二、液相色譜儀的發展方向

自20世紀70年代以來，高效液相色譜技術經歷了快速的發展，在石油化工、有機合成、醫藥衛生、農業、食品、環境保護等領域獲得了廣泛應用。目前，近80%的有機化合物均可采用HPLC進行檢測分析。然而，隨著藥物領域的高通量篩選、食品領域的快速檢測以及環境領域的及時監控等檢測需求的不斷拓展，對HPLC在更高通量和更優性能的發展方面提出了新的要求。

2004年，Waters公司推出了ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀并帶動亞2μm色譜柱快速發展；2005～2006年，賽默飛公司推出了LTQ Orbitrap，不僅作為一種新型高分辨質譜儀問世，同時作為檢測器，推動了液相色譜-高分辨質譜聯用在更廣泛領域的應用；2007～2008年，多孔核殼顆粒和HILIC色譜柱引起人們的關注；2009～2011年，用于手性分離的多糖固定相及生物分子色譜柱開始進入人們的視野。縱觀近10年的發展，為了趨近快速、超高效的目標，HPLC在色譜柱及固定相、超高壓輸液泵及高速采樣檢測器等方面體現出了新的發展趨勢。

（一）色譜柱及固定相的發展

HPLC色譜柱是色譜系統的核心。制藥、食品和環境的需求一直是HPLC色譜柱向高速、高分辨率、更好的峰形發展的主要驅動力。從20世紀70年代到90年代，在填充材料的標準顆粒尺度（10～3μm）的逐級縮小方面已經有穩定的改進。80年代后期，高純度B型硅材料（低金屬含量）的引入是一個巨大進步，減小了硅醇的活性，并在批次間的一致性方面有重大改進。現在高純硅的使用是所有現代硅膠基質色譜柱的標準。

近年來，很多學者綜述了HPLC色譜柱技術的進展，表1-3總結了重大行業使用率較高的，用于提高生產力、穩定性、選擇性、保留時間或專業應用的色譜柱。

1.亞2 μm顆粒

1956年，Van Deemter就給出了使用非常小的顆粒進行快速、高效分離的預測。在過去幾年中，典型填料的粒徑不斷減小，21世紀初的研究主要集中在亞2μm的硅膠顆粒上。正如預測的那樣，這些粒子（例如，1.7μm）可以產生卓越的性能（約280000塊塔板/m或約4μm/塊塔板）。然而，填充亞2μm粒子的色譜柱會產生高的背壓，通常采用填充內徑為2.1mm的色譜柱的方式，通過黏性發熱減小效率損失。對高壓力和低分散（減少附加柱的譜帶展寬）系統的要求導致了現代UHPLC系統的特點。進一步降低粒徑至小于1.5μm可能會產生更高的速度和性能。然而，它也必須伴隨著系統壓力的大幅增加和毛細管色譜柱內徑的減小。

2.核殼結構顆粒Kirkland

熔融的核或者核殼粒子可以減小質量轉移過程中的阻力。近年來研發的第一個核殼粒子具有如下特點：2.7μm表面多孔硅材料，無孔的核心（1.7μm）和多孔的殼層（厚0.5μm）。這些亞3μm的顆粒與亞2μm的完全多孔材料相比似乎具有相似的效率，但是可以產生更低的壓降。這種特殊的性能可能是由于殼體較短的擴散路徑，或者比較狹窄的填料分布。由于快速分離和在生物分子方面的應用，核殼色譜柱迅速獲得廣泛的接受。越來越多的制造商可以提供各種鍵合相和不同尺寸的粒子（1.3μm，1.7μm，2.6μm，1.3μm和5μm）。因此，與多孔微細顆粒的色譜柱相比，這些色譜柱在所有應用中具有很強的競爭力。

