第四節　核酸的分離、純化與鑒定

核酸結構與功能的分析，首先需要對核酸進行分離和純化。核酸制備過程中需要注意的是要防止核酸降解和變性，同時要盡量使其維持在生物體內的天然狀態。通常采用比較溫和的條件進行分離，防止過酸、過堿和劇烈攪拌。由于核酸酶無處不在，因此還要特別防止核酸酶對核酸的降解。分離后需要對核酸進行鑒定，包括分子量、紫外吸收、沉降系數、電泳遷移率、黏度等。下面簡單介紹實驗室常用的核酸制備方法。

一、DNA的分離

真核生物DNA主要存在于細胞核中。細胞中的DNA和RNA分別與蛋白質相結合，形成脫氧核糖核蛋白（DNP）及核糖核蛋白（RNP）。在細胞破碎后，這兩種核蛋白混雜在一起。因此，要制備DNA首先需要將這兩種核蛋白分開。已知這兩種核蛋白在不同濃度的鹽溶液中具有不同的溶解度，如在0.14mol/L NaCl（生理鹽溶液）的稀鹽溶液中RNP溶解度最大，DNP溶解度則最小；而在1mol/L NaCl的濃鹽溶液中，DNP溶解度增大，RNP溶解度則明顯降低。根據這種特性，調整鹽濃度即可把這兩種核蛋白分開。因此，在細胞破碎后，用稀鹽溶液反復清洗，所得沉淀即為DNP成分。

分離得到的DNP再溶解，用苯酚、十二烷基硫酸鈉（SDS）等蛋白質變性劑使蛋白質變性，再用含有異戊醇的氯仿沉淀去除變性蛋白質。最后根據核酸只溶于水而不溶于有機溶劑的特點，在有鹽的條件下加入2倍體積預冷的無水乙醇，即可把DNA沉淀出來。再用75%的乙醇洗沉淀數次，即可獲得純的DNA。

二、RNA的分離

真核生物RNA大部分存在于細胞質中，而DNA主要存在于細胞核中。因此可只破碎細胞質膜而不破壞核膜使細胞核保持完整，然后通過差速離心實現RNA和DNA的分離。此外，還可通過上述的核糖核蛋白（RNP）與脫氧核糖核蛋白（DNP）在不同鹽溶液中溶解度的不同來達到分離的目的。

RNA分子穩定性比DNA要差，同時RNase無處不在，因此分離RNA比DNA更為困難。為了避免環境中RNase對RNA的降解，在實驗中需要對所使用的器械、玻璃器皿進行高溫焙烤，塑料用具需用0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）處理再高壓滅菌，實驗中使用的所有試劑和溶液都需用0.1%DEPC配制。對于細胞內存在的RNase，在抽提液中需使用強變性劑使RNase失活，一般采用胍鹽（如異硫氰酸胍、鹽酸胍）作為變性劑。

通過變性劑破碎細胞或者組織，然后經過苯酚/氯仿等有機溶劑抽提RNA，再經過異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌，晾干，最后溶解即可得到RNA。

三、核酸的鑒定

（一）核酸純度和濃度的鑒定

從核酸的紫外吸收特性可知，核酸的最大吸收波長為260nm，蛋白質為280nm。通過測定在260nm和280nm的A值的比值（A260/A280），估計核酸的純度。純凈DNA的比值為1.8，RNA為2.0。若比值高于1.8說明DNA樣品中的RNA尚未除盡，若樣品中含有酚和蛋白質將導致比值降低。同時可通過測定其紫外吸收值來計算核酸樣品的濃度。在波長260nm時，1A值相當于雙鏈DNA濃度為50μg/ml，單鏈DNA（或RNA）濃度為40μg/ml，單鏈寡核苷酸的含量為30μg/ml。需要注意的是，紫外分光光度法只能用于測定濃度大于0.25μg/ml的核酸溶液，對濃度更小的樣品，可采用熒光分光光度法。

（二）核酸分子量大小的鑒定

核酸分子量大小的鑒定最簡單快速的方法通常采用凝膠電泳來完成。常見的核酸凝膠電泳有瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。前者一般分離分子量較大的分子（一般大于100bp）并通過水平電泳槽進行潛水式電泳。后者則用于分離分子量較小的分子（一般小于1000bp）并通過垂直槽進行電泳，它的分辨靈敏度很高，甚至只有單個堿基差異的核酸都可分離開來。凝膠電泳兼有分子篩和電泳雙重效果，不同長度的核酸由于受到凝膠介質的阻力不同，表現為不同的遷移率而被分開。遷移率與核酸分子大小、凝膠濃度、核酸的構象、電場強度等有關。電泳后核酸的相對位置可以通過溴乙錠染色進行測定，溴乙錠是一種扁平分子，很易插入核酸分子堿基之間，經紫外線照射可發射紅橙色熒光。根據熒光強度，還可以大致判斷DNA樣品的濃度。一般情況下可觀察到濃度低至納克級的DNA條帶。通過與一系列分子量大小已知的標準DNA（又稱為DNA marker）進行比照，即可初步估計待測DNA分子量的大小。

