第五節　聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠用于雙鏈DNA電泳的原理和瓊脂糖相似，但聚丙烯酰胺凝膠制備較復雜、困難，分離的范圍較窄。聚丙烯酰胺凝膠主要優點是分辨率高，能夠分辨相差1 bp的片段，可用于DNA測序和AFLP、微衛星等分子標記等檢測；聚丙烯酰胺回收的DNA樣品純度高，可用于嚴格的實驗，如引物合成和轉基因動物實驗時回收樣品；聚丙烯酰胺的機械強度高于瓊脂糖，不容易損壞。

一、聚丙烯酰胺凝膠電泳的種類

聚丙烯酰胺凝膠電泳按是否添加變性劑可以分為非變性聚丙烯酰胺凝膠（nondenaturing polyacrylamide gel）電泳和變性聚丙烯酰胺凝膠（denaturing polyacrylamide gel）電泳；如果按凝膠濃度是否連續可分為連續與不連續體系兩種，連續體系是指在整塊凝膠的性質是相同；不連續體系也稱梯度膠，整塊膠的性質（如變性劑濃度）不相同或電泳過程是不相同的。常用的聚丙烯酰胺凝膠電泳有以下幾種：

1.非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳是指不添加尿素和甲酰胺等變性劑的凝膠電泳，用于雙鏈DNA片段的分離和純化。

2.變性聚丙烯酰胺電泳

變性聚丙烯酰胺凝膠電泳是指添加尿素和甲酰胺等變性劑的凝膠電泳，用于分離和純化單鏈DNA片段。雙鏈DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝膠電泳時，其遷移行為決定于其分子大小和電荷，不同長度的DNA片段能夠被區分開，但同樣長度的DNA片段在膠中的遷移行為一樣，因此不能被區分。變性聚丙烯酰胺凝膠在一般的聚丙烯酰胺凝膠基礎上加入了變性劑（尿素和甲酰胺），從而能夠把同樣長度但序列不同的DNA片段區分開來，常用于DNA的測序。

3.變性梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳

變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE）的變性梯度凝膠是在6%聚丙烯酰胺凝膠中添加線性梯度的變性劑，變性劑的濃度由上到下、從低到高成線性梯度。變性梯度凝膠電泳是一種根據DNA片段的熔解性質而使之分離的凝膠系統。其原理是核酸的雙螺旋結構在一定條件下可以解鏈，稱為變性，核酸50%發生變性時的溫度稱為熔解溫度（Tm）。Tm主要取決于DNA分子中（G+C）%含量的多少。DGGE將凝膠設置在雙重變性條件下：溫度50～60℃，變性劑0～100%，當雙鏈DNA片段通過溫度（或變性劑濃度）呈梯度增加的凝膠時，此片段遷移至某一點溫度或變性劑濃度恰好使雙鏈DNA片段的解鏈區域解鏈時，此區便開始解鏈，而高熔點區仍為雙鏈。這種局部解鏈的DNA分子遷移率發生改變，達到與其他DNA分離的效果。

Tm的改變依賴于DNA序列，即使一個堿基的替代就可引起Tm的升高或降低，因此，DGGE可以檢測DNA分子中的任何一種單堿基的替代、移碼突變以及少于10個堿基的缺失突變。為了提高DGGE的突變檢出率，可以在一側引物的5′端加上一段30～40 bp的GC結構，這樣在PCR產物的一側可產生一個高熔點區，使相應的感興趣的序列處于低熔點區而便于分析，這樣處理可使DGGE的突變檢出率提高到接近于100%。

4.溫度梯度凝膠電泳系統

溫度梯度凝膠電泳（temperature gradient gel electrophoresis,TGGE）采用了DGGE變性梯度凝膠電泳系統的原理，但不使用化學變性劑梯度，操作更簡單、快速，便于重復。DNA上樣于含尿素的聚丙烯酰胺凝膠，電泳過程中逐步、均一地升高溫度，從而在電泳進行過程中產生一個線性的溫度梯度，變性環境即由凝膠中均一的尿素濃度加上時間溫度梯度形成。在這樣的環境中，雙鏈DNA分子之間的氫鍵變得熱力學不穩定，帶有突變的DNA片段表現出與野生型不同的解鏈行為，因此，通過電泳，同樣長度但序列不同的DNA片段就能區分開。TGGE可以篩選出發生單個或多個堿基突變的雙鏈DNA分子，為更加快速、準確地查找突變基因提供了一種先進技術。

二、聚丙烯酰胺凝膠電泳的檢測方法

1.EB檢測法

將凝膠浸于含0.5μg/mL EB的1×TBE溶液中，30～45 min后取出水洗，放紫外燈下觀察電泳結果。聚丙烯酰胺凝膠對EB的熒光有淬滅現象，而且其吸附EB的能力較強，因而染色后背景較高，使得其檢測靈敏度降低，只能檢出含量＞10 ng的DNA條帶，適合用于以DNA回收為目的的電泳。EB染色后用水漂洗一段時間再觀察，或者先把樣品和EB混合后再上樣電泳都可以降低背景。

2.銀染檢測

銀染時，還原劑將銀離子還原，形成黃色或黑褐色的DNA條帶。銀染檢測成本低、所用試劑安全、快速、靈敏度高，應用廣泛。目前有很多文獻報道不同的銀染方法，各方法對同一核酸樣品染色，其靈敏度和背景都會不同，所以當一種銀染不夠理想，可以嘗試另一種銀染方法，或者更換一下試劑。

聚丙烯酰胺凝膠電泳的其他檢測方法見第三節。

三、聚丙烯酰胺凝膠的DNA回收

如果回收的DNA片段用于PCR擴增，可將含有DNA條帶的聚丙烯酰胺凝膠切下，加適量的TE溶液，沸水上水浴5 min，冷卻至室溫，10000 r/min離心1 min，取適量上清液就可以作為PCR擴增的模板了。

如果電泳時上樣量足夠大，且要回收目的DNA片段需用于其他克隆操作，將切下的含有DNA條帶的聚丙烯酰胺凝膠在保鮮膜上充分碾碎，或者在液氮下進行碾碎，然后用適量的TE溶液65℃保溫30 min提取，再高速離心，取上清液用乙醇和醋酸鈉沉淀即得目的DNA。由于聚丙烯酰胺凝膠不能被溶解，充分碾碎對回收率的影響至關重要，有條件的可以利用液氮使聚丙烯酰胺凝膠充分碾碎。

目前在市場上已有一些專門針對聚丙烯酰胺凝膠的回收試劑盒，其原理和瓊脂糖凝膠回收試劑盒是一樣，也可以直接用一些PCR產物回收試劑盒或膠回收試劑盒來對聚丙烯酰胺凝膠中DNA進行回收，其關鍵點還是聚丙烯酰胺凝膠的充分碾碎，碾碎后和試劑盒中的DNA結合緩沖液進行結合，然后再進行下一步的純化。