfiⅠ和NgoMIⅤ為同源四聚體蛋白，它們結合2個識別序列，并兩條鏈同時切開4個磷酸二酯鍵。這些酶的底物DNA分子上必須有兩個識別位點，當只有一個識別序列時，切割就變得相當困難。只能切割含有2個識別序列DNA分子的現象雖不是很普遍，但在Ⅱs型內切酶中還是相當常見的，這些酶通常情況下為單體，但切割兩條鏈DNA時會很快結合形成二聚體，這些酶包括FokⅠ、BsgⅠ、BpmⅠ和MboⅡ。另外一些酶，如EcoRⅡ和NaeⅠ所需的兩個識別位點中，一個位點作為目標被切割，另一位點作為變構因子協助切割。對這些酶而言，第二個協助切割的位點可以在底物DNA上，也可以以寡核苷酸的形式存在。HpaⅡ、NarⅠ和SacⅡ在某些底物的一些位點切割效率很低，或是干脆無法切開，其作用機制尚不明了。NaeⅠ、NarⅠ和BspMⅠ很難被切開只有一個識別位點的質粒，pBR322質粒上有4個NarⅠ識別位點，在標準條件下，1單位的NarⅠ在1 h內就可以完全切開其中的兩個位點，即使加入50單位的NarⅠ消化超過16 h也不能將另外的2個位點完全切開。同樣的，pBR322質粒上的4個NaeⅠ識別位點中，有兩個很容易被切開，第三個被切開的速率較慢，而剩下的一個最難，切割速率僅為前者的1/50。NaeⅠ和NarⅠ在λDNA上各只有1個識別位點，即使加大酶的用量，它們也只能部分切開λDNA。因此，這些酶的活力單位的定義均以腺病毒-2的DNA為底物，它們在腺病毒-2上有10個以上的識別位點。例如，NarⅠ或NaeⅠ的活力單位定義為：50μL反應體系，1 h內完全切割1μg病毒-2的DNA所需要的酶量。
內切酶的位點優勢效應這一特性對于DNA的部分酶切非常重要，但其機制尚未完全明了，一般認為內切酶的位點優勢效應是與酶識別的序列的相鄰序列的堿基和長度有關，與甲基化無關。有報道稱腺病毒-2上的CTCGAG序列很難被PaeR7Ⅰ切開，卻很容易被PaeR7Ⅰ的同裂酶XhoⅠ切開，被認為是相鄰序列影響了酶的切割效率；CTCGAG的5′末端CT序列降低了PaeR7Ⅰ的切割效率，而甲基化不會影響切割效率。
十、甲基化對內切酶的影響
當從有Dam或Dcm甲基化酶基因的大腸桿菌中提取DNA，用相應的限制性內切酶進行切割時，有些內切酶的部分或全部酶切位點不能被切割，產生這一現象的原因是，當E.coli甲基化酶的識別位點與內切酶的識別位點重疊時，相應的堿基被甲基化，致使內切酶無法進行切割，例如，從dam+E.coli中分離的質粒DNA完全不能被識別序列為GATC的MboⅠ所切割。
大多實驗用大腸桿菌中都存在Dam、Dcm和M.EcoKⅠ三種位點特異性的DNA甲基化酶。Dam甲基化酶由dam基因編碼產生，它專一地將S-腺苷甲硫氨酸上的甲基轉移到GATC序列中腺嘌呤的N6上。Dcm甲基化酶，由dcm基因編碼產生，它專一地對CCAGG和CCTGG序列內部的胞嘧啶C5位置進行甲基化。EcoKⅠ甲基化酶，即M.EcoKⅠ，對AAC（N6）GTGC和GCAC（N6）GTT上的腺嘌呤進行修飾。由于在DNA隨機序列中EcoKⅠ的識別位點每8 kb才出現一次，Dam大約每256 bp出現一次，Dcm大約每512 bp出現一次，因此，應用時更多地關注Dam和Dcm的影響。
