任務(wù)1.3　色譜分離法

色譜法又稱層析法、色層法及層離法，是一種現(xiàn)代的物理化學(xué)分離分析方法。按色譜原理不同可 分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、凝膠過濾色譜和大孔樹脂色譜等。按色譜的操作形式不同可分為平面色譜[薄層色譜（TLC）、紙色譜（PC）]、柱色譜（CC）（吸附柱色譜、分配柱色譜、離子交換柱色譜、凝膠柱色譜等）和毛細(xì)管電泳色譜（CE）等。按流動(dòng)相的不同可分為液相色譜（LC）[液-固色譜（LSC）、液-液色譜（LLC）]、氣相色譜（GC）[氣-固色譜（GSC），氣-液色譜（GLC）]和超臨界流體色譜（SFC）。

1.3.1　吸附色譜

1.3.1.1　吸附色譜原理

吸附色譜是利用吸附原理，即利用吸附劑對(duì)天然藥物化學(xué)中各種成分吸附能力的差異，而使混合物中各成分得以分離的色譜方法。吸附劑的吸附作用主要由固體表面的吸附力、氫鍵絡(luò)合、靜電引力、范德華力等產(chǎn)生，吸附劑對(duì)各成分吸附能力的大小主要取決于吸附劑本身的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)、被吸附成分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)以及展開劑的極性大小。

1.3.1.2　吸附色譜分類

按照吸附劑吸附差異可以分為物理吸附、半化學(xué)吸附、化學(xué)吸附。物理吸附有硅膠、活性炭、氧化鋁、氧化鎂、硅酸鎂、碳酸鈣和硅藻土等。半化學(xué)吸附利用被分離物質(zhì)與吸附劑之間的氫鍵吸附能力差異進(jìn)行分離，吸附能力介于一般的物理吸附和化學(xué)吸附之間，常用的吸附劑是聚酰胺。化學(xué)吸附指吸附劑與固定相之間發(fā)生化學(xué)鍵合，從而破壞了色譜的展開。例如黃酮類等酸性成分被氧化鋁吸附，生物堿被酸性硅膠吸附等。在吸附色譜操作中要避免化學(xué)吸附。

按照吸附劑極性差異可以分為親水性吸附劑、親脂性吸附劑、既有親水性又有親脂性吸附劑。親水性吸附劑有硅膠、硅酸鎂、氧化鋁、聚酰胺、氧化鎂、碳酸鈣和硅藻土等。親脂性吸附劑常用的是活性炭。聚酰胺在用不同的溶劑展開或洗脫時(shí)表現(xiàn)出不同的吸附性。

1.3.1.3　吸附能力

親脂性吸附劑對(duì)極性小的化合物吸附能力強(qiáng)，親水性吸附劑對(duì)極性大的化合物吸附能力強(qiáng)。一般來(lái)說(shuō)，吸附劑從氧化鋁、氧化鎂、活性炭、硅酸鎂、硅膠、硅酸鈣到硅藻土吸附能力逐漸減弱。

親水性吸附劑的吸附能力與含水量關(guān)系密切，含水量越大，吸附能力越弱。為提高親水性吸附劑的吸附能力，去除所含水分，使其活性增高，稱為吸附劑的活化。反之，在吸附劑中加入一定量的水分，降低其活性稱為脫活化。

吸附劑的活性根據(jù)含水量的多少分為5個(gè)級(jí)別（Ⅰ～Ⅴ級(jí)）。活性級(jí)別越小，含水量越少，吸附能力越強(qiáng)；活性級(jí)別越大，含水量越多，吸附能力就越弱。

1.3.1.4　常用吸附劑簡(jiǎn)介

（1）硅膠

硅膠為親水性吸附劑，極易吸水。吸附強(qiáng)弱與硅醇基（Si—OH）含量多少有關(guān)。硅醇基可以通過氫鍵吸附水分，因此硅醇基的吸附能力隨著含水量的升高而降低。含水量在17%以下才能作為吸附劑。活化一般是在105～110℃烘30min。常用硅膠有硅膠H（不含黏合劑）、硅膠G（含有黏合劑煅石膏）、硅膠GF254（含煅石膏，另含有一種無(wú)機(jī)熒光劑）。　

（2）氧化鋁

氧化鋁為親水性吸附劑，吸附能力比硅膠稍強(qiáng)。氧化鋁表面顆粒呈微堿性（可能混有碳酸鈣成分），適宜分離堿性成分，如生物堿、胺類；不適宜分離醛、酮、酯、內(nèi)酯等成分，因?yàn)閴A性基團(tuán)可能與上述化合物發(fā)生次級(jí)反應(yīng)，如異構(gòu)化、氧化、消除等反應(yīng)。用稀硝酸或稀鹽酸處理氧化鋁，使氧化鋁表面帶有N、Cl-陰離子，從而具有離子交換的性質(zhì)，適用于酸性成分的分離。色譜用氧化鋁有堿性（pH 9.0）、中性（pH 7.5）和酸性（pH 4.0）三種。

（3）聚酰胺

聚酰胺是由酰胺聚合而成的一類高分子物質(zhì)，不溶于水及常用的有機(jī)溶劑，對(duì)酸穩(wěn)定性差，對(duì)堿較穩(wěn)定。分子中的酰氨基可與酚羥基、羧基等形成氫鍵。主要用于分離蒽醌、類黃酮類、有機(jī)酸類、酚類、鞣質(zhì)類等成分，也可用于分離萜類、生物堿、甾體、糖類等成分。目前普遍認(rèn)為聚酰胺色譜具有“雙重色譜”性能，以含水流動(dòng)相（如甲醇-水）作洗脫劑，主要作用是氫鍵吸附，吸附能力強(qiáng)的后洗脫下來(lái)，而以有機(jī)溶劑作洗脫劑（如三氯甲烷-甲醇）時(shí)，類似于正相分配色譜，極性大的后洗脫下來(lái)。

（4）活性炭

活性炭是親脂性吸附劑。使用前，需要先用稀鹽酸洗滌，再用乙醇洗，然后以水洗凈，于80℃干燥。色譜分離用的活性炭，最好選用顆粒型，若為細(xì)粉，則需加入適量硅藻土作為助濾劑混合裝柱，以免流速太慢。活性炭主要用于分離水溶性成分，如氨基酸、糖類及某些苷類。活性炭對(duì)有機(jī)物有選擇性吸附作用，在水溶液中最強(qiáng)，在有機(jī)溶劑中則較弱。故水的洗脫能力最弱，而有機(jī)溶劑則較強(qiáng)。

1.3.1.5　吸附色譜的操作

（1）吸附薄層色譜操作

吸附薄層色譜是把吸附劑均勻涂在玻璃板或其他片基上成一薄層，把欲分離的樣品加到該薄層的一端，用合適的溶劑展開，由于吸附劑對(duì)不同成分吸附能力不同在板上移動(dòng)速度有差異而分離。薄層色譜是一種簡(jiǎn)單快速的色譜法，它不僅用于成分的鑒定而且可以用于混合物的分離和純化。

①吸附薄層板的制備　首先根據(jù)欲分離成分的量選擇薄層板的大小，如分離混合物的量在0.5g左右，一般采用20cm×20cm的大方板1～3塊；如量少可以采用10cm×10cm小方板；如做微量分離鑒定，可采用3cm×15cm或2.5cm×7.5cm的載玻片。選好的玻璃板應(yīng)先用清潔液或肥皂液浸泡，再用自來(lái)水沖洗，蒸餾水洗凈，晾干備用。吸附薄層板按制備過程中是否加入黏合劑分為硬板和軟板。加黏合劑制的板為硬板，不加黏合劑制的板為軟板。

a.軟板制備

（a）干法鋪板　將一定規(guī)格活化后硅膠或氧化鋁的干粉直接鋪在玻璃板上，用一根兩端帶有銅環(huán)套圈的玻璃棒在板的一端向前推移，鋪成均勻的薄層板，如圖1.9所示。套圈的厚度即是薄層板的厚度，定量分離時(shí)厚度約為1～3mm，定性鑒定時(shí)厚度在0.2～1mm。此種板容易損壞，展開時(shí)傾斜角度不能過大。

