第一節(jié)　結(jié)構(gòu)研究的一般程序

一、化合物純度的判定

化合物純度的判定是結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)。化合物混有雜質(zhì)，純度不夠，會(huì)大大增加結(jié)構(gòu)鑒定的難度或產(chǎn)生錯(cuò)誤結(jié)論。因此結(jié)構(gòu)研究的第一步就是要確定化合物的純度。判定純度的方法主要有以下兩種。

1.根據(jù)化合物的理化性質(zhì)和常數(shù)判定

固體物質(zhì)根據(jù)有無一致的晶形和均勻的色澤、有無明確的熔點(diǎn)和較窄的熔距進(jìn)行判定；液體物質(zhì)根據(jù)有無恒定的沸點(diǎn)、沸程、折射率及相對(duì)密度等判定。若是已知物，則只要將其比旋度與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)比，如相同則表明其已是或接近純品。

2.根據(jù)化合物的色譜行為判定

這是最常用的方法。目前結(jié)構(gòu)鑒定中采用的色譜方法包括薄層色譜（TLC）、紙色譜（PC）、氣相色譜（GC）和高效液相色譜（HPLC）等。需要注意的是，無論采用何種色譜法檢查，一般需用多種差別較大的溶劑系統(tǒng)或色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，均顯示單一的斑點(diǎn)或色譜峰時(shí)方可認(rèn)為是單一化合物。必要時(shí)可以把正相和反相色譜方式相結(jié)合，從多角度確保準(zhǔn)確性。

二、理化常數(shù)的測(cè)定

天然化合物結(jié)構(gòu)研究中常測(cè)定的理化常數(shù)有：熔點(diǎn)（固體純物質(zhì)熔距范圍為0.5～1.0℃）、沸點(diǎn)（除高沸點(diǎn)物質(zhì)外，液體純物質(zhì)沸程≤5℃）、比旋度、折射率、相對(duì)密度、pH、不同溶劑中溶解度、灼燒試驗(yàn)和化學(xué)定性反應(yīng)等。這些理化常數(shù)能為化合物的種類和結(jié)構(gòu)的推測(cè)提供必要的線索。

三、分子式的確定與不飽和度的計(jì)算

1.測(cè)定分子式

分子式的測(cè)定方法主要有3種，即元素定量分析配合分子量測(cè)定法、同位素豐度比法和高分辨質(zhì)譜法。但隨著方便快捷的高分辨質(zhì)譜儀的普及，前兩種確定分子式的方法現(xiàn)已很少使用。

（1）元素定量分析配合分子量測(cè)定

元素定量分析前，通常先進(jìn)行元素定性分析，如采用鈉融法等，一般都委托專門的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。當(dāng)化合物僅含C、H、N、S、O五種元素時(shí)，通常只做前四種元素的定量，O通過扣除法計(jì)算。一般幾毫克樣品即可用元素分析儀分析C、H、N、S、O等元素各自的比例；如果樣品量多達(dá)幾十毫克，還可以測(cè)定某些金屬元素的占比，如鈉等。

其次，測(cè)定化合物的分子量。主要測(cè)定方法有冰點(diǎn)下降法（固體物質(zhì)）、沸點(diǎn)上升法（液體物質(zhì)）、黏度法、凝膠過濾法等，但目前最常用的方法是質(zhì)譜法。值得強(qiáng)調(diào)的是，待測(cè)樣品純度必須足夠，否則測(cè)定結(jié)果沒有意義。這里以青蒿素為例，分析過程如下：

① 元素定量分析

元素定量分析得到下列結(jié)果：

C：63.72%；H：7.86%

從100%中扣除C、H后，得：

O=100%-63.72%-7.86%=28.42%

分別以各元素的百分含量除以各元素的原子量，即可求出三種元素在結(jié)構(gòu)中所占的比例，繼以各數(shù)除以其中數(shù)值最小的一項(xiàng)，即得三種原子比。

按倍比定律，原子間的化合一定是整數(shù)，若上述原子比約簡化為C3H4O，則該實(shí)驗(yàn)式的各元素百分含量與實(shí)測(cè)值差異較大；若將上述原子比簡化為3∶4.4∶1，則其最小公倍數(shù)即C15H22O5，其中各元素百分比與實(shí)測(cè)值基本一致。數(shù)據(jù)對(duì)比如下：

實(shí)驗(yàn)式：C15H22O5

理論值：C，63.81%；H，7.85%；O，28.34%

實(shí)測(cè)值：C，63.72%；H，7.86%；O，28.42%

顯然C15H22O5的理論值與實(shí)測(cè)值比較相近，故確定該化合物分子式為（C15H22O5）n，n=1，2，3…，確切的分子式則等分子量測(cè)定后才能確定。

② 分子量的測(cè)定　該化合物由電子轟擊質(zhì)譜（EI-MS）法測(cè)得的分子離子峰[M]+為282。

即：（C15H22O5）×n=282，n=282/282=1

故確定青蒿素的分子式為C15H22O5。

（2）同位素豐度比法

天然產(chǎn)物中常見的組成元素（氟、磷、碘除外）均由相對(duì)豐度恒定的同位素組成，重元素一般比輕元素重1～2個(gè)質(zhì)量單位。如表4-1所示。

故由重元素組成的分子比輕元素組成的分子一般要重1～2個(gè)質(zhì)量單位。因此在觀察具有穩(wěn)定分子離子峰的MS圖譜時(shí)，可在比分子離子峰[M]+多1～2個(gè)質(zhì)荷比（m/z）的地方同時(shí)見到[M+1]+和[M+2]+兩個(gè)同位素峰。特定化合物具有相對(duì)強(qiáng)度固定的[M]+、[M+1]+及[M+2]+峰（含Cl、Br時(shí)除外）。這就是為什么同位素豐度比法能夠求算分子式的原因。