有些內切酶對Dam甲基化不敏感，如BamHⅠ，Sau3AⅠ，BglⅡ，PvuⅠ等。有些內切酶對Dam甲基化敏感，如BclⅠ，ClaⅠ，MboⅠ，XbaⅠ等。如XbaⅠ根據識別序列后續堿基的不同，有時會受甲基化影響。XbaⅠ的識別序列是TCTAGA，里面不含有Dam甲基化識別位點GATC，因此甲基化不影響XbaⅠ的切割，但是，如果識別位點前面是GA，即GATCTAGA，或者后面有TC，即TCTAGATC，這時候甲基化識別序列和內切酶的識別序列重疊了，那么該序列被甲基化后不會被XbaⅠ切開。從大腸桿菌提取的質粒DNA，因為識別序列被甲基化，不能被XbaⅠ切割，而如果是PCR產物，由于沒有被甲基化，就能XbaⅠ切割。因此在設計限制性內切酶酶切位點時也應考慮到內切酶甲基化影響，在使用內切酶時，應仔細閱讀內切酶使用說明書中關于受甲基化影響的詳細信息。
被Dam或Dcm甲基化的限制性位點可以通過克隆DNA至dam-/dcm-菌株而消除甲基化，從而可以被相應的內切酶切割。dam-/dcm-菌株有E.coli HST04、JM110和SCS110等。
在高等真核生物中發現的CpG甲基轉移酶（CpG MTases），將甲基基團轉移至胞嘧啶殘基的C5位點。CpG甲基化形式受遺傳因素的影響，具有組織特異性，并與基因表達相關。因此，在酶切真核基因組DNA時尤其要關注CpG甲基化對內切酶酶切效率的影響，一旦真核生物DNA被克隆到原核宿主菌中，將不存在CpG甲基化形式。
十一、限制性內切酶使用注意事項
限制性內切酶對熱不穩定，不太常用的酶多保存在-70℃，每周或每天用的酶保存在-20℃。有些酶需要不同的保存條件，所以商品酶都是按照產品說明書的要求進行保存。
為避免在-20℃條件下結冰及反復凍融使酶失活，商品酶一般用50%甘油作為酶的保護劑，因此加酶的體積不要超過反應總體積的1/10，避免酶活性受到甘油的影響產生星號活性。有些商品酶濃度很高，濃縮的限制酶可在使用前用1×的酶緩沖液稀釋，切勿用水稀釋以免酶失活，稀釋后的酶不能長期保存。準備使用的酶稍離心，然后直立放置于-20℃備用，使用時酶通常是最后加入，當加完所有的組分后再從-20℃取出酶，并直立放在冰上或者預冷-20℃的有孔的鐵塊上，取完酶立即旋緊蓋子放回于-20℃保存。手拿酶管時不要接觸酶管含酶的部分，移酶時盡可能用長的吸頭，避免污染。用完后需要及時送回原處。酶反復從-20℃拿出來會吸收空氣中的水分，使甘油和酶的濃度都發生改變，出現酶結冰的情況，所以取完酶應立即旋緊蓋子放回于-20℃保存，對于大包裝的內切酶最好分裝保存。
商品的內切酶一般會配有一種以上的緩沖液，一般按離子強度的差異分為高、中、低三種類型，不同的酶在不同類型的緩沖液中的活力不同，產品說明書會提供一個不同類型緩沖液下酶活力信息。如果要進行雙酶切時選擇合適的緩沖液就顯得至關重要了，如果兩種酶反應溫度一致而最高活力的緩沖液不同時，有些供應商還會提供一種通用緩沖液，也可查閱由供應商提供的各種酶在不同緩沖液中的活力表，如果有一種緩沖液能同時使2種酶的活力都超過50%的話，就可以用這種緩沖液作為雙酶切的反應緩沖液；若找不到共用的緩沖液，則可以先用低鹽的緩沖液進行第一種酶的反應，然后再加適量NaCl和第二種酶；或先用低鹽緩沖液再用高鹽緩沖液（DNA可純化或不純化），如果內切酶對離子濃度很敏感的可以考慮純化更換緩沖液。雙酶切時，若兩種酶切的條件不同，則分別進行兩次酶切，切完一次后，純化，再進行下一次酶切；反應溫度不同的，先進行低溫的酶切反應，再進行高溫的酶切反應；若鹽濃度要求不同，先在低鹽濃度下酶切，再在高鹽濃度下酶切。有些酶的緩沖液需要添加牛血清白蛋白（BSA）或明膠，其目的是對內切酶起保護作用，可以防止蛋白酶的分解和非特異性吸附等，能減輕某些有害環境因素，如加熱、表面張力及化學因素，引起的酶變性作用，在酶的保存液中或酶活性不夠穩定或長時間的酶反應體系中都加定量的BSA。由于BSA會與DNA結合，在電泳時會出現條帶模糊的拖尾現象，因此，在電泳前可加入適量的SDS，并置65℃保溫5 min后點樣，可以消除BSA的影響。