（b）濕法鋪板　將選擇好的吸附劑稱出一定量，加入適當(dāng)溶劑（水、乙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷等），攪拌成勻漿，取一定量?jī)A注于玻璃板中間，輕輕搖動(dòng)，使勻漿均勻布于玻璃板上，晾干，此種鋪法稱為傾注法，也可采用涂鋪器涂鋪。涂鋪器分為手動(dòng)和自動(dòng)兩種。涂鋪器的底部有縫隙，縫隙的高度就是薄層的厚度。將玻璃板排列在鋪板床上，涂鋪器擺放在鋪板床上，有縫隙一側(cè)朝后，將吸附劑倒入涂鋪器中，用手動(dòng)或電動(dòng)等手段勻速推動(dòng)涂鋪器在鋪板床上移動(dòng)，就可以得到一系列均勻的薄層。涂鋪器鋪板見圖1.10。

b.硬板制備　硬板由于加有黏合劑，機(jī)械強(qiáng)度高于軟板，應(yīng)用范圍廣泛。硬板的制備一般采用濕法鋪板。將吸附劑、黏合劑和水等溶劑按一定比例混合，均勻鋪在一塊玻璃板上形成薄層板。鋪好的薄層板自然干燥后再活化備用。

常用的黏合劑有熟石膏（G）、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）、淀粉等。

（a）硅膠G板（G的含量為5%、10%、15%）的制備　取硅膠G-1份，加水2～3份，調(diào)成糊狀鋪板，晾干后110℃活化30min，放入干燥器中備用。注意事項(xiàng)：操作時(shí)糊狀混合物太稠或太稀都會(huì)影響鋪板效果。煅石膏遇水后很快就會(huì)凝固，所以鋪板操作一定要迅速，否則糊狀混合物變稠后很難鋪均勻。如果要分離易被吸附的化合物可以不活化。

（b）氧化鋁G板（一般含G-5%）的制備　取氧化鋁G-1份，加水1～2份調(diào)勻鋪板。注意事項(xiàng)同硅膠G板。

（c）硅膠-CMC-Na板的制備　取硅膠1份，加0.7%～1% CMC-Na的水溶液2～2.5份，調(diào)勻鋪板，水平放置，待自然干燥硅膠顏色漸變白時(shí)，移烘箱110℃活化30min，放入干燥器中備用。

（d）氧化鋁-CMC-Na板的制備　取氧化鋁1份，加0.7%～1% CMC-Na的水溶液1.5份，調(diào)勻鋪板。

（e）硅膠淀粉板的制備　取硅膠95份與淀粉5份，加2～3倍量的水，于水浴上加熱至糊狀，立即鋪板。

c.特殊制板

（a）酸堿薄層板或pH緩沖板　為了改變吸附劑原來(lái)的酸堿性，改進(jìn)分離效果，在鋪板時(shí)，用稀酸、稀堿或緩沖液代替水進(jìn)行濕法制板。例如硅膠原本不能用于生物堿的分離，制版過程中加入0.1～0.5mol/L氫氧化鈉溶液，制得堿性的硅膠板，可以用來(lái)分離生物堿等堿性成分。也可用不同pH的緩沖液代替水鋪板，用來(lái)分離氨基酸、生物堿等。

（b）熒光板　有的有機(jī)化合物本身不顯色，在紫外燈光下也不顯示熒光，又無(wú)適當(dāng)?shù)娘@色劑，則可以在吸附劑中加入熒光物質(zhì)，制成熒光板。該板展開以后，在熒光背景上，出現(xiàn)暗斑。常用的熒光劑有254nm和365nm兩種。制備時(shí)在吸附劑中加入1.5%的熒光物質(zhì)，研細(xì)混勻，加水調(diào)成糊狀鋪板。有市售成品熒光板可以直接使用，如GF254。

（c）絡(luò)合薄層板　常用的有硝酸銀板和硼酸板。硝酸銀板是在吸附劑中加入一定量10%的硝酸銀溶液調(diào)成糊狀制板，或?qū)⒅坪玫挠舶褰?0%硝酸銀甲醇溶液中1min，取出陰干。適合分離碳數(shù)相同的飽和與不飽和化合物。不飽和化合物與硝酸銀絡(luò)合，展開速度減慢，從而與飽和化合物分離。硼酸薄層板是將制備好的硬板浸入硼酸的飽和甲醇溶液中1min，取出陰干，適用于分離糖類化合物。

（d）燒結(jié)薄層板　將玻璃粉與硅膠或氧化鋁、硅藻土等吸附劑按不同比例混合，經(jīng)高溫?zé)Y(jié)而成。此種板抗摩擦性能好，不易磨損，而且使用后可以清洗活化反復(fù)使用。此種板有商品出售，可直接使用。

（e）有濃縮區(qū)的薄層板　此板由上下兩部分組成，下端是無(wú)活性的大孔二氧化硅濃縮區(qū)，厚度約0.5mm，高度約2.5cm，上端鄰接活性硅膠層，厚度約0.25mm。兩層雖有明顯的界限，但展開時(shí)可以相通而沒有阻力。點(diǎn)樣在濃縮區(qū)，展開時(shí)點(diǎn)樣溶液移動(dòng)至濃縮區(qū)前沿，形成狹窄的線型，濃縮后移動(dòng)到活性薄層區(qū)，才開始進(jìn)行分離。此種薄層板可以避免因點(diǎn)樣的斑點(diǎn)形狀、大小和位置的水平高低帶來(lái)的誤差，并且樣品在濃縮區(qū)進(jìn)行了一次濃縮和純化，分離效果好。此種板有商品出售，可直接使用。

（f）高效薄層板（HPTLC）　所用吸附劑的粒度比一般薄層色譜所用吸附劑的粒度要小得多，直徑為5～10μm。用噴霧法制成商品預(yù)制板，厚度均勻，使用方便，適用于定量測(cè)定，效果較好。

②點(diǎn)樣

a.樣品液的配制　將欲分離或鑒定的樣品溶解在低沸點(diǎn)的溶劑或展開劑中，配成濃度為1%～2%的溶液。溶解樣品的溶劑最好與展開劑極性相近，易揮發(fā)。分離樣品量大或進(jìn)行制備型薄層色譜分離時(shí)，樣品溶液可達(dá)到5%～10%。

b.操作　在色譜板底邊1.5～2cm處用鉛筆輕輕畫一直線（軟板可以做記號(hào)）作為起始線。用內(nèi)徑0.3mm的平口毛細(xì)管將樣品溶液吸入管內(nèi)，滴在薄板的起始線。如樣品溶液濃度低，可反復(fù)點(diǎn)幾次，每次點(diǎn)樣時(shí)必須在上次點(diǎn)的溶劑干了以后再進(jìn)行。樣品點(diǎn)的直徑以2～3mm為宜，每?jī)蓚€(gè)點(diǎn)之間應(yīng)保持1.5～2cm的距離，且不能靠近薄層外緣，以避免邊緣效應(yīng)。點(diǎn)樣時(shí)避免毛細(xì)管扎在薄層上造成空穴，如出現(xiàn)洞穴，當(dāng)展開劑上升將繞著洞穴上升，使分離點(diǎn)出現(xiàn)三角形區(qū)帶，影響分離效果。也可用微量注射器代替毛細(xì)管，或用大小相同的小圓形濾紙片分別浸泡樣品液，貼在點(diǎn)樣位置上，可以避免毛細(xì)管點(diǎn)樣時(shí)大小不容易控制或定量不準(zhǔn)確。

c.點(diǎn)樣量　點(diǎn)樣量的多少直接影響薄層展開結(jié)果，量太少可能斑點(diǎn)模糊或完全顯不出斑點(diǎn)，太多可能斑點(diǎn)過大或拖尾，使相似的斑點(diǎn)連在一起，或自原點(diǎn)開始一直連接在一起，分離失敗。一般對(duì)吸附劑厚0.25～0.5cm的薄板，每點(diǎn)所含樣品量5～10μg（濃度1%～2%的溶液點(diǎn)0.5～2μL即可），對(duì)1mm左右厚的制備薄層色譜板，點(diǎn)樣量可達(dá)到10～50μg，甚至可達(dá)到100μg。

③展開

a.展開劑的選擇　極性吸附色譜如硅膠、氧化鋁色譜，對(duì)于同一種化合物而言，展開劑的極性越大，展開能力越強(qiáng)，在薄層上推得更遠(yuǎn)。如用一種展開劑展開某一化合物時(shí)，如果移動(dòng)得太近，就要考慮更換一種極性較大的展開劑或加入一定量極性大的溶劑展開。如苯、苯-三氯甲烷、三氯甲烷、三氯甲烷-丙酮，依次改變展開劑中極性強(qiáng)弱溶劑的比例，增大展開劑的極性，使化合物可以推到適當(dāng)?shù)奈恢茫部梢匀N溶劑混合展開。相反如果展開劑移動(dòng)太遠(yuǎn)，幾乎到了前沿，就要考慮減小展開劑的極性。