3.雜化

將有機基團引入到無機硅基體中形成雜交顆粒的理念在20世紀70年代首次由Unger提出，然而第一根具有甲基基團的商業化的色譜柱在1999年才正式推出。與傳統pH范圍為2～8的具有常規單功能鍵合的硅顆粒相比，這些混合物中的鍵合相被證明具有很好的pH穩定性（pH范圍為1～12）和較低的親硅羥基活性。2005年，引入第二代橋聯乙烯雜化（BEH），在高pH值流動相以及UHPLC的應用上獲得了極好的反響。

迄今為止，傳統單官能團的C18硅膠基質鍵合相由于批次之間重現性較好，仍是應用領域主要的產品。但是，新的鍵合化學反應使困難的分離（如極性嵌入式、苯基、己基苯基、氰基、戊烷氟苯基鍵合）的pH值穩定范圍更寬（多官能的硅烷化學鍵或異丙基保護的硅烷），選擇性增強。最近的一個創新方法稱為表面帶電雜化（CSH）技術，該項技術于2010年引入，由于在酸性、低離子強度流動相（如0.1%甲酸）條件下，對高堿性分析物的峰形的改善，該項技術立即在藥物分析領域獲得了很好的接受度。

4.親水作用色譜（HILIC）

在反相HPLC條件下，若流動相中有機物含量比較低，就會導致相坍塌現象（鍵合相脫水），許多強極性化合物就無法獲得足夠的保留時間或者會存在問題。20世紀90年代由Alpert首次開發了HILIC模式，使用親水固定相（硅、二醇、氰基、氨基、兩性離子等），以水和乙腈作為流動相，在極性藥物分析、輔助藥物代謝、氨基酸、多肽、神經遞質、低聚糖、碳水化合物、核苷酸或核苷方面的分析中越來越受歡迎。HILIC的實際保留機制可以認為是分析物分子“分區”到附著在親水結合基團的水層。與RPLC相比，HILIC其他突出的優勢包括“正交”選擇性（樣品制備兼容兩種模式），對質譜具有更高的電噴霧離子化靈敏度（5～15倍），較低的操作壓力。

5.固定化多糖手性固定相

成功包覆的多糖手性固定相（CSPs）的改進模式在20世紀末實現。與早期的CSPs具有相似的多功能，但是對于腐蝕性的溶劑具有更好的穩定性，可用于正相、極性有機和反相模式。

6.用于生物分子的色譜柱

20世紀80年代發展起來的大孔徑硅和聚合物填料可有效完成大型生物分子的分離。隨著重組蛋白如單克隆抗體（mAb）等生物制藥技術的出現，質量控制中利用HPLC和毛細管電泳進行詳細表征的需求變得更加緊迫。最近，亞2μm微粒和核殼大孔徑顆粒以及一些創新的離子交換和尺寸排阻等材料也被證明可以有效地分離這些大分子的生物制劑。

（二）高壓輸送系統的發展

1.UHPLC概念的應用

高壓輸液系統的發展與色譜柱及固定相的小粒徑發展是密不可分的。亞2μm色譜柱的高柱效必然要求更高的壓力進行液體輸送，只有較高的系統壓力才能使更小微粒填充的柱子得到更快的分析速度或復雜樣品更出色的分離。超高效液相色譜（UHPLC）的革命性創新始于1997年James Jorgenson教授在概念驗證方面的研究，緊接著第一個商業化系統于2004年推出。現如今，從HPLC到UHPLC的轉化大部分都是由主要制造商完成，這些制造商目前都可以供應某種類型的UHPLC產品。UHPLC在藥物分析、食品安全等領域體現出了巨大的應用優勢。表1-4概述了UHPLC的突出特點和優勢。

與傳統的HPLC相比，UHPLC具有分析速度快的優勢，圖1-15展示了一種藥物分析由HPLC方法轉移為UHPLC方法的譜圖對比。從HPLC到UHPLC，根據幾何尺寸按比例縮放色譜柱及操作參數，可以在相同分辨率的情況下將分析時間減少10倍，這并不罕見。“保證好的分辨率的情況下進行更快的分析”是大多數用戶考慮購買更昂貴的UHPLC設備的主要原因。