反應體積需要根據實驗目的來定，常規的酶切反應體積一般為10～50μL，鑒定的酶切體積為10～20μL，若酶切大量的DNA，可以將DNA分成幾部分進行酶切，然后分別電泳檢測，再混合進行下一步的實驗。反應混合物中DNA底物的濃度不宜太大，小體積中過高濃度的DNA會形成黏性溶液，抑制酶的擴散，并降低酶活性，濃度過低也會影響酶活性，建議酶切反應的DNA濃度為0.1～0.4μg/μL。酶的用量產品說明書會提供一個參考值，但是在需要使用高酶量的時候需要注意甘油的最終濃度不要超過5%，也就是說10μL的體積，酶的用量不要超過1μL。酶切反應的全部組分加完后，可用移液器的吸頭將反應液小心混勻，或用手指輕彈一下管壁，再在桌面離心機上低速稍離心（short spin）一下，使管內的液體全部離心到管底就可以下一步保溫了，一般不能使用振蕩器進行混勻。
大多數內切酶的反應溫度都是37℃，但也有許多例外的情況，例如，SmaⅠ是25℃，MaeⅠ是45℃，來源于耐熱菌的TaqⅠ最適反應溫度為65℃。反應溫度低于或高于最適反應溫度，都會影響內切酶的活性，甚至最終導致完全失活。例如，SmaⅠ的最適合溫度是25℃，37℃時酶仍表現出活性，但是其活性下降50%；TaqⅠ的最適溫度為65℃，37℃的活性僅為65℃的1/10。
反應時間的選擇，一般酶切鑒定30 min就可以了。要完全酶切可以采用少量的酶，長時間的反應，或較高的酶量，短時間處理。反應溫度高于37℃或需長時間保溫時，要注意水分蒸發會使反應體系中的反應體積變?。ǜ邷貢r甚至會變干），使各組分濃度發生改變，從而影響到酶切的效果。這時，可以使用封閉的恒溫系統進行保溫，減少體系上下的溫差，從而減少水分蒸發，也可以將礦物油覆蓋在反應液上以減少水分蒸發。
如果酶切只是為了電泳鑒定，不需要進行下一步實驗的，可直接用電泳上樣緩沖液來終止反應，然后立即進行電泳。如果要進行下一步酶切反應，需要進行內切酶的滅活。滅活的方法有加熱、乙醇沉淀、酚/氯仿抽提、添加EDTA或SDS、用試劑盒純化DNA等方法，加熱失活法終止反應（65～85℃，20 min）最為常用，但它并不適用于所有的酶，有些來自高溫菌的內切酶，由于其能夠耐受較高的溫度，熱處理不一定完全滅活，需要用苯酚/氯仿/乙醇抽提或者試劑盒方法進行純化。電泳回收也是實驗室常用的除酶的手段。具體到某種一種酶可能有些方法不能完全滅活，這一點需要注意，因此要根據自己的實驗要求選擇最合適和簡單的滅活方法。
限制性核酸內切酶酶切DNA的效率很大程度上取決于DNA本身的純度，純度高的DNA酶切效率高，純度低的DNA酶切效率低。如果由于DNA純度較低，在正常的酶切效率較低時，可以適當做如下補救：適當增加酶的用量，如每μg DNA由1個單位提高5～10倍，當然對于一些價格較昂貴的酶，從這種角度講也是一種損失，在實驗設計時要權衡考慮。適當擴大反應體積，可使污染物相應得到稀釋，減少污染物對酶活性的抑制；適當延長酶解的反應時間，但有DNase污染的DNA不能用此法；如RNA過多可在反應體系中加入適量的RNase來消除RNA的影響。
不同的內切酶特性差異很大，受甲基化影響程度不一樣，降解DNA的活力不一樣，是否具有位點優勢效應等特性都會影響到內切酶在實際基因重組實驗中的應用。雖然大多數內切酶都已經是基因重組產品，但由于不同的商品內切酶在表達和純化上的難度不一樣，價格差異很大，活力也不一樣，因此在實驗設計時要盡量考慮用活力較高、價格相對較便宜的內切酶。