在實(shí)際工作中可通過微量圓環(huán)技術(shù)選擇展開劑。如圖1.11所示，用毛細(xì)管吸取各種展開劑加到樣品中心，展開劑自毛細(xì)管中流出而進(jìn)行展開，展開后出現(xiàn)不同圓形色譜，從圖可以看出點(diǎn)3展開效果最好，把樣品展開幾個(gè)同心圓，點(diǎn)2展開效果最差，基本未動(dòng)。

b.操作　展開操作需在密閉容器中進(jìn)行，根據(jù)薄板的大小，選用適當(dāng)?shù)纳V缸或色譜槽。盛有展開劑的容器要密閉一段時(shí)間再放入薄層板；將薄層板的一端浸入展開劑中，不要淹沒原點(diǎn)；取出后要立即標(biāo)記溶劑前沿，揮掉溶劑。展開方式有以下幾種：

（a）上行展開　是最常用的展開方式。根據(jù)需要有斜上行和直立上行，展開劑由下向上展開。將展開劑倒入色譜缸中，將點(diǎn)好樣的薄層板浸入展開劑約0.5cm。軟板只能與水平呈5°～10°角上行展開，硬板可以直立上行。展開距離一般為10～15cm。如果斑點(diǎn)展開距離很小，而且斑點(diǎn)沒有分開，可采取連續(xù)展開，薄板上緣與外界相通，溶劑不斷從薄層上緣揮去，而使展開連續(xù)進(jìn)行，直至斑點(diǎn)分開。

（b）下行展開　在色譜缸中，在薄層的上端放一個(gè)盛展開劑的槽，用厚濾紙將展開劑引到薄層板上端而使展開劑向下移動(dòng)。下行法由于重力作用而流動(dòng)較快，所以展開時(shí)間較短，連續(xù)下行比較容易，當(dāng)展開劑流到下端以后，滴在底部貯集起來(lái)。

（c）二次展開　一次展開后如兩種物質(zhì)不能分離，可以取出薄層板揮去展開劑，再放入色譜缸中用同樣的展開劑或第二種展開劑二次展開，致使兩種物質(zhì)很好分離。

（d）雙向展開　在正方形的薄層板上，將樣品點(diǎn)在薄層板的一角，先進(jìn)行展開，然后揮去溶劑，將薄層板旋轉(zhuǎn)90°，更換第二種展開劑，再進(jìn)行展開。第一次分開不徹底的成分經(jīng)二次展開就能很好地分離。

（e）徑向展開　薄層板是圓形，中間有一小圓洞，樣品點(diǎn)在圓洞周圍。展開劑由圓洞徑向展開。為了提高展開速度，可以離心旋轉(zhuǎn)。有專門的離心旋轉(zhuǎn)薄層色譜裝置銷售。

④定位　薄層展開以后，無(wú)論是定性鑒定還是制備分離或定量測(cè)定，都要確定樣品展開后的位置，這樣才能知道分離情況或化合物種類及含量情況。有色化合物可以直接確定，無(wú)色化合物就要通過特殊的方法確定。

a.熒光定位　薄層展開以后，揮干溶劑后在紫外燈下觀察。有熒光的樣品薄層或熒光薄層板放在紫外燈254nm或365nm下直接觀察，用鉛筆描出熒光斑或暗斑的位置。有些樣品需要噴某種試劑以后才能出現(xiàn)熒光，然后觀察。

b.顯色定位

（a）蒸氣顯色　有一些物質(zhì)（如固體碘、液體溴、濃氨水等）的蒸氣能與一些化合物作用顯色。操作方法：揮干薄層板上的溶劑，然后放入裝有上述物質(zhì)的密閉容器中，就會(huì)顯示不同顏色的斑點(diǎn)。取出后在斑點(diǎn)顏色未褪之前迅速用鉛筆畫出斑點(diǎn)范圍。有些蒸氣如碘蒸氣是非破壞性試劑，放在空氣當(dāng)中就會(huì)慢慢褪去，不影響后面的定性定量分析。

（b）噴顯色劑　各類化合物大多都有專屬的顯色劑，如檢測(cè)已知類型的化合物，可選用對(duì)應(yīng)類型的專屬顯色劑。如果是未知類型的化合物，可選用通用顯色劑或各類型的顯色劑。將顯色劑裝入噴瓶?jī)?nèi)，距離薄層板約30～50cm，噴灑要細(xì)而均勻，然后用吹風(fēng)機(jī)吹干，按照顯色劑要求進(jìn)行顯色處理，待斑點(diǎn)出現(xiàn)后用小針或鉛筆描出斑點(diǎn)位置。若是軟板要在溶劑未揮干之前噴灑，以免薄層被吹散；若是刺激性、毒性顯色劑要在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。

⑤比移值　比移值（Rf值）表示的是某一化合物經(jīng)過展開后在薄層板上的相對(duì)位置。計(jì)算方法如圖1.12所示，是原點(diǎn)到色斑中心的距離除以原點(diǎn)到溶劑前沿的距離，或?yàn)榘唿c(diǎn)移動(dòng)的距離與溶劑移動(dòng)的距離之比。Rf值越大表示該化合物展開的速度越快；反之，展開速度慢。一般來(lái)說(shuō)Rf值與板的厚度成正比。

化合物A的Rf值=；化合物B的Rf值=

計(jì)算出的Rf值可以與已知化合物的Rf對(duì)照，也可以與文獻(xiàn)記載的Rf對(duì)照，來(lái)進(jìn)行定性鑒定。

⑥定量

a.薄層板上直接測(cè)定

（a）目視法　樣品薄層展開以后，直接觀察色點(diǎn)的大小及顏色深淺，并與已知不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品的色點(diǎn)比較，從而近似地判斷樣品中的濃度。此法又稱半定量法。

（b）測(cè)斑點(diǎn)面積　展開后色點(diǎn)的面積與樣品量之間存在一定的關(guān)系。可用測(cè)面儀或用透明方格紙復(fù)制計(jì)數(shù)等方法測(cè)定面積，進(jìn)行定量。

（c）儀器測(cè)定法　用薄層掃描儀一定波長(zhǎng)的光照射在薄層板上，對(duì)薄層色譜中有紫外或可見吸收的斑點(diǎn)或經(jīng)照射能激發(fā)產(chǎn)生熒光的斑點(diǎn)進(jìn)行掃描，將掃描得到的圖譜及積分值與已知標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，根據(jù)之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，用計(jì)算機(jī)求出樣品液中的濃度。

b.洗脫測(cè)定　薄層上色點(diǎn)的位置確定以后，為了進(jìn)一步定性鑒定和定量，可將斑點(diǎn)取下，選用適當(dāng)?shù)娜軇┫疵摗Ｏ疵撘河米贤?可見分光光度計(jì)或其他方法測(cè)定樣品的含量。

⑦應(yīng)用

薄層色譜不僅在天然藥物研究中是一種常用的分析手段，在基層藥物生產(chǎn)、科研工作中也是一種最常用的分離分析方法。可用于成分的分離，定性、定量檢查，同時(shí)為其他分析手段提供一定的分離依據(jù)。

（2）吸附柱色譜操作

吸附柱色譜是用適當(dāng)?shù)娜軇_洗將被分離物質(zhì)通過裝有吸附劑（氧化鋁、硅膠、聚酰胺等）的長(zhǎng)玻璃柱，由于吸附劑對(duì)各組分吸附能力不同而出柱的先后順序不同，通過分段定量收集洗脫液而使各組分分離。

①柱色譜的制備

a.柱的選用　色譜柱一般使用下端帶有活塞的玻璃管，柱的直徑與高度比為1∶（10～40），柱的大小視分離樣品量而定，一般能裝樣品的30～50倍量的吸附劑即可。在工業(yè)化生產(chǎn)中為了便于柱的切割分段，可采用尼龍柱或用聚乙烯薄膜做的柱筒，高度可根據(jù)需要調(diào)整。

b.裝柱

（a）干法　將吸附劑一次加入色譜柱，振動(dòng)管壁使其均勻下沉，然后沿管壁緩緩加入洗脫劑；或在色譜柱下端出口處連接活塞，加入適量的洗脫劑，旋開活塞使洗脫劑緩緩滴出，然后自管頂緩緩加入吸附劑，使其均勻地潤(rùn)濕下沉，在管內(nèi)形成松緊適度的吸附層。操作過程中應(yīng)保持有充分的洗脫劑留在吸附層的上面。