UHPLC另一個重要的優勢是其對復雜樣品卓越的分離能力。峰容量是分辨率為1.0時色譜圖上可以分辨的色譜峰個數；通常傳統的HPLC為200個左右，而UHPLC可以在單一維度，對復雜的藥品、天然產物和其他樣品基質提供＞300的峰容量。

UHPLC的其他優勢還包括節省溶劑（5～15倍），增強質量靈敏度（3～10倍），以及在保留時間（2～3倍）和峰面積（＜0.1%RSD）方面的卓越性能。但是，UHPLC不會增加濃度靈敏度（最理想的一種靈敏度），因為質量敏感度（分析物注入量）主要與柱的空隙體積有關，無法通過使用小的流通池來增加信噪比，除非延長流通池的路徑長度（如60mm）。

2.輸送系統附件的改進

此外，為了實現高通量、高重現性的應用，輸液系統的其他部分也需要進行相應的改變，如使用改良的進樣器和恒溫器、內徑較小的管路系統[＜0.005英寸（1英寸=2.54cm）]、更小的紫外檢測器流動池（0.5～2μL），以保證UHPLC有比較低的系統擴散、更小的系統死體積（0.1～0.3mL）和更快的檢測器響應/數據采集速率（＞40pt/s）。2015年匹茲堡分析化學與應用光譜會議（Pittcon，2015）上，具有更高的操作耐壓、更低的樣品擴散、更新穎的色譜柱柱溫箱設計以及更加快速循環的自動進樣器的第二代UHPLC產品層出不窮，這也證實了這種發展趨勢。如賽默飛公司在會上展出的Vanquish UHPLC將普通的風扇強制循環對流傳熱模式改為直接傳導加熱模式，改善了色譜柱內部形成溫度梯度的問題。圖1-16是使用兩種不同加熱模式時色譜柱內部流體流型的模擬示意圖。從圖1-16可以看出，采用直接傳導加熱模式時色譜柱內沒有形成溫度梯度[見圖1-16（a）]，最大化地保證了色譜柱的柱效；而采用風扇強制循環對流傳熱模式時色譜柱內部形成了對柱效極為不利的溫度梯度[圖1-16（b）]。

安捷倫公司在Pittcon 2015上新推出的Agilent 1290 Infinity Ⅱ UHPLC則對進樣針模式進行改進，采用獨立流路的雙進樣針設計模式，使進樣循環間隔時間比單進樣針大大縮短，可以以秒計，同時其交叉污染＜9mg/L。圖1-17是新自動進樣器的使用效果示意圖。

3.超臨界流體輸送系統的發展

超臨界流體色譜（supercritical fluid chromatography，SFC）是以超臨界流體作為流動相的色譜方法，是20世紀80年代以來發展迅速的一個色譜分支。所謂超臨界流體，是指在高于臨界壓力和臨界溫度時的一種物質狀態。它既不是氣體，也不是液體，但它兼有氣體的低黏度、液體的高密度以及介于氣、液之間較高的擴散系數等特性。從理論上說，SFC既可以分析GC法難以處理的高沸點、不揮發性樣品，又有比HPLC法更高的柱效和更短的分離時間，且可使用二者常用的檢測器，也可與MS、FT-IR光譜儀等在線連接，因而可以方便地進行定性、定量分析。因此，超臨界流體的出現，使液相色譜的分析更為全面。

