第三節(jié)　液相色譜技術(shù)的應(yīng)用

一、液相色譜技術(shù)在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用

（一）中藥材甘草中甘草苷及甘草酸含量的測定[參考《中華人民共和國藥典》（2015版）（以下簡稱《中國藥典》）第一部]

1.背景簡介

中藥材甘草為豆科植物烏拉爾甘草（Glycyrrhiza uralensis Fish.）、脹果甘草（Glycyrrhiza inflate Bat.）或光果甘草（Glycyrrhiza glabra L.）的干燥根及根莖。甘草在本草綱目草部中排位第一，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、潤肺止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥的作用。現(xiàn)代藥理研究證明，甘草具有抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、抗?jié)儭⒖笻IV、誘生干擾素、調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能、抗癌等作用，在醫(yī)藥、食品、飲料、煙草、化工、釀造、國防等行業(yè)有著極其廣泛的應(yīng)用。

依據(jù)《中國藥典》（2015版），甘草及其制品的含量通常以甘草酸及甘草苷計(jì)，文獻(xiàn)研究亦表明，甘草的主要化學(xué)成分為三萜類和黃酮類化合物，而甘草酸和甘草苷分別是這兩類化合物的代表，兩者是甘草中的主要有效成分，因此，甘草酸及甘草苷的含量常用于評價(jià)藥材和成藥的質(zhì)量、制劑穩(wěn)定性的優(yōu)劣等。同時(shí)，甘草因產(chǎn)地、栽培方法、生長環(huán)境和采收季節(jié)的不同，其成分及含量相差很大，甘草酸和甘草苷的含量測定也成為野生與栽培甘草確定最佳采收期的重要依據(jù)。所以，分析甘草中甘草酸和甘草苷的含量對于評定甘草的內(nèi)在品質(zhì)，進(jìn)而建立甘草的現(xiàn)代質(zhì)量評價(jià)體系、有效開發(fā)利用甘草資源都具有十分重要的意義。

2.方法的選擇

甘草苷和甘草酸的分析方法很多，主要有比色法、薄層色譜法、離子抑制色譜法、高效液相色譜法及氣相色譜法等。研究表明，香草醛-濃硫酸顯色后的比色法測定的是水溶性三萜皂苷的含量，但由于甘草黃酮類干擾物質(zhì)在254nm附近均有強(qiáng)烈的吸收，會導(dǎo)致含量偏高，誤差比較大；而薄層色譜或聚酰胺吸附等手段盡管可將甘草酸和甘草苷從甘草提取物體系中分離出來再進(jìn)行檢測，但會導(dǎo)致操作的復(fù)雜化。與其他分離方法相比，HPLC具有柱效高、靈敏度高、分離速度快、適用范圍廣、重復(fù)性好、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，已是中草藥化學(xué)研究中不可缺少的主要分離方法之一。所以，近幾年來，在甘草苷和甘草酸的測定過程中，以高效液相色譜法應(yīng)用最為廣泛。

《中國藥典》2015版一部對中藥材甘草中甘草苷和甘草酸含量的檢測采用液相色譜法，以70%乙醇溶液溶解甘草粉末，超聲提取后，液相色譜分離，紫外檢測器于波長237nm處檢測，外標(biāo)法定量。

3.提取方法

甘草研磨成粉，過三號篩，稱取過篩后粉末約0.2g（精確至0.01g），置于具塞錐形瓶中，準(zhǔn)確加入100mL 70%的乙醇溶液，加塞后稱定重量。超聲處理（功率250W，頻率40kHz）30min，冷卻至室溫，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻過濾，取濾液待測。

同時(shí)制備對照品溶液，取甘草苷對照品、甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加70%的乙醇溶液分別制成每1mL含甘草苷20μg、甘草酸銨0.2mg的溶液，待測。

4.儀器檢測方法

采用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑色譜柱，柱內(nèi)徑一般為3.9～4.6mm，填充劑粒徑為3～10μm。流動相A為乙腈，流動相B為0.05%磷酸溶液，梯度洗脫程序如下：0～8min，流動相A保持19%，8～35min流動相A由19%變?yōu)?0%；35～36min，流動相A由50%變?yōu)?00%；36～40min，流動相A由100%變?yōu)?9%。流速為1mL/min，進(jìn)樣量為10μL。采用上述色譜條件分別對試樣溶液、對照品溶液和空白試驗(yàn)溶液進(jìn)樣檢測。

注意事項(xiàng)：

① 采用本體系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，必須進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。其中色譜柱的理論塔板數(shù)要求以甘草苷計(jì)算不低于5000。