（b）濕法　將吸附劑與洗脫劑混合，攪拌除去空氣泡，徐徐傾入色譜柱中，然后加入洗脫劑將附著管壁的吸附劑洗下，使色譜柱面平整。等到填裝吸附劑所用洗脫劑從色譜柱自然流下，液面和柱表面相平時(shí)，即加供試品液。

②加樣　除另有規(guī)定外，將供試品溶于開始洗脫時(shí)使用的洗脫劑中，再沿色譜管壁緩緩加入，注意勿使吸附劑翻起。或?qū)⒐┰嚻啡苡谶m當(dāng)?shù)娜軇┲校c少量吸附劑混勻，再使溶劑揮發(fā)去盡使呈松散狀，加在已制備好的色譜柱上面。如供試品在常用溶劑中不溶，可將供試品與適量的吸附劑在乳缽中研磨混勻后加入。

③洗脫　將選好的洗脫劑放在分液漏斗中，打開活塞慢慢連續(xù)不斷滴加在柱頂，同時(shí)打開活塞，等份收集洗脫液，或用自動(dòng)收集器收集，流速保持1～2滴/s。

操作注意：一般先選用洗脫能力弱的溶劑洗，逐步增加洗脫能力，如單一洗脫劑效果不好，可選用混合溶劑，成分復(fù)雜的常用梯度洗脫；洗脫劑的選用可通過薄層色譜篩選，一般TLC展開時(shí)Rf值為0.2～0.3的溶劑系統(tǒng)是最佳的洗脫系統(tǒng)；收集洗脫液，每份收集量大概與所用吸附劑的量相當(dāng)；用薄層色譜、紙色譜或其他儀器做定性檢查，合并同一組分溶液，回收溶劑得到單一成分；如果仍為混合物，可進(jìn)一步采用色譜法或其他方法分離。

④應(yīng)用　柱色譜分離能力比薄層分離能力更強(qiáng)，效果更好，尤其對(duì)結(jié)構(gòu)相似、性質(zhì)接近、采用薄層難以分離的成分分離效果好。例如用吸附柱色譜分離長(zhǎng)春花中長(zhǎng)春堿和醛基長(zhǎng)春堿，采用氧化鋁吸附柱，苯-三氯甲烷（1∶2）為洗脫液洗脫，可分離長(zhǎng)春堿和醛基長(zhǎng)春堿。

（3）聚酰胺色譜操作

聚酰胺色譜是以聚酰胺為吸附劑的吸附色譜法，分為聚酰胺薄層色譜和聚酰胺柱色譜兩大類。

①聚酰胺色譜的制備

a.聚酰胺薄層色譜　聚酰胺粉容易隨著玻璃棒滑動(dòng)，不能用干法制板，濕法直接制板易干裂，多采用聚酰胺加10%～20%的纖維素粉作黏合劑，制板效果比較好。取3.2g聚酰胺粉加甲酸20mL，攪拌使完全溶解后，加纖維素0.8g和乙醇6mL，充分混合均勻，鋪板，置水平位置任甲酸自然揮發(fā)，2～3h后，薄層變色至不透明時(shí)，浸入水中浸泡1h，中途換水1次，取出，用蒸餾水沖洗，瀝干，置80℃以下烘20～30min即可使用。現(xiàn)有市售預(yù)制成型的聚酰胺板，可直接使用。

b.聚酰胺柱色譜　聚酰胺柱色譜的制備操作與吸附柱色譜類似，常用濕法裝柱，取聚酰胺粉用水浸泡1h后，攪勻裝柱。

②分離操作

a.聚酰胺薄層色譜　聚酰胺薄層分離操作按薄層色譜操作方法進(jìn)行。

b.聚酰胺柱色譜　聚酰胺柱色譜分離操作按吸附柱色譜操作方法進(jìn)行。洗脫液多以含水溶劑進(jìn)行洗脫。

③聚酰胺色譜的分離原理　聚酰胺分離主要是靠聚酰胺中的酰胺基與化合物中的一些基團(tuán)形成氫鍵吸附的能力不同，使化合物得以分離。影響聚酰胺吸附力的主要因素如下：

a.形成氫鍵的能力與溶劑有關(guān)。一般聚酰胺在水中與化合物形成氫鍵的能力最強(qiáng)，在有機(jī)溶劑中較弱，在堿性溶劑中最弱。因此溶劑對(duì)聚酰胺的洗脫能力的次序?yàn)椋核?gt;30%乙醇>50%乙醇、>75%乙醇>95%乙醇>丙酮>稀氨水液或稀氫氧化鈉水液>甲酰胺或二甲基甲酰胺>尿素水溶液。

b.與被分離成分的結(jié)構(gòu)有關(guān)。與聚酰胺形成氫鍵的基團(tuán)越多，吸附力越強(qiáng)。如間苯三酚>間苯二酚>苯酚。

c.形成氫鍵基團(tuán)所處的位置不同，被聚酰胺吸附的強(qiáng)弱也不同。如對(duì)位及間位的吸附力大于鄰位。

d.芳香化程度越高，吸附能力越強(qiáng)。

e.能形成分子內(nèi)氫鍵的化合物吸附力減弱。

④聚酰胺色譜的應(yīng)用　聚酰胺對(duì)黃酮類、醌類、酚類等成分的分離效果較好，也可用于生物堿、萜類、甾體、糖類等極性化合物與非極性化合物的分離。另外對(duì)鞣質(zhì)的吸附幾乎不可逆，吸附力強(qiáng)，因而特別適于植物粗提取液的脫鞣處理。聚酰胺薄層色譜適用范圍較廣，特別適用于分離含游離酚羥基的黃酮及苷類。

1.3.2　分配色譜

1.3.2.1　分配色譜原理

分配色譜是利用固定相與流動(dòng)相之間對(duì)分離組分溶解度的差異來(lái)實(shí)現(xiàn)分離。過程本質(zhì)上是組分分子在固定相和流動(dòng)相之間不斷達(dá)到溶解平衡的過程。

1.3.2.2　分配色譜的類型

①按操作形式　分為紙色譜、分配薄層色譜和分配柱色譜。

②按相的選擇極性　分為正相分配色譜和反相分配色譜。

a.正相分配色譜　固定相極性大于流動(dòng)相，洗脫時(shí)極性小的化合物先出柱，極性大的化合物后出柱，適用于水溶性或極性較大的化合物。

b.反相分配色譜　固定相極性小于流動(dòng)相，洗脫時(shí)極性大的化合物先出柱，極性小的化合物后出柱，適用于脂溶性成分。

1.3.2.3　分配色譜基本構(gòu)成

分配色譜由支持劑、固定相、流動(dòng)相構(gòu)成。

（1）支持劑

支持劑又稱載體，在分配色譜中僅作為載負(fù)固定相的介質(zhì)，為多孔的粉末，無(wú)吸附作用，不溶于所用的溶劑中，可吸收一定量的固定液，不影響流動(dòng)液的通過，不影響溶劑的性質(zhì)和組成。

①硅膠　含水17%以上無(wú)吸附作用，可作為載體。吸水量可達(dá)50%以上仍呈不潮濕的粉末狀態(tài)。

②硅藻土　惰性，多用。可吸收其質(zhì)量的100%的水分，仍呈粉末狀態(tài)。

③纖維素　惰性，常用。能夠吸收相當(dāng)于本身重量的水，仍呈粉末狀態(tài)。

（2）固定相

①極性和親水性溶劑固定相　水、各種水溶液（酸、堿、鹽、緩沖液）、甲醇、甲酰胺、二甲基酰胺。

②親脂性溶劑固定相　硅油、液體石蠟、石油醚等。

（3）流動(dòng)相

在正相分配色譜中，洗脫劑（流動(dòng)相）常選用石油醚、環(huán)己烷、苯-氯仿、氯仿、氯仿-乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、異戊醇等。反相色譜中洗脫劑常選用水、甲醇、乙醇等，洗脫時(shí)先用極性大的，逐漸改為中等極性的洗脫。

一般情況下，若被分離成分的極性大，選用極性大的固定相和極性小的流動(dòng)相（正相色譜）；若被分離成分的極性小，則選用極性小的固定相和極性大的流動(dòng)相（反相色譜）。