圖1-18為以CO2為流動相的超臨界流體儀器，其中CO2 泵溶劑輸送單元，僅用于CO2流體，用作萃取和分離分析的流動相，其內置一個制冷泵頭控制器，以實現在恒定溫度下輸送CO2流體。BPR為背壓調節器，用于為SFE和SFC系統流路保持一定壓力。當用液體二氧化碳作為流動相時，它還具有溫度控制功能，以防止因出口處二氧化碳氣化吸熱而凍結。先進的設計技術降低了該單元的內部體積，使得所有樣品均進入質譜檢測器，從而得到高靈敏度的分析。SFC單元通過超臨界流體萃取樣品中的目標化合物。樣品萃取需要專用的萃取器。通過切換流速，可分別實現靜態萃取與動態萃取。樣品盤中的不同萃取器可分別控溫，因此可避免樣品在待檢過程中發生高溫分解。該系統將兩個高壓閥內置于超臨界流體萃取單元內部，通過SFE單元萃取的化合物可直接在線加載至SFC單元，接著通過色譜柱進行分離，繼而經由質譜檢測器進行檢測。該在線系統兼容了SFE用于前處理以及SFC用于分析，可自動將固體樣品中的目標物直接萃取進行分析。在農殘檢測中，這將減少用于樣品前處理85%的時間。該系統也有助于抑制不穩定化合物的分解，這是由于自動化的萃取是在避光且非氧化環境下進行的。

此外，近年來，將HPLC與超臨界流體系統融合，以類似于GC的雙柱系統的模式用于目標物的比較分析。事實上，在SFC系統的基礎上，只需增加一個LC輸液泵，即可輕松實現LC與SFC的自由切換。利用該系統，可正常使用常規LC系統。同時，與以往不同的是，當樣品在LC上難以分離的時候，可以嘗試使用SFC模式，以期在不同分離模式下獲得不同的分離效果。圖1-19充分顯示了SFC在分離同分異構體時的優勢。

（三）檢測系統的發展

HPLC發展至今，檢測器的種類主要包括紫外-可見吸收檢測器、示差折光檢測器、熒光檢測器、電化學檢測器、化學發光檢測器和蒸發光散射檢測器等，但是，始終沒有一種完全通用的檢測器可以實現統一的檢測。近年來，質譜（MS）“檢測器”、電霧式檢測器（CAD）和自動方法開發系統（AMDS）的出現為HPLC檢測系統的發展提供了新的動力。

1.質譜（MS）檢測器

HPLC與質譜聯用（LC/MS），集合了HPLC的分離能力和質譜卓越的靈敏度和選擇性，已被視為完美的分析工具。質譜作為一種液相色譜的特殊“檢測器”，使液相色譜擁有更廣泛的應用領域。

當前，LC/MS是雜質和降解鑒定、藥物研究中的高通量篩選技術，也是生物分析試驗、環境污染物的在線監測和食品安全分析的首選技術，而且，LC/MS已經成為高效藥物清潔驗證以及潛在的基因毒性雜質測定的標準技術平臺。

過去十年中，高分辨質譜HRMS（如TOF、OrbiTrap MS）和雜化質譜（如Quadrupole-TOF或ion trap-OrbiTrap）得到了快速發展。HRMS和UHPLC以及二維LC的聯用使得代謝組學、蛋白質組學、De Novo蛋白測序和生物制藥表征等領域的研究愈發活躍，而質譜作為液相色譜檢測器的作用也發揮得淋漓盡致，使液相色譜從單純的分離技術發展成為了化合物定性、定量鑒別的重要技術。

2.電霧式檢測器（CAD）

缺乏理想的通用檢測器常常被視為HPLC的局限，盡管UV/Vis檢測器可以檢測具有發色基團的化合物。示差折光檢測器不適合梯度洗脫，敏感性不夠。蒸發光散射檢測器（ELSD）使用噴霧器技術與激光光散射檢測，是HPLC的一個選擇，也可以兼容梯度洗脫，但最近已經被CAD（使用噴霧器和電暈放電檢測技術）超越，CAD可以使靈敏度更好（低至ng級），線性更佳。CAD正逐漸成為藥物化學、反應過程監控以及原材料/輔料測試的主流檢測器。