② 甘草酸的含量以甘草酸銨的量進(jìn)行折算，即：

③ 調(diào)整流動相組分比例時(shí)，當(dāng)小比例組分的百分比例X≤33%時(shí)，允許改變范圍為0.7X～1.3X；當(dāng)X＞33%時(shí)，允許改變范圍為X-10%～X+10%。

④ 若需使用小粒徑（約2μm）填充劑，輸液泵的性能、進(jìn)樣體積、檢測池體積和系統(tǒng)的死體積等必須與之匹配；如有必要，色譜條件也應(yīng)作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。當(dāng)對其測定結(jié)果產(chǎn)生爭議時(shí)，應(yīng)以藥典甘草品目規(guī)定的色譜條件的測定結(jié)果為準(zhǔn)。

5.定量結(jié)果計(jì)算

甘草苷或甘草酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可按如下公式計(jì)算：

式中　ω1——試樣中甘草苷或甘草酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；

V——試樣定容體積，mL；

cs——對照品溶液中甘草苷或甘草酸銨的濃度，mg/mL；

A——試樣溶液中甘草苷或甘草酸的峰面積；

As——對照品溶液中甘草苷或甘草酸的峰面積；

m——試樣質(zhì)量，mg；

ω2——樣品干燥減量的含量，%。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平行測定結(jié)果的算術(shù)平均值為準(zhǔn)（保留一位小數(shù)）。在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不大于算術(shù)平均值的5%。

說明：由于對照品甘草酸銨在該流動相條件下，以甘草酸的形式進(jìn)行分離，故公式中峰面積均指甘草酸的峰面積，但質(zhì)量濃度按甘草酸銨計(jì)算，所以，最終甘草酸含量計(jì)算時(shí)仍需要進(jìn)行折算。此外，甘草酸以18-α和18-β兩種形式存在，通常的含量計(jì)算以18-β分量計(jì)算。

6.應(yīng)用特點(diǎn)

甘草是我國最大量的常用中藥材之一，但近年來隨著甘草野生資源日益枯竭，種植甘草基本取代野生品種。由于種植甘草的條件、品種差異較大，甘草質(zhì)量的檢測日益為人們所重視。通過HPLC法對甘草中的主要藥效成分甘草苷和甘草酸進(jìn)行檢測，為甘草品質(zhì)的指標(biāo)控制提供了依據(jù)。同時(shí)，本方法對色譜柱規(guī)定了以甘草苷為標(biāo)準(zhǔn)的理論塔板數(shù)要求，為使用者正確挑選合適的色譜柱進(jìn)行甘草藥效成分的分離提供了便利，也確保本方法的色譜分離條件在不同實(shí)驗(yàn)室的順利進(jìn)行。

（二）左氧氟沙星中主成分含量及雜質(zhì)分析（參考《中國藥典》2015版）

1.背景介紹

氧氟沙星為第三代喹諾酮類抗菌藥，對葡萄球菌、鏈球菌、肺炎鏈球菌、淋球菌、大腸桿菌、枸櫞酸桿菌、志賀桿菌、肺炎克雷伯桿菌、腸桿菌屬、沙雷桿菌屬、變形桿菌、流感嗜血桿菌、不動桿菌、螺旋桿菌等有較好的抗菌作用，可用于治療由上述菌所致的呼吸道、咽喉、扁桃體、泌尿道（包括前列腺）、皮膚及軟組織、膽囊及膽管、中耳、鼻竇、淚囊、腸道等部位的急、慢性感染。氧氟沙星通常為左旋體和右旋體的混合物，研究表明，氧氟沙星的左旋體（左氧氟沙星）的抗菌效力高于右旋體，是氧氟沙星的2～8倍，且不良反應(yīng)明顯小于右旋體，因此臨床上應(yīng)用極為廣泛。

從制藥角度出發(fā)，相關(guān)藥物的雜質(zhì)不僅無效，而且可能危害人體健康或影響藥物的穩(wěn)定性，甚至導(dǎo)致不可預(yù)料的不良反應(yīng)，因此將雜質(zhì)控制在一個(gè)安全、合理的限度范圍內(nèi)對于藥品的質(zhì)量而言極其重要。所以，左氧氟沙星藥物中主成分的純度越高，藥物的抗菌效果越好。但是，在化學(xué)合成過程中必然會產(chǎn)生光學(xué)異構(gòu)體的副產(chǎn)物——右氧氟沙星，鑒于右氧氟沙星幾乎沒有抑菌作用，故對包括右氧氟沙星在內(nèi)的光學(xué)異構(gòu)雜質(zhì)進(jìn)行控制直接關(guān)系到左氧氟沙星藥品的質(zhì)量。《中國藥典》2015版二部中明確規(guī)定了左氧氟沙星制劑中相關(guān)雜質(zhì)、右氧氟沙星及左氧氟沙星含量的測定方法，對該類藥物的質(zhì)量控制提供了標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)。圖1-27為左氧氟沙星及相關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)圖。