1.3.2.4　分配色譜的操作

（1）紙色譜

紙色譜是將樣品溶液點(diǎn)在色譜濾紙的一端，用一定的展開劑展開，不同成分的移動(dòng)速度不同而分離，或根據(jù)移動(dòng)的位置求Rf值，進(jìn)行鑒定。通常以濾紙纖維中所含的水分作為固定相，含水的有機(jī)溶劑作流動(dòng)相，如水飽和的正丁醇、正戊醇等，為正相色譜；但如果用酸水或鹽水展開，為反相色譜。如果分離親脂性很強(qiáng)的成分，用液體石蠟或凡士林作固定相，也為反相色譜。

①色譜濾紙的選用　色譜濾紙應(yīng)質(zhì)地均勻、平整無(wú)折痕、邊緣整齊。根據(jù)性能可分為快速、中速和慢速3種，根據(jù)質(zhì)地有厚薄之分。應(yīng)用時(shí)根據(jù)被分離的成分及采用的展開劑來(lái)選擇。對(duì)Rf相差小的化合物，應(yīng)采用慢速濾紙；對(duì)Rf相差較大的化合物，可采用快速濾紙。如展開劑中以正丁醇為主，黏度大，展開速度慢，可采用快速濾紙；展開劑中以石油醚、三氯甲烷為主，展開速度快，可采用慢速或中速濾紙。做定性檢查時(shí)用薄濾紙，厚濾紙適用于定量檢查和微量制備。選擇濾紙的大小根據(jù)一次展開要分離樣品的多少及展開方式選擇。如點(diǎn)一個(gè)樣品可用2.5cm×15cm的濾紙條；如點(diǎn)兩個(gè)樣品，可采用5cm×20cm的濾紙條；如點(diǎn)樣更多可用各種方形濾紙；如雙向展開，用正方形濾紙；如徑向展開，用圓形濾紙。

②展開劑的選擇　要從欲分離物質(zhì)在二相中的溶解度來(lái)考慮，在化合物定性時(shí)Rf值控制在0.3～0.7，對(duì)各成分分離時(shí)Rf值控制在0.05～0.85。各類成分在紙色譜中常用的展開劑見表1.3。

③色譜操作　點(diǎn)樣、展開、顯色以及比移值的計(jì)算和吸附薄層色譜基本相同，只是顯色劑的選用要注意，不能用有腐蝕性的顯色劑。

④紙色譜應(yīng)用　紙色譜廣泛應(yīng)用于化合物的分離和鑒定。分離親水性和弱親脂性成分用正相色譜，效果比薄層色譜更好。例如，分離秦皮提取液中的七葉樹苷和七葉樹內(nèi)酯，展開劑為乙酸乙酯，紫外光下觀察斑點(diǎn)的熒光，展開后七葉樹苷和七葉樹內(nèi)酯的Rf值分別為0.12和0.89，分離效果好。

（2）分配薄層色譜

分配薄層色譜是以硅膠或硅藻土為載體與固定相混鋪在薄板上應(yīng)用的平面分配色譜。通常以含水17%以上的硅膠及硅藻土作支持劑。固定相通常為水。流動(dòng)相常用的是含水的有機(jī)溶劑。

①鋪板　在分配薄層色譜中，涂布固定相的方法有以下三種：

a.浸漬法　把固定相溶在易揮發(fā)的有機(jī)溶劑中配成一定濃度的溶液，如15%～25%的甲酰胺的丙酮溶液或30%丙二醇的丙酮溶液，把薄層板浸入后迅速取出在空氣中揮干溶劑，固定相就留在薄層板上。如用液體石蠟、硅酮油作固定相，可將薄層浸入1%液體石蠟的乙醚溶液或5%硅酮油的乙醚溶液，取出晾干即可。

b.展開法　將薄層板放在含有固定相溶液中展開一次。

c.噴霧法　將固定相溶液均勻噴到薄層板上。此法簡(jiǎn)單，但固定相的分布不易均勻。

②展開劑的選擇　分配薄層色譜展開劑的選擇可參照紙色譜進(jìn)行。

③其他操作　其他操作中除了薄層板不需活化外，其他操作均與吸附薄層色譜相同。

（3）分配柱色譜

分配柱色譜是將吸附有固定相的載體裝入色譜柱中進(jìn)行分離和檢查混合物成分的柱色譜。支持劑為含水17%以上的硅膠、硅藻土和纖維素粉。固定相和流動(dòng)相與分配薄層色譜相同。

①分配柱色譜的類型

a.按是否加壓　分為常壓柱色譜和加壓柱色譜。根據(jù)對(duì)流動(dòng)相加壓從小到大順序可分為快速色譜、低壓液相色譜、中壓液相色譜和高壓液相色譜。加壓柱色譜中所用的載體顆粒直徑更小，小于常壓柱色譜中所用載體顆粒直徑的1/10。

b.按相極性不同　分為正相分配柱色譜和反相分配柱色譜。

②色譜操作

a.裝柱　用濕法裝柱。裝柱時(shí)先將固定相溶劑（如水或其他極性溶劑）與支持劑攪拌混合均勻，然后上柱。在色譜柱中預(yù)先加入已用固定相溶劑充分飽和的流動(dòng)相溶劑。

b.上樣及洗脫　加樣量比吸附柱色譜少，樣品量與支持劑量比為1∶（100～1000）。加樣方法：樣品溶于少量流動(dòng)相中，加入柱的頂端。如樣品難溶于流動(dòng)相，易溶于固定相，可用少量固定相溶解，再加入少量支持劑拌勻后裝柱。如果樣品在兩相中均難溶，可用適量揮發(fā)性溶劑溶解樣品，加入支持劑拌勻，揮去溶劑，再加入固定相裝柱。

洗脫過程與吸附柱色譜相同。分配柱色譜所用的溶劑系統(tǒng)，可用相應(yīng)的紙色譜或分配薄層色譜進(jìn)行選擇。所用的洗脫液必須事先用固定相飽和，否則會(huì)破壞分配系統(tǒng)，影響分離效果。

c.檢查　收集洗脫液檢查結(jié)果與吸附柱色譜操作相同。

1.3.3　凝膠色譜

1.3.3.1　凝膠色譜原理

凝膠色譜（chromatography，又稱凝膠柱色譜）中凝膠顆粒具三維的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在水中可膨脹，并有許多一定大小的網(wǎng)眼。用時(shí)將凝膠在適宜的溶劑中浸泡（一般用水），使其吸收大量的液體充分溶脹成柔軟而有彈性的狀態(tài)裝入色譜柱中，加入樣品液，再以洗脫液洗脫。當(dāng)溶液通過凝膠顆粒時(shí)，溶液中分子直徑小于網(wǎng)眼的成分可進(jìn)入凝膠內(nèi)部，而分子直徑大于網(wǎng)眼的成分則被排阻在凝膠顆粒之外，按分子由大到小的順序流出分離，此效應(yīng)稱為“分子篩效應(yīng)”，見圖1.13。因此凝膠色譜又稱為分子排阻色譜、凝膠過濾色譜、凝膠滲透色譜等。以水溶液為流動(dòng)相的叫凝膠過濾色譜（GFC），以有機(jī)溶劑為流動(dòng)相的叫凝膠滲透色譜（GPC）。

1.3.3.2　凝膠色譜基本構(gòu)成

（1）固定相

固定相是多孔凝膠。主要有葡聚糖凝膠（Sephadex G）和羥丙基葡聚糖凝膠（Sephadex LH-20），另有瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠。最常用的是葡聚糖凝膠。