（四）自動化HPLC方法體系（AMDS）的發展

1.分析方法自動化開發

復雜混合物的HPLC方法開發是一個很耗時的工作，因為需要優化很多操作參數[柱尺寸、鍵合固定相和流動相A和B（有機溶劑/緩沖類型、pH值和離子強度）的類型、梯度洗脫時間和梯度范圍、柱溫度、流量]。一個常見的例子就是藥物活性成分（API）穩定性指示分析或純度測定，其中所有的雜質和降解產物必須分離，通過UV檢測器進行準確的定量。多年以來，基于模擬、預測、單純形優化、柱/流動相篩選的軟件或自動化系統促進HPLC方法的開發。雖然它們似乎還沒有很普及，但持續的改進提高了HPLC的性能和易用性。最新進入市場的是一個附加軟件包，兼容兩個常用的色譜數據系統。對于HPLC方法開發過程（優化）中最耗時的部分，該軟件利用用戶定義空間的自動化序列方法來解決，其中使用了實驗設計（DoE）和質量源于設計（QbD）的原則。導入完整的序列結果之后，該軟件還可以執行統計分析，并顯示最佳條件。

島津公司為新一代液相UHPLC Nexera設計了特殊的方法開發系統，該系統可借助專用控制軟件（Nexera Method Scouting）和耐高壓的柱切換系統，自動切換流動相和色譜柱，實現HPLC方法的高效開發。通常情況下，分析工作者對流動相和色譜柱的優化需要耗費大量的時間才能找到最佳的組合條件，而這套開發系統可以自動獲取最多96種流動相色譜柱組合時的數據，可以最大限度地提升開發效率。圖1-20顯示了常規開發方法和自動開發方法的區別。

這種自動化的方法開發軟件可以實現流動相和色譜柱的管理組合，能事先計算出各種流動相、樣品的所需用量，并作為信息提供以預防流動相耗盡、樣品不足等現象，還可以根據標注在色譜柱數據庫中的色譜柱性能參數自動控制壓力上限，避免色譜柱劣化。隨著大數據、網絡化應用的發展，液相色譜方法優化的自動化過程既節省了分析工作者寶貴的時間和精力，又提高了方法建立的重現性和高效性，自然成為其發展的一個重要趨勢。

2.分析-制備方法的自動化轉換

制備色譜是指采用色譜技術制備純物質，即分離、收集一種或多種色譜純物質，也就是從混合物中得到純物質。因此，為了加快分離的時間并提高分離的效率，制備色譜的進樣量很大，導致制備色譜柱子的分離負荷相應加大，必須加大色譜柱填料，增大制備色譜的直徑和長度，使用相對多的流動相。通常的做法是從分析柱的規格開始逐漸放大規模，直至適合制備要求。但如從同一臺儀器上進行規模放大，可節約流動相和試樣的使用量，降低成本。如圖1-21所示，規模放大時的一對色譜柱（分析柱和制備柱）使用同一特性的填料，只要一對色譜柱的柱長相同、填料粒徑相同，則在兩種柱子的單位截面積的進樣量和線速度一致時，可得到同一色譜效果。采用這種方法可以快速獲得理想的結果（圖1-22）。

（五）多功能集成化的發展

在液相色譜的各個組件不斷發展的背景下，液相色譜的功能拓展和集成方面近年來也有了很大的發展，如島津、安捷倫和賽默飛世爾公司先后推出了不少拓展液相色譜功能的集成化設備，這些設備在單純的液相色譜基礎上通過六通閥、十通閥的引入，使液相色譜具備了在線預處理（提取、凈化、除鹽）、多維分析、改善檢測能力（柱后衍生、梯度補償）等功能，從而加快整個分析檢測過程，提供更加豐富的分離檢測信息。

2010年左右熱電公司發布的雙三元液相色譜儀（UltiMate 3000 DGLC）就是通過六通閥和十通閥將兩套三元梯度泵置于一個體系內，借助不同的連接需要實現各種功能。