（三）核酸一級結構的鑒定

1. DNA雙脫氧鏈末端終止法

該法由英國科學家Sanger于1977年發明，又稱酶法。這種方法經過改進至今仍然是眾多實驗室中最為常用的DNA序列分析方法。其基本原理是：根據DNA在細胞內復制的原理，使待測DNA解鏈成為單鏈模板，加入DNA引物、4種底物dNTP、DNA聚合酶在體外進行子鏈的聚合，同時在反應體系中再加入2，3-雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）。這些ddNTP會隨機地代替dNTP參加反應。一旦ddNTP加入新合成的DNA子鏈，由于其3位的羥基脫掉了氧變成了氫，所以不能繼續延伸而使鏈延伸終止。如果不是ddNTP而是dNTP摻入子鏈中，則子鏈的延伸得以繼續。這樣，會合成一系列大小不等的DNA片段。再通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離這些片段，放射自顯影即可得到測序圖。

基本步驟如下：將待測DNA變性解鏈為單鏈DNA模板，然后與測序引物在適當的反應緩沖液中進行退火。樣品分成4等份，分別進行四個反應。每個反應體系均含DNA聚合酶和4種dNTP底物，其中一種dATP為32P標記物，以便能用放射自顯影法讀序（也可對測序引物進行標記，但其成本較高）。在每個反應中除上述成分外，分別加入一種ddNTP（即ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP）。在第一個反應中，ddATP會隨機地代替dATP參加反應。一旦ddATP加入新合成的DNA鏈，由于其3位的羥基脫掉了氧變成了氫，所以不能繼續延伸而使鏈延伸終止。第一個反應中所產生的DNA鏈都是到A就終止了。同理，第二個反應產生的都是以C結尾的，第三個反應的都以G結尾，第四個反應的都以T結尾。將4管反應物分別加在高分辨凝膠上電泳，DNA片段則因其長度不同被分離，短的走在前端，長的泳動在后面。每管所在的泳道則分別為以A、G、C或T結尾的不同長度DNA片段。

放射自顯影后即可得到測序圖譜，從下往上即可讀出合成的子鏈DNA序列，而待測DNA（模板鏈）序列則為它的互補序列（圖2-24）。

2. DNA化學降解測序法

DNA化學降解法由美國哈佛大學的A.Maxam和W.Gilbert于1977年發明。其基本原理是采用特異的化學試劑作用于DNA分子中不同堿基，然后用哌啶切斷反應堿基所參與形成的磷酸二酯鍵。用4組不同的特異反應，就可以使末端標記的DNA分子切割成不同長度的片段，其末端都是該特異的堿基。經變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影即可得到測序圖。基本步驟是：將單側末端標記待測DNA樣品分成4等份，分別進行下列4組特異反應。

（1）G反應　用硫酸二甲酯使鳥嘌呤上的N7原子甲基化，然后經哌啶處理。哌啶能取代甲基化的鳥嘌呤，導致修飾堿基從脫氧核糖上脫落，進一步導致3'，5'-磷酸二酯鍵斷裂。

（2）G+A反應　用甲酸處理DNA，可使A和G嘌呤環上的N原子質子化，導致糖苷鍵不穩定，再用哌啶處理后使磷酸二酯鍵斷裂。

（3）T+C反應　用肼處理DNA，可使C和T的嘧啶環斷開，再用哌啶處理后使磷酸二酯鍵斷裂。

（4）C反應　如果肼處理DNA是在高鹽濃度下進行，則只有C與肼反應，哌啶處理后使鍵斷裂。

上述樣品分別進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，放射自顯影得到測序圖譜，從下往上即可讀出待測DNA序列（圖2-25）。

3. RNA的測序

RNA的測序起源于20世紀60年代。最早由Sanger和Bronlee等建立了RNA序列測定技術。它們的方法是首先將待測RNA分子用同位素標記其一端，然后采用堿基特異的核酸內切酶對待測RNA分子進行特異性切割。如從胰臟提取的RNaseA能特異水解嘧啶核苷酸所形成的磷酸二酯鍵，所產生寡核苷酸的3'-端均為嘧啶核苷酸；從米曲霉中提取的RNase T1能特異水解鳥苷酸所形成的磷酸二酯鍵；黑粉菌中提取的RNase U2在一定條件下能特異水解腺苷酸所形成的鍵；從多頭黏菌中提取的RNasePhyM能特異水解A、U兩種核苷酸。變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離酶切片段，通過放射自顯影，從同位素標記端開始逐個確定小片段的順序，分析各泳道間小片段的相互重疊情況，最后排出整個分子的核苷酸順序。1965年，Holley用這種方法首次測定了酵母tRNAAla的全序列。

對于真核mRNA分子的測序，由于在其3'-末端都具有多聚A尾結構，因此可人工合成寡聚T引物與其退火，再在逆轉錄酶催化下逆轉錄成cDNA，再用DNA測序法來測序。

核酸化學知識框架