①葡聚糖凝膠

a.葡聚糖凝膠的結(jié)構(gòu)　葡聚糖凝膠也稱交聯(lián)葡聚糖凝膠，是由葡聚糖和甘油基通過醚橋相互交聯(lián)而成的多孔性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)式如下：

b.葡聚糖凝膠的性質(zhì)　葡聚糖分子內(nèi)含有大量羥基而具有極性，在水中即膨脹成凝膠粒子，是一種水不溶性的白色球狀顆粒，由于醚鍵的不活潑性，因而具有較高的穩(wěn)定性。不溶于水和鹽溶液，在堿性和弱酸性溶液中性質(zhì)穩(wěn)定，但在酸性溶液中高溫加熱能促使糖苷鍵水解。和氧化劑接觸會(huì)分解，長(zhǎng)期不用宜加防腐劑。

c.葡聚糖凝膠的型號(hào)　凝膠的商品型號(hào)用吸水量來(lái)表示。如G-25型號(hào)中G代表葡聚糖凝膠，后面的阿拉伯?dāng)?shù)值表示該型號(hào)的干凝膠1g所吸收水量的10倍值，即G-25型號(hào)每克干凝膠的吸水量為2.5mL/g。商品型號(hào)有G-10、G-15、G-25、G-50、G-75、G-100、G-150、G-200等，見表1.4。型號(hào)數(shù)字越大，吸水量越大，凝膠體積膨脹越大，孔隙也越大，可用于大分子物質(zhì)的分離；反之，可用于小分子物質(zhì)的分離。G型凝膠用于流動(dòng)相為水的色譜分離。適用于苷類、氨基酸、肽類、蛋白質(zhì)、多糖等水溶劑成分。葡聚糖凝膠有不同的粒度。超細(xì)級(jí)的葡聚糖凝膠是用于需要極高分辨率的柱色譜和薄層色譜。粗級(jí)和中級(jí)的凝膠用于制備性色譜過程，可在較低的壓力下獲得較高的流速。另外，粗級(jí)也可用于批量工藝。

②羥丙基葡聚糖凝膠　LH型凝膠是在葡聚糖凝膠中引入羥丙基以代替分子中羥基中的氫，使葡聚糖具有一定的親脂性，不僅能吸水膨脹，而且在許多有機(jī)溶劑中也能膨脹（表1.5），應(yīng)用范圍增大，適用黃酮類、蒽醌類、香豆素等成分的分離。

③瓊脂凝膠　由D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖相間結(jié)合的鏈狀多糖通過氫鍵交聯(lián)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。網(wǎng)孔的大小可用瓊脂糖的含量來(lái)控制。型號(hào)有Sephorose 2B、4B、6B等，分別表示瓊脂糖的含量為2%、4%、6%。含量越低，結(jié)構(gòu)越松散，空隙越大。瓊脂凝膠具有強(qiáng)親水性，適用于特大分子（分子量百萬(wàn)以上）成分的分離。

④聚丙烯酰胺凝膠　用丙烯酰胺在水中與N，N'-亞甲基二丙烯酰胺為交聯(lián)劑聚合而得。使用情況與葡聚糖凝膠相似，但強(qiáng)酸強(qiáng)堿環(huán)境不穩(wěn)定，使用范圍pH 2～11。

（2）流動(dòng)相

流動(dòng)相必須能夠溶解試劑，不能破壞凝膠的穩(wěn)定性，能潤(rùn)濕凝膠并使其膨脹，黏度要低，能保持—定的流動(dòng)性。分離水溶性樣品選擇極性溶劑和親水性溶劑，分離脂溶性成分選擇親脂性溶劑。

1.3.3.3　凝膠色譜的操作

（1）凝膠的預(yù)處理

裝柱前先量好柱的體積，再根據(jù)凝膠的吸水量計(jì)算出干重，在凝膠用選好的流動(dòng)相充分浸泡膨脹后備用。

（2）裝柱

一般選擇短而稍粗的柱子。采用濕法裝柱。凝膠裝入后，待凝膠沉集后，再通過2～3倍柱體積的溶劑，使柱床穩(wěn)定，并始終保持凝膠表面有一定的溶劑。

（3）加樣、洗脫及收集

把需要分離的成分溶于選擇的溶劑中，加樣前為防止破壞柱床，表面放一張濾紙，上樣方法同一般柱色譜。洗脫劑和浸泡凝膠所用的溶劑相同。分段收集，定性檢查，合并同一組分，再進(jìn)行精制。

（4）凝膠的再利用

凝膠柱可反復(fù)使用，無(wú)須再生處理。

1.3.3.4　凝膠色譜的應(yīng)用

凝膠色譜是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來(lái)的一種分離分析技術(shù)，主要用于分子大小不同的化合物的分離。凝膠色譜法不僅在分離大分子化合物方面廣泛應(yīng)用，在分離小分子化合物或其他方面如脫鹽、吸水濃縮、除熱原及粗略測(cè)定高分子物質(zhì)的分子量方面也均可應(yīng)用。

如用凝膠色譜分離多糖。先選用孔隙小的凝膠如G-25、G-50等，脫去無(wú)機(jī)鹽及其他小分子化合物，再選用孔隙大的凝膠如G-150、G-200等分離大分子多糖類。洗脫液為各種濃度的鹽溶液及緩沖液。

1.3.4　大孔樹脂色譜

1.3.4.1　大孔吸附樹脂色譜原理

大孔吸附樹脂色譜（macroreticular resin）是以大孔吸附樹脂為介質(zhì)的柱色譜分離形式。具有吸附和分子篩雙重作用。吸附性主要來(lái)源于范德華力和氫鍵，分子篩性來(lái)源于大孔樹脂的多孔性結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的滲透和過濾作用。被分離的成分根據(jù)其分子的大小不同和吸附力的差異而分離。

1.3.4.2　大孔吸附樹脂色譜基本構(gòu)成

（1）固定相

為大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子吸附劑，不溶于酸、堿及有機(jī)溶劑，在溶劑中體積會(huì)發(fā)生膨脹。使用時(shí)可根據(jù)被分離成分的極性和分子大小來(lái)選擇具有不同極性和大小的大孔吸附樹脂，以及決定大孔吸附樹脂體積膨脹大小不同的溶劑。如分離大分子的物質(zhì)選擇能使大孔吸附樹脂體積膨脹大的溶劑；反之，選用使其體積膨脹小的溶劑。

大孔吸附樹脂按其極性大小和所選用的單體分子結(jié)構(gòu)不同，可分為非極性、中極性和極性三類。

①非極性大孔吸附樹脂　是由偶極矩很小的單體聚合制得。不帶任何官能團(tuán)，孔表的疏水性較強(qiáng)，可通過與小分子內(nèi)的疏水部分的作用吸附溶液中的有機(jī)物，最適于極性溶劑中吸附非極性物質(zhì)，也稱為芳香族吸附劑，如苯乙烯、二乙烯苯聚合物。

②中等極性大孔吸附樹脂　是含酯基的吸附樹脂，且多官能團(tuán)的甲基丙烯酸酯作為交聯(lián)劑。其表面兼有疏水和親水兩部分。既可由極性溶劑中吸附非極性物質(zhì)，又可由非極性溶劑中吸附極性物質(zhì)，也稱為脂肪族吸附劑，如聚丙烯酸酯型聚合物。

③極性大孔吸附樹脂　是指含酰胺基、氰基、酚羥基等含氮、氧、硫極性官能團(tuán)的吸附樹脂，它們通過靜電相互作用吸附極性物質(zhì)，如丙烯酰胺。

（2）流動(dòng)相

洗脫劑可用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等，應(yīng)根據(jù)不同物質(zhì)在樹脂上吸附力的強(qiáng)弱，選擇不同的洗脫劑和不同的洗脫劑濃度進(jìn)行洗脫；通過改變洗脫劑的pH值可使吸附物改變分子形態(tài)，易于洗脫下來(lái)；洗脫流速一般控制在0.5～5mL/min。

1.3.4.3　影響分離的主要因素

通常，極性較大的分子適用中極性樹脂上分離，極性較小的分子適用非極性樹脂上分離；體積較大的化合物選擇較大孔徑樹脂；上樣液中加入適量無(wú)機(jī)鹽可以增大樹脂吸附量；酸性化合物在酸性液中易于吸附，堿性化合物在堿性液中易于吸附，中性化合物在中性液中易于吸附；一般上樣液濃度越低越利于吸附；對(duì)于滴速的選擇，則應(yīng)保證樹脂可以與上樣液充分接觸吸附為佳。

1.3.4.4　大孔吸附樹脂色譜的操作

（1）樹脂預(yù)處理

取市售大孔吸附樹脂，用乙醇加熱回流洗脫（或用改良索氏提取器加熱洗脫），洗至洗脫液蒸干后無(wú)殘留物。經(jīng)乙醇洗凈的樹脂揮去溶劑后保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）裝柱

以乙醇濕法裝柱，繼續(xù)用乙醇在柱上流動(dòng)清洗，不時(shí)檢查流出的乙醇，至與水混合不呈白色渾濁為止（取1mL乙醇液加5mL水）。然后以大量的蒸餾水洗去乙醇，備用。少量乙醇存在將會(huì)大大降低樹脂的吸附力。