2.方法的選擇

左氧氟沙星的分析方法主要有微生物抑制法、HPLC和LC-MS/MS等。微生物抑制法相對較為簡單，但結(jié)果的確定性稍差，經(jīng)常用于藥物類別的快速篩查。LC-MS/MS法靈敏度高，選擇性強(qiáng)，定量定性準(zhǔn)確，儀器價(jià)格及維護(hù)要求較高，在殘留量水平的左氧氟沙星檢測中應(yīng)用較多。與LC-MS/MS法相比，HPLC法區(qū)分異構(gòu)體能力強(qiáng)，定量能力出色，流動相類別選擇范圍更寬，儀器普及率高，在物質(zhì)主成分分析中應(yīng)用更多，據(jù)統(tǒng)計(jì)，約70%的藥物標(biāo)準(zhǔn)中含量測定采用HPLC方法。因此，測定藥品左氧氟沙星中主成分含量選擇HPLC法較為合適。

《中國藥典》2015版二部中對于左氧氟沙星的含量及相關(guān)物質(zhì)的檢測采用HPLC法，通過鹽酸溶液溶解藥品，利用色譜分離過程將左氧氟沙星和右氧氟沙星及相應(yīng)雜質(zhì)區(qū)分，分別用對照品加以定性、定量，確定藥品中各成分的含量水平。

3.左氧氟沙星的測定

（1）溶液配制　稱取藥品約50mg（精確至0.1mg），置于50mL容量瓶中，加0.1mol/L鹽酸溶液溶解并定量稀釋至刻度，搖勻。量取5mL，置于另一個(gè)50mL容量瓶中，用0.1mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，待測。

同時(shí)，稱取左氧氟沙星對照品適量，加0.1mol/L鹽酸溶液溶解并定量稀釋制成0.1mg/mL的左氧氟沙星對照品溶液，待測。

（2）儀器檢測方法　采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱；以醋酸銨高氯酸鈉溶液（取醋酸銨4.0g和高氯酸鈉7.0g，加水1300mL使溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.2）-乙腈（85∶15）為流動相；檢測波長為294nm，進(jìn)樣量為10μL。最終將樣品溶液和對照品溶液分別進(jìn)樣，以外標(biāo)法定量。

由于左氧氟沙星與環(huán)丙沙星及雜質(zhì)E出峰接近，因此使用本方法對左氧氟沙星進(jìn)行分離檢測前必須用相應(yīng)對照品進(jìn)行系統(tǒng)適用性驗(yàn)證，驗(yàn)證符合要求后方可進(jìn)行檢測。驗(yàn)證過程如下：稱取左氧氟沙星對照品、環(huán)丙沙星對照品和雜質(zhì)E對照品各適量，用0.1mol/L鹽酸溶液配制成含0.1mg/mL左氧氟沙星、5μg/mL環(huán)丙沙星和5μg/mL雜質(zhì)E的溶液，采用上述液相條件進(jìn)行色譜分離并檢測。如果左氧氟沙星與雜質(zhì)E和左氧氟沙星與環(huán)丙沙星色譜峰之間的分離度分別大于2.0與2.5，則該液相條件符合檢測要求，如果分離度未達(dá)到要求，則需要調(diào)整色譜柱的長度半徑及流動相的比例使分離度符合要求。

4.右氧氟沙星的測定

（1）溶液配制　稱取藥品適量，以硫酸銅+D-苯丙氨酸溶液-甲醇（82∶18）混合溶液配制成1.0mg/mL的樣品溶液。同時(shí)對樣品溶液進(jìn)一步稀釋，獲得10μg/mL的對照溶液；然后取對照溶液適量稀釋，獲得0.5μg/mL的靈敏度溶液。其中樣品溶液和對照溶液用于右氧氟沙星的含量測定，靈敏度溶液用于系統(tǒng)適用性驗(yàn)證。

（2）器檢測方法　采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱；以硫酸銅D-苯丙氨酸溶液（取D-苯丙氨酸1.32g與硫酸銅1g，加水1000mL溶解后，用氫氧化鈉試液調(diào)節(jié)pH值至3.5）-甲醇（82∶18）為流動相；柱溫40℃，檢測波長為294nm。進(jìn)樣量20μL。