同位素豐度比法試樣用量少，對(duì)Mr＜500且能生成穩(wěn)定分子離子的化合物而言，值得優(yōu)先使用。

（3）高分辨質(zhì)譜法（high resolution mass spectrometry，HR-MS）

高分辨質(zhì)譜法通過測(cè)定化合物的精確分子量然后直接由計(jì)算機(jī)計(jì)算出分子式。以12C=12.0000為基準(zhǔn)，1H、14N、16O等各元素原子的精確質(zhì)量分別是1.007825、14.00307、15.99491。由于HR-MS可將化合物的質(zhì)量精確到小數(shù)點(diǎn)后三位，故分子量相近的化合物可根據(jù)HR-MS得到的精確質(zhì)量進(jìn)行區(qū)分。表4-2中所列C15H22O5、C15H24NO4、C14H20NO5、C14H22N2O4四個(gè)化合物，由于其精確質(zhì)量不同，則通過HR-MS可區(qū)分出來。

2.不飽和度的計(jì)算

不飽和度的計(jì)算公式為：

u=Ⅳ-Ⅰ/2+Ⅲ/2+1

u表示不飽和度；Ⅰ為一價(jià)原子（如H，D，X）的數(shù)目；Ⅲ為三價(jià)原子（如N，P）的數(shù)目；Ⅳ為四價(jià)原子（如C，S）的數(shù)目。二價(jià)原子（如O，S）與不飽和度無關(guān)。

以C15H22O5化合物為例，不飽和度為：

u=15-22/2+0/2+1=5

四、化合物的功能團(tuán)和分子骨架的推定

在一個(gè)化合物的分子式確定后，就需要進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)骨架和官能團(tuán)的確定。一般而言，首先根據(jù)化合物的不飽和度，推算出結(jié)構(gòu)中可能含有的雙鍵數(shù)或環(huán)數(shù)，然后利用樣品與某種試劑發(fā)生顏色變化或產(chǎn)生沉淀等化學(xué)定性實(shí)驗(yàn)對(duì)化合物類型進(jìn)行初步判斷。顯色反應(yīng)時(shí)最好將未知樣品試驗(yàn)、空白試驗(yàn)及典型樣品試驗(yàn)平行進(jìn)行，以資對(duì)照。當(dāng)根據(jù)產(chǎn)生沉淀判斷結(jié)果時(shí)，要注意液體試樣量如過多，會(huì)使沉淀現(xiàn)象不明顯或沉淀溶解，掩蔽陽性結(jié)果；樣品分子中含有兩種以上官能團(tuán)時(shí)，可能干擾檢識(shí)反應(yīng)。因此，根據(jù)一種檢識(shí)反應(yīng)的結(jié)果尚不足以肯定或否定該官能團(tuán)的存在，最好做兩種以上試驗(yàn)，以求得正確的判斷。最后將化學(xué)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果與所測(cè)得的物理常數(shù)、波譜數(shù)據(jù)（UV，IR，NMR，MS等）結(jié)合起來綜合分析，以確定化合物含哪些功能團(tuán)，具有何種母核，屬于哪類化合物。當(dāng)然，現(xiàn)在測(cè)定化合物的波譜數(shù)據(jù)已經(jīng)非常方便快捷，故化學(xué)定性實(shí)驗(yàn)和理化常數(shù)測(cè)定可根據(jù)需要有選擇地測(cè)定。

五、化合物結(jié)構(gòu)的確定

對(duì)于已知化合物，若有對(duì)照品，則用對(duì)照品同時(shí)進(jìn)行熔點(diǎn)、混合熔點(diǎn)、色譜和紅外光譜對(duì)照。若無對(duì)照品，則需測(cè)試更多數(shù)據(jù)，或制備衍生物并核對(duì)文獻(xiàn)以確定結(jié)構(gòu)。對(duì)于未知化合物，應(yīng)測(cè)定該化合物或其衍生物的波譜數(shù)據(jù)，并進(jìn)行化學(xué)溝通以確定結(jié)構(gòu)。

由于同科屬生物容易代謝相似或相同的化合物，故在解析化合物的結(jié)構(gòu)之前，應(yīng)對(duì)同科屬的生物代謝產(chǎn)物的文獻(xiàn)進(jìn)行調(diào)查，并從其中獲得相應(yīng)的理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)。通過與這些已知化合物的數(shù)據(jù)比對(duì)，有助于對(duì)待定化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。另外，隨著計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)和信息處理技術(shù)的快速發(fā)展，商業(yè)化的核磁共振譜數(shù)據(jù)庫已經(jīng)可以提供給用戶快速的數(shù)據(jù)比對(duì)和相似度查詢，這大大提高了譜圖解析的速度。當(dāng)然，化合物的具體結(jié)構(gòu)還必須通過對(duì)譜圖進(jìn)行完整的解析和歸屬，才能最終確定。

總之，確定一個(gè)天然化合物的分子結(jié)構(gòu)，是一項(xiàng)較復(fù)雜的工作，涉及面廣，很難說有一個(gè)固定的、一成不變的研究程序。每個(gè)環(huán)節(jié)的應(yīng)用方法均各有側(cè)重，且因每個(gè)人的經(jīng)驗(yàn)、習(xí)慣及對(duì)各種方法熟練掌握、運(yùn)用的程度而異。一個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)研究往往是綜合化學(xué)工作、儀器分析、植物化學(xué)分類學(xué)及文獻(xiàn)檢索等工作而獲得的結(jié)果。