第三節　核酸的理化性質及其應用

一、核酸的一般性質

核酸及組成核酸的核苷酸既有堿性基團，又有磷酸基團，因此都是兩性電解質，因磷酸的酸性強，通常表現為酸性。

提純的DNA為白色纖維狀固體，RNA為白色粉末，兩者都微溶于水，不溶于一般有機溶劑。在70%乙醇中形成沉淀，故常用在核酸粗溶液中加入2倍體積乙醇使核酸沉淀的方法對其進行純化。

DNA分子是線型高分子，因此溶液黏度極高，RNA分子黏度則小得多。當核酸溶液因受熱或在其他因素作用下發生螺旋向線團過渡（變性）時，黏度降低，因此可用溶液黏度作為DNA變性的指標。

溶液中的核酸在引力場中可以下沉。在超速離心機形成的極大的引力場下，核酸分子下沉的速度大大加快。核酸的沉降速度與分子量和分子構象有關。應用超速離心技術，可以測定核酸的沉降系數和分子量。測定DNA分子量時，由于黏度很大，應用較稀的溶液。目前多用氯化銫密度梯度沉降平衡超速離心技術研究核酸分子的構象。

核酸分子在生理條件下，戊糖-磷酸骨架中的磷酸基團會發生解離呈離子化狀態，因此整個多核苷酸鏈是一個多聚陰離子。把這些核酸分子置于電場中時，它們會向正極移動。在一定的電場強度下，核酸分子的遷移率取決于核酸分子本身的大小和構型。凝膠電泳就是應用這一原理把不同分子大小的核酸分子進行分離和鑒定的技術，凝膠電泳是當前核酸研究中最常用的方法。

二、核酸的紫外吸收性質

核酸分子中的嘌呤堿與嘧啶堿具有共軛雙鍵，可強烈吸收260～290nm的紫外光，最大吸收峰波長大約在260nm（圖2-21），蛋白質的最大吸收峰波長大約在280nm，據此性質，可用紫外分光光度法對核酸進行定性和定量分析。

通過測定核酸260nm與280nm的吸光度（A）值，計算A260/A280的值即可判斷待測核酸樣品的純度。純DNA比值為1.8，純RNA比值為2.0。如樣品中含有蛋白質或其他雜質，則A260/A280的值明顯下降。對于純核酸，只要測出其A260/A280的值即可計算出含量。通常1A相當于50μg/ml的雙鏈DNA，或40μg/ml單鏈DNA（或RNA），或30μg/ml單鏈寡核苷酸。

三、核酸的變性、復性和分子雜交

（一）變性

核酸變性指在某些理化因素作用下，DNA雙螺旋區氫鍵斷裂，空間結構破壞，形成單鏈無規則線團狀態的過程。變性只涉及次級鍵的變化。而多核苷酸鏈上共價鍵（磷酸二酯鍵）的斷裂稱核酸降解。

凡可破壞氫鍵，妨礙堿基堆積力作用和增加磷酸基靜電斥力的理化因素均可以促成變性作用的發生。由溫度升高引起的變性稱熱變性；由酸堿度改變引起的變性稱酸堿變性。甲酰胺、尿素和甲醛也是核酸變性劑，對單鏈DNA進行電泳時，常用上述變性劑。

當將DNA的稀鹽溶液加熱到80～100℃時，雙螺旋結構發生解體，兩條鏈分開形成無規則線團（圖2-22），一系列理化性質也隨之發生改變；變性后的DNA由于堿基對失去重疊，在260nm處的紫外吸收值明顯升高（圖2-21），這種現象稱為增色效應。變性后的DNA黏度降低，浮力密度升高，生物學活性部分或全部喪失。

DNA加熱變性過程是在一個狹窄的溫度范圍內迅速發生的，通常將紫外光吸收值達到最大值一半時所對應的溫度稱為解鏈溫度（熔解溫度），又稱為熔點（Tm）（圖2-23）。在Tm時，DNA分子內50%的雙螺旋結構被破壞。DNA的Tm值一般在70～85℃，DNA的Tm值高低主要與DNA長短以及堿基組成有關。DNA分子越長，Tm值越高；G-C對含量越高，Tm值就越高；A-T對含量越高，Tm值就越低。此外，離子強度越高，Tm值也越高。

（二）復性

DNA的變性是可逆的，在適宜條件下，變性DNA分開的兩條單鏈可重新形成鏈間氫鍵，恢復成雙螺旋結構，這個過程稱為復性。DNA復性后，許多理化性質又得到恢復，如紫外吸收下降（稱為減色效應），生物學活性也得到恢復或部分恢復。若將熱變性的DNA驟然降溫至4℃以下時，DNA兩條單鏈則繼續保持分開，稱為淬火；若將此溶液緩慢冷卻（稱退火）到適當的低溫，則兩條互補鏈可重新配對而恢復到原來的雙螺旋結構。

（三）分子雜交

DNA的變性和復性都是以堿基互補配對為基礎的，如果將不同種類或來源的DNA單鏈或RNA放在同一溶液中，只要兩種單鏈分子之間存在著一定的堿基互補配對關系，它們就有可能形成雜化雙鏈。這種雜化雙鏈可以在不同的DNA單鏈之間形成，也可以在RNA單鏈之間形成，甚至還可以在DNA單鏈和RNA單鏈之間形成DNA-RNA雜合體。這種現象稱為核酸分子雜交（hybridization）。如果雜交的一條鏈是人工合成的特定（已知核苷酸順序）DNA或RNA序列，并經放射性同位素或其他方法標記，稱為探針。利用雜交方法，使“探針”與特定未知的序列發生“退火”形成雜合體，即可達到尋找和鑒定特定序列的目的。用“探針”來尋找某些DNA或RNA片段，已成為目前基因克隆、基因定位、鑒定分析中十分重要的手段。近年發展起來的基因芯片技術的基本原理就是核酸分子雜交。

核酸分子雜交可以在固相或液相中進行。實驗室應用最廣的是以硝酸纖維素膜和尼龍膜作為固相支持物的Southern印跡雜交和Northern印跡雜交。Southern印跡雜交是指將電泳分離的待測DNA片段轉移結合到固相支持物上，然后與存在于液相中標記的核酸探針進行雜交的過程。英國愛丁堡大學的E.M.Southern于1975年首創了這一方法。利用Southern印跡雜交可進行克隆基因的酶切圖譜分析、基因組基因的定性和定量及基因突變分析等。Northern印跡雜交是指將RNA變性及電泳分離后，將其轉移到固相支持物上，然后與存在于液相中標記的核酸探針進行雜交的過程。Northern印跡雜交主要用于確定特異mRNA的分子大小、是否有不同剪接體，以及檢測特異基因在某一組織或細胞中的mRNA表達水平等。