（3）加樣與洗脫

將樣品溶液加到樹脂床，選擇合適的洗脫液進(jìn)行洗脫。分段收集洗脫液，定性檢查合并同一組分。

（4）再生

樹脂柱經(jīng)反復(fù)使用后，樹脂表面及內(nèi)部殘留許多非吸附性成分或雜質(zhì)使柱顏色變深，柱效降低，因而需要再生，一般用95%乙醇洗至無(wú)色后用大量水洗去醇化即可。如樹脂顏色變深可用稀酸或稀堿洗脫后水洗。如柱上方有懸浮物可用水、醇從柱下進(jìn)行反洗將懸浮物洗出，經(jīng)多次使用有時(shí)柱床擠壓過緊或樹脂顆粒破碎影響流速，可從柱中取出樹脂，盛于一較大容器中用水漂洗除去小顆粒或懸浮物再重新裝柱使用。

1.3.4.5　大孔吸附樹脂色譜的應(yīng)用

由于大孔樹脂其本身組成與結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，具有吸附性和篩選性相結(jié)合的分離、純化多種功能，已廣泛應(yīng)用于環(huán)境保護(hù)、冶金工業(yè)、化學(xué)工業(yè)、制藥和醫(yī)學(xué)衛(wèi)生部門，特別適用于生物化學(xué)制品。

例如用大孔吸附樹脂提取分離甜葉菊苷：甜葉菊苷提取液通過D101（D型非極性）樹脂床，先用堿液洗，再用水洗，最后用95%乙醇洗脫，洗脫液處理后可得結(jié)晶。

1.3.5　離子交換色譜

1.3.5.1　離子交換色譜原理

離子交換色譜（ion-exchange chromatograph，IEC）中的固定相是一些帶電荷的基團(tuán)，這些帶電基團(tuán)通過靜電相互作用與帶相反電荷的離子結(jié)合。如果流動(dòng)相中存在其他帶相反電荷的離子，當(dāng)樣品進(jìn)入色譜柱后，樣品離子便與流動(dòng)相離子相互競(jìng)爭(zhēng)固定相表面的電荷位置，并因競(jìng)爭(zhēng)力的差異使樣品組分得到分離。離子交換劑的交換反應(yīng)可用下式表示：

R—SH++Na+Cl-R—SNa++HCl

R≡N+—OH-+Na+Cl-R≡N+·Cl-+NaOH

上述的交換反應(yīng)是可逆的，但在色譜柱上進(jìn)行時(shí)，由于連續(xù)加入新的被交換的溶液，而交換反應(yīng)后的生成物又不斷地從色譜柱下端流出，不同的離子與同一樹脂交換能力不同，移動(dòng)速度也不同。此時(shí)的反應(yīng)主要按正反應(yīng)方向進(jìn)行，此過程為交換過程。利用反應(yīng)的可逆性，選擇適宜的帶有陽(yáng)離子或陰離子的溶液為洗脫劑，通過樹脂柱，反應(yīng)按逆方向進(jìn)行，已交換的離子又可游離而被洗脫下來(lái)，此過程為樹脂的再生。

1.3.5.2　離子交換色譜基本構(gòu)成

（1）固定相

固定相是離子交換劑，有離子交換樹脂和硅膠化學(xué)鍵合離子交換劑兩類。常用的是離子交換樹脂。根據(jù)交換離子的性能不同，離子交換樹脂可分為陽(yáng)離子交換樹脂和陰離子交換樹脂兩大類。每類樹脂又根據(jù)官能團(tuán)不同分為強(qiáng)酸、弱酸、強(qiáng)堿、弱堿等類型。商品樹脂的類型是鈉型（陽(yáng)離子型）和氯型（陰離子型），而交換時(shí)用的氫型和氫氧型。

①離子交換樹脂的組成　由樹脂母體和交換基團(tuán)組成。以聚苯乙烯樹脂為例，它是以苯乙烯為單體、二乙烯苯為交聯(lián)劑聚合而成的球形網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)為母體，然后在母體上再連接上許多活性交換基團(tuán)，這些基團(tuán)的氫離子可被其他離子置換。如果在聚苯乙烯上引入一些堿性基團(tuán)，如季銨基、伯氨基、仲氨基和叔氨基等基團(tuán)，這類樹脂為陰離子交換樹脂。

②離子交換樹脂的性能

a.交聯(lián)度　表示離子交換樹脂中交聯(lián)劑的含量，以質(zhì)量百分?jǐn)?shù)表示。二乙烯苯常用來(lái)作為合成樹脂的交聯(lián)劑，交聯(lián)度指二乙烯苯在原料總質(zhì)量所占有的百分?jǐn)?shù)。商品交聯(lián)度1%～16%的都有。例如型號(hào)732（強(qiáng)酸1×7）的聚苯乙烯型強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹脂，其中1×7表示交聯(lián)度為7%。交聯(lián)度與樹脂的空隙大小有關(guān)：交聯(lián)度大，網(wǎng)孔小，形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)緊密；交聯(lián)度小，網(wǎng)孔大，形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)疏松。

b.交換容量　每克干樹脂所含交換基團(tuán)的毫克當(dāng)量數(shù)稱為交換容量。樹脂的交換容量一般為1～10mmol/g，實(shí)際的交換容量受交聯(lián)度和溶液pH值影響，都低于理論值。交換容量表示與某離子交換能力的大小。

③樹脂選擇的一般規(guī)律

a.陽(yáng)離子交換劑帶有負(fù)電荷，用于陽(yáng)離子的分離；陰離子交換劑帶有正電荷，用于陰離子分離。被分離的離子吸附性強(qiáng)（交換能力強(qiáng)），選用弱酸或弱堿型離子交換樹脂，如用強(qiáng)酸強(qiáng)堿型樹脂，則由于吸附能力過強(qiáng)而使洗脫再生困難；被分離的離子吸附性弱，選用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿型離子交換樹脂，如用弱堿型則不能很好地交換或交換不完全。

b.陽(yáng)離子交換劑最常用的官能團(tuán)是磺酸鹽型，陰離子交換劑最常用的官能團(tuán)是季銨型。除強(qiáng)離子交換劑外，還有弱離子交換劑，它們的交換官能團(tuán)具有弱酸性或弱堿性。羧酸（—COOH）交換劑是一種弱陽(yáng)離子交換劑，只能在pH高到使羧酸解離時(shí)才起交換作用。叔胺（—NR3）基交換劑是弱陰離子交換劑，只有在酸性介質(zhì)中才有交換作用。

c.被分離物質(zhì)分子量大，選用低交聯(lián)度的樹脂。分離生物堿、大分子有機(jī)酸及肽類，宜采用1%～4%交聯(lián)度的樹脂。分離氨基酸可用8%交聯(lián)度的樹脂。制備無(wú)離子水或分離無(wú)機(jī)成分，可用16%交聯(lián)度的樹脂。

d.作色譜分離用的離子交換樹脂，要求顆粒細(xì)，一般用200～400目；作提取離子型成分用的樹脂，粒度可較粗，用100目左右；制備無(wú)離子水或分離無(wú)機(jī)成分的樹脂可用16～60目。無(wú)論作什么用，都應(yīng)選用交換大容量的。

（2）流動(dòng)相

離子交換色譜的流動(dòng)相通常是含鹽的緩沖水溶液。為了適應(yīng)不同的分離需要，有時(shí)添加適量的能與水相溶的有機(jī)溶劑，如甲醇、乙腈、四氫呋喃等，以改進(jìn)樣品的溶解性能，提高選擇性，改善分離效果。

在以水溶液為流動(dòng)相的離子色譜中，緩沖溶液的濃度直接影響著離子平衡。當(dāng)緩沖液濃度增加時(shí)，流動(dòng)相中反離子濃度的增加，增強(qiáng)了它與樣品離子爭(zhēng)奪離子交換官能團(tuán)的能力，從而減弱樣品組分與離子交換樹脂的親和性。流動(dòng)相中的離子類型對(duì)樣品分子的保留值產(chǎn)生顯著的影響。流動(dòng)相中不同的離子與離子交換樹脂相互作用的能力不同。

在離子交換色譜中，還可以通過改變流動(dòng)相的pH值來(lái)控制樣品分子的保留值。pH值能影響樣品分子的解離程度，從而影響它們與離子交換劑相互作用的強(qiáng)弱。在陽(yáng)離子交換色譜中增加pH值，溶質(zhì)分子的解離減少，降低了它們與離子交換劑上陽(yáng)離子的競(jìng)爭(zhēng)能力，從而降低了保留值。