（3）系統(tǒng)適用性驗(yàn)證　稱取左氧氟沙星和右氧氟沙星對照品各適量，用上述流動相制成含1mg/mL左氧氟沙星和20μg/mL右氧氟沙星的溶液，按上述儀器檢測條件進(jìn)行檢測，要求右氧氟沙星與左氧氟沙星依次流出，右、左旋異構(gòu)體峰的分離度應(yīng)符合要求。此外，取靈敏度溶液20μL按上述條件進(jìn)行分析，應(yīng)確保主成分色譜峰峰高的信噪比大于10。

注意：系統(tǒng)適用性驗(yàn)證必須符合要求方可進(jìn)一步進(jìn)行測定，如果驗(yàn)證結(jié)果不符合要求，則需要調(diào)整液相色譜的部分條件。

5.其他雜質(zhì)的檢測

（1）提取方法　稱取藥品適量，用0.1mol/L鹽酸溶液配制成1mg/mL的溶液，作為樣品溶液；取部分樣品溶液，進(jìn)一步用0.1mol/L鹽酸溶液稀釋，獲得2μg/mL的溶液，作為對照溶液；再取對照溶液適量，用0.1mol/L鹽酸溶液稀釋成每0.2μg/mL的溶液，作為靈敏度溶液。

另稱取雜質(zhì)A對照品約15mg（精確至0.1mg），置于100mL容量瓶中，加6mol/L氨水溶液1mL與水適量溶解，用水稀釋至刻度，搖勻；取2mL該溶液，置于另一個(gè)100mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為雜質(zhì)A的對照品溶液。

（2）儀器檢測方法　采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱，以醋酸銨高氯酸鈉溶液（取醋酸銨4.0g和高氯酸鈉7.0g，加水1300mL使溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.2）-乙腈（85∶15）為流動相A，乙腈為流動相B；按表1-5進(jìn)行梯度洗脫。柱溫為40℃；流速為每分鐘1mL。

系統(tǒng)適用性驗(yàn)證過程同3（2）。此外，靈敏度溶液按照上述液相色譜條件進(jìn)行檢測，進(jìn)樣量10μL，以294nm為檢測波長，主成分色譜峰峰高的信噪比應(yīng)大于10。

將樣品溶液、對照溶液和雜質(zhì)A對照品溶液按上述條件進(jìn)行檢測，進(jìn)樣量均為10μL，分別以294nm和238nm為檢測波長。藥典對左氧氟沙星藥品的質(zhì)控要求為：樣品溶液中如有雜質(zhì)峰，雜質(zhì)A（238nm檢測）按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，不得過0.3%，其他單個(gè)雜質(zhì)（294nm檢測）峰面積不得大于對照溶液主峰面積（0.2%），其他各雜質(zhì)（294nm檢測）峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積的2.5倍（0.5%）。供試品溶液色譜圖中小于靈敏度溶液主峰面積的峰忽略不計(jì)。

6.應(yīng)用特點(diǎn)

本應(yīng)用針對氧氟沙星的異構(gòu)體及主要雜質(zhì)進(jìn)行檢測，充分發(fā)揮了HPLC的優(yōu)勢。在左旋體和右旋體的分離以及氧氟沙星與雜質(zhì)的分離過程中使用了不同的流動相，通過不同鹽類的加入，確保不同的分離目的都能實(shí)現(xiàn)。同時(shí)本應(yīng)用強(qiáng)調(diào)了系統(tǒng)適用性驗(yàn)證，以不同組分的分離度為標(biāo)準(zhǔn)保證液相色譜條件在不同實(shí)驗(yàn)室均能獲得良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。依照可適當(dāng)對色譜柱和流動相比例進(jìn)行調(diào)整的原則，也給實(shí)際使用提供了應(yīng)用的便利。