圖1-23為雙三元液相色譜的并聯模式示意圖。通過這種方式可將一臺儀器當作兩臺儀器使用，同時完成兩個不同方法的分析測試任務，相當于兩臺獨立液相色譜的功能。并聯模式可運用兩個不同的分析方法，通過共享自動進樣器和柱溫箱，額外增加一個檢測器就可基于閥的靈活切換實現一臺儀器做兩臺儀器使用的技術。閥1～6位連接時，右泵-自動進樣器-柱溫箱-Detector1構成系統1，同時左泵-柱溫箱-Detector 2構成系統2，兩個系統同時進行分析。在系統1完成進樣后，通過添加方法命令，將自動進樣器釋放給系統2，達到共用自動進樣器和柱溫箱的目的，提高了儀器的工作效率和分析通量。

圖1-24為雙三元液相色譜的串聯模式示意圖。這種模式可實現在線分析樣品的同時離線清洗、平衡色譜柱，縮短了約20%～50%的分析時間，提高分析效率。首先選擇兩根相同的色譜柱，在柱溫箱上配置一個兩位置十通閥，采用雙三元泵的右泵作為進樣分析泵，左泵作為離線的清洗平衡泵。在A位時，色譜柱1進行梯度分析，同時色譜柱2進行離線清洗平衡；梯度分析結束后，閥切換至B位，色譜柱2與進樣器及檢測器相連接，進行梯度分析，同時色譜柱1進行離線清洗和平衡，整個過程在密閉系統中連續不間斷地進行，提高分析效率。

此外，雙三元液相色譜可在線去除流動相中的非揮發性緩沖鹽，這對于液相色譜與質譜聯用時十分有用。雙三元梯度泵的右泵保持原來的分析流動相條件不變，目標成分在一維分析柱中實現分離，通過兩位置六通閥將已被常規檢測器檢測的目標物儲存至loop環中；左泵采用與MS兼容的揮發性流動相，將儲存在loop環中的目標分析物洗脫至二維除鹽柱中，利用質譜上固有的六通閥，將流動相中的非揮發性鹽除去，再調整左泵流動相比例將目標待測物洗脫至MS。

（六）物質全分析能力的拓展

隨著科學研究不斷向精細化方向深入，復雜基質樣品的分析已成為色譜分析的熱點。常規色譜（又稱一維色譜）在復雜樣品分離方面很難滿足要求，由于色譜體系和操作條件一旦固定，在一定時間內，最多能從色譜柱洗脫并達到一定分離度的色譜峰個數（峰容量）是有限的。David和Giddings的研究證實，如果色譜峰的個數超過峰容量的37%，則色譜峰的分離度就會大幅下降。然而組學的快速發展推動全成分分析的需求愈加強烈，因此多維色譜分離技術應運而生。其中島津公司開發的全二維液相色譜是近年來最受關注的多維色譜之一。

從本質而言，全二維色譜即通過組合兩個獨立的分離系統，在對樣品進行一維液相分離的同時，再對其進行在線連續二維液相分離。其不同于傳統二維液相的中心切割模式，使用具有2個樣品環的流路切換閥將一維和二維液相整合，借助流路切換閥的交替運行，從樣品環將一維液相洗脫液連續不斷地注入二維液相進行分離。圖1-25為島津Nexera-e全二維液相色譜系統的流路和工作方式。

與一般的一維液相相比，全二維分離系統得到的數據整合了一維和二維的分離結果，可提供更大的峰容量，有效減少色譜峰重疊，進而提供更多更準確的信息，已獲得越來越多研究人員的關注和應用。圖1-26顯示了常規一維液相和全二維液相的差異，從圖中可以明顯看出二維分離的優越性。

總之，最近幾年中，HPLC仍然是一個高度有活力的領域，在儀器、色譜柱技術、應用等方面有很多創新。科學家們最初將這些新技術應用于研究、開發和質量控制，他們是這項技術的早期采納者，同時也是受益者。UHPLC在研究與開發領域被快速接受，并逐漸成為標準的UHPLC平臺。新的色譜柱技術可以更快和更有效地分析復雜樣品、手性分子和生物分子。UHPLC和二維液相與高分辨率質譜聯用技術的快速進展，已經徹底改變了生命科學的研究，并將會在臨床診斷、食品分析和環境等方面產生更大的影響。