1.3.5.3　離子交換樹脂的操作

（1）樹脂的預(yù)處理

新出廠的樹脂，要用水浸泡，使之充分吸水膨脹，還要用酸堿處理除去不溶于水的雜質(zhì)。一般步驟是先用水浸泡24h，傾出水后洗至澄清，加2～3倍量的2mol/L鹽酸攪拌2h，除酸后用水洗至中性，加4～5倍量2mol/L氫氧化鈉攪拌2h，除堿后洗至中性，再用適當(dāng)試劑處理，備用。

（2）裝柱

離子交換用的柱子有玻璃、有機(jī)玻璃、塑料及不銹鋼各種制品，要求都要耐酸堿，柱直徑和長(zhǎng)度比一般為1∶（10～20），為了提高分離效果可采用較長(zhǎng)的柱，裝柱方法與吸附柱色譜的濕法裝柱相同，用的溶劑是水。

（3）加樣、洗脫與收集

將樣品溶于水或酸堿溶液中配成樣品溶液，加入柱內(nèi)，溶液中的離子與樹脂中的離子發(fā)生交換而被吸附在樹脂上，為使交換反應(yīng)進(jìn)行完全，要把流速控制在1～2mL/（cm2·min），待樣品溶液流完，用蒸餾水沖洗樹脂柱，用蒸餾水沖洗樹脂柱，洗去殘留液，再進(jìn)行洗脫。對(duì)復(fù)雜的多組成分可采用梯度洗脫法，洗出液按體積分段收集，色譜分離檢驗(yàn)，合并相同組分，回收溶劑即可得到單一成分。

（4）樹脂的再生

樹脂的再生是指離子交換樹脂在使用后失去交換能力，通過處理恢復(fù)交換能力的過程。再生的方法基本與預(yù)處理相同

1.3.5.4　離子交換色譜的應(yīng)用

離子交換色譜是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來(lái)的分析技術(shù)。主要用于能產(chǎn)生離子型的成分如生物堿、有機(jī)酸、酚類、氨基酸、肽類等成分的分離，并廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、環(huán)保（如水質(zhì)的測(cè)定）、食品等多種行業(yè)。

例如用陽(yáng)離子交換樹脂分離去除生物堿酸水液中非生物堿部分，主要流程如下：

生物堿酸水液→通過陽(yáng)離子交換樹脂→堿化交換后的樹脂→有機(jī)溶劑洗脫→總生物堿。　

1.3.6　高效液相色譜

1.3.6.1　高效液相色譜原理

高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）又稱高壓液相色譜、高速液相色譜、高分離度液相色譜、近代柱色譜等。高效液相色譜是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。

1.3.6.2　高效液相色譜的類型

按分離原理不同分為分配色譜、吸附色譜、離子交換色譜和凝膠色譜。按固定相和流動(dòng)相極性選擇不同分為正相色譜和反相色譜（同分配色譜中的分類）。高效液相色譜中最常見的是化學(xué)鍵合相色譜（BPC），是以化學(xué)鍵合相作為固定相的色譜。按固定相極性不同分為正相化學(xué)鍵合相色譜和反相化學(xué)鍵合相色譜，分別簡(jiǎn)稱為正相鍵合相色譜和反相鍵合相色譜。按固定相和流動(dòng)相的聚集狀態(tài)不同分為液-固色譜（LSC）和液-液色譜（LLC）。

1.3.6.3　高效液相色譜的主要組成

高效液相色譜的基本裝置包括貯液槽、高壓泵、進(jìn)樣器、色譜柱及高靈敏度的檢測(cè)器、數(shù)據(jù)處理器等（圖1.14）。

1.3.6.4　高效液相色譜的特點(diǎn)

（1）高壓

液相色譜法以液體為流動(dòng)相（稱為載液），液體流經(jīng)色譜柱，受到阻力較大，為了迅速地通過色譜柱，必須對(duì)載液施加高壓。一般可達(dá)150×105～350×105Pa。

（2）高速

流動(dòng)相在柱內(nèi)的流速較經(jīng)典色譜快得多，一般可達(dá)0.1～10mL/min。高效液相色譜法所需的分析時(shí)間比經(jīng)典液相色譜法少得多，一般少于1h。

（3）高效

近來(lái)研究出許多新型固定相，使分離效率大大提高。

（4）高靈敏度

高效液相色譜已廣泛采用高靈敏度的檢測(cè)器，進(jìn)一步提高了分析的靈敏度。用樣量小，一般幾微升。

（5）適應(yīng)范圍寬

氣相色譜法與高效液相色譜法的比較：氣相色譜法雖具有分離能力好、靈敏度高、分析速度快、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，但是受技術(shù)條件的限制，沸點(diǎn)太高的物質(zhì)或熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)都難以應(yīng)用氣相色譜法進(jìn)行分析。而高效液相色譜法，只要求試樣能制成溶液，而不需要汽化，因此不受試樣揮發(fā)性的限制。對(duì)于高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、分子量大（大于400）的有機(jī)物（這些物質(zhì)幾乎占有機(jī)物總數(shù)的75%～80%）原則上都可應(yīng)用高效液相色譜法來(lái)進(jìn)行分離、分析。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在已知化合物中，能用氣相色譜分析的約占20%，而能用液相色譜分析的約占70%～80%。

1.3.6.5　高效液相色譜的應(yīng)用

高效液相色譜是目前中藥化學(xué)分離檢測(cè)的常規(guī)方法。除了作為分析檢測(cè)手段外，制備型高效液相也得到了廣泛應(yīng)用。例如，用傳統(tǒng)方法提取紫杉醇粗結(jié)晶后，采用制備型HPLC純化重結(jié)晶，可得到更純的紫杉醇結(jié)晶。

1.3.7　氣相色譜

（1）氣相色譜原理

氣象色譜法是指用氣體作為流動(dòng)相的色譜法。當(dāng)一種不與被分析物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的被稱為載氣的永久性氣體（例如H2、N2、He、Ar、CO2等）攜帶樣品中各組分通過裝有固定相的色譜柱時(shí)，由于試樣分子與固定相分子間發(fā)生吸附、溶解、結(jié)合或離子交換，使試樣分子隨載氣在兩相之間反復(fù)多次分配，使那些分配系數(shù)只有微小差別的組分發(fā)生很大的分離效果，從而使不同組分得到完全分離。原理如圖1.15所示。

（2）氣相色譜流程

載氣由高壓鋼瓶中流出，經(jīng)減壓閥降壓到所需壓力后，通過凈化干燥管使載氣凈化，再經(jīng)穩(wěn)壓閥和轉(zhuǎn)子流量計(jì)后，以穩(wěn)定的壓力、恒定的速度流經(jīng)氣化室與氣化的樣品混合，將樣品氣體帶入色譜柱中進(jìn)行分離。分離后的各組分隨著載氣先后流入檢測(cè)器，然后載氣放空。檢測(cè)器將物質(zhì)的濃度或質(zhì)量的變化轉(zhuǎn)變?yōu)橐欢ǖ碾娦盘?hào)，經(jīng)放大后在記錄儀上記錄下來(lái)，就得到色譜流出曲線。

根據(jù)色譜流出曲線上得到的每個(gè)峰的保留時(shí)間，可以進(jìn)行定性分析，根據(jù)峰面積或峰高的大小，可以進(jìn)行定量分析。

（3）氣相色譜儀

氣相色譜由氣路系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、溫控系統(tǒng)、檢測(cè)記錄系統(tǒng)組成。組分能否分開，關(guān)鍵在于色譜柱；分離后組分能否鑒定出來(lái)則在于檢測(cè)器，所以分離系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)是儀器的核心。

（4）氣相色譜法的特點(diǎn)

由于樣品在氣相中傳遞速度快，因此樣品組分在流動(dòng)相和固定相之間可以瞬間達(dá)到平衡。另外加上可選作固定相的物質(zhì)很多，因此氣相色譜法是一個(gè)分析速度快和分離效率高的分離分析方法。近年來(lái)采用高靈敏選擇性檢測(cè)器，使得它又具有分析靈敏度高、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。

（5）氣相色譜法的應(yīng)用

氣相色譜用于測(cè)定易揮發(fā)或可以轉(zhuǎn)化為易揮發(fā)的物質(zhì)，如揮發(fā)性成分的定性定量、有機(jī)殘留的檢測(cè)，在天然藥物的指紋圖譜和農(nóng)藥殘留分析等方面有很大的用途。