（三）尿中2-硫代噻唑烷-4-羧酸的測定（參考WS/T 40—1996）

1.背景簡介

在現(xiàn)代化工業(yè)體系中，二硫化碳不僅是一種重要的化工原料，可用于生產(chǎn)粘膠纖維、玻璃、人造絲、賽璐玢、四氯化碳、農(nóng)藥殺菌劑、橡膠助劑等，而且還是一種優(yōu)良的有機(jī)溶劑，可作為羊毛去脂劑、衣服去漬劑、金屬浮選劑、油漆和清漆的脫膜劑、航空煤油添加劑等在油脂生產(chǎn)、蠟、冶金、船舶和航空領(lǐng)域應(yīng)用。但是，二硫化碳本身具有毒性，輕度中毒會有頭暈、頭痛、眼及鼻黏膜刺激癥狀，一旦重度中毒可呈短時(shí)間的興奮狀態(tài)，繼之出現(xiàn)譫妄、昏迷、意識喪失，伴有強(qiáng)直性及陣攣性抽搐，可因呼吸中樞麻痹而死亡。而長期接觸人員會引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及心血管系統(tǒng)的損傷。目前，一些國家如美國、日本等規(guī)定大氣中CS2的最高容許濃度為30mg/m3，我國則規(guī)定在CS2車間空氣中最高容許濃度為10mg/m3。所以，通過檢測手段判別人體接觸二硫化碳的程度對于保護(hù)工業(yè)生產(chǎn)中職業(yè)接觸人員的健康具有重要的意義。

1981年，Van D.R.等從接觸二氧化硫的工人尿中分離到2-硫代噻唑烷-4-羧酸（TTCA），此后的研究表明，TTCA是二硫化碳在體內(nèi)與谷胱甘肽結(jié)合所生成的特異性代謝產(chǎn)物，CS2被人體吸入后大約有0.7%～2.3%在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為TTCA。因此，目前國內(nèi)外已公認(rèn)采用接觸工人尿中TTCA含量作為接觸CS2的生物監(jiān)測指標(biāo)，所以，對尿中TTCA的檢測已成為CS2職業(yè)接觸人員職業(yè)健康監(jiān)護(hù)的重要技術(shù)手段。

2.方法的選擇

由于CS2通過呼吸道或皮膚攝入體內(nèi)后，尿中的代謝產(chǎn)物是硫酸鹽和對碘疊氮基反應(yīng)具有陽性的物質(zhì)，因此，對尿液中有機(jī)硫代謝產(chǎn)物的檢測曾采用碘疊氮實(shí)驗(yàn)法，但該法靈敏度低，且無法用于空氣中CS2濃度為20mg/L以下的接觸者，實(shí)用性較差。1981年，Van D.R.等最初選擇了HPLC作為TTCA的檢測方法，之后的研究表明，對于10mg/L濃度以下（常規(guī)CS2使用車間的濃度水平）的接觸人群而言，HPLC法可以準(zhǔn)確靈敏地監(jiān)測相應(yīng)人員尿中的TTCA含量，所以，目前HPLC法是醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域?qū)δ蛑蠺TCA監(jiān)測的主要方法。

中國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T 40—1996規(guī)定了尿中TTCA的高效液相色譜測定方法，方法的最低檢測濃度為8μg/L，適用于接觸CS2人員尿中TTCA的測定。該方法借助鹽酸酸化尿樣，用乙醚提取TTCA，液相色譜分離，紫外檢測器測定，外標(biāo)法定量。

3.尿中TTCA的測定

取1mL尿樣，加入0.1mL 2mol/L鹽酸溶液及5mL乙醚，振蕩提取2min，3000r/min離心10min后取乙醚層，于40℃水浴氮吹至干，用200μL甲醇復(fù)溶。同時(shí)配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

采用反相C18鍵合硅膠色譜柱，流動相為甲醇+水+冰醋酸（14.5+84.5+1），流速1.5mL/min，紫外檢測波長為273nm，進(jìn)樣體積20μL。將樣品與標(biāo)準(zhǔn)溶液依次檢測（圖1-28）。

按照公式將尿樣換算成標(biāo)準(zhǔn)相對密度下濃度的校正系數(shù)：

式中，實(shí)測相對密度為樣品用尿比重管測定的值。

按照公式計(jì)算尿中TTCA的濃度：

式中　X——尿中TTCA的濃度，mg/L；

c——從標(biāo)準(zhǔn)曲線上算得的TTCA濃度，μg/20μL。

注意事項(xiàng)：質(zhì)控樣必須考慮本底值，防止結(jié)果整體誤差。尿樣量取前如有渾濁，需離心后再取，經(jīng)乙醚提取后務(wù)必再次離心，確保分層清晰，轉(zhuǎn)移完全。

4.應(yīng)用特點(diǎn)

鑒于尿液中含有眾多代謝物質(zhì)，本方法用酸性乙醚提取，可以去除一些干擾雜質(zhì)；同時(shí)利用等度洗脫，簡化了應(yīng)用模式，只需要一個(gè)泵即可進(jìn)行檢測，利于推廣。但對于有條件的機(jī)構(gòu)，也可以恢復(fù)成雙泵，梯度洗脫模式，增加了方法整體的靈活性。該方法用于現(xiàn)場及時(shí)檢驗(yàn)，簡便、靈敏、選擇性好。