5.6　RP-HPLC法測定異紫堇堿的含量和相關物質

異紫堇堿音譯名異可利定，為阿樸啡類生物堿，具有較好的藥理學活性，如抗心律失常、舒張血管、抗缺氧作用等。2010年，國家食品藥品監督管理局批準異紫堇堿鹽酸鹽（鹽酸異可利定片）作為處方藥（批準文號國藥準宇H53021977）用于胃、腸、膽、胰、子宮、血管痙攣所致的疼痛，屬解痙鎮痛藥。最近的研究顯示異紫堇堿可以通過誘導PDCD4相關細胞凋亡，選擇性作用于耐藥的肝癌干細胞，也可以通過選擇性G2/M細胞周期抑制和誘導細胞凋亡而抑制肝癌細胞分化，由此可見異紫堇堿作為解痙鎮痛藥或抗癌藥物及其先導物，均具有一定的開發應用前景。

異紫堇堿在紫金龍和白線薯等植物中有比較豐富的分布，本研究在對西北特色植物紅茂草的化學成分研究中發現，異紫堇堿在該植物中的含量較高，為了開發利用西北區域豐富的植物資源，紅茂草可以作為異紫堇堿的植物資源加以利用。木文采用高效液相色譜法，測定異紫堇堿的含量和進行有關物質的檢查。該法簡便、快速，結果準確、可靠，可以更好地控制木品的質量，為異紫堇堿及紅茂草的有效利用提供科學依據。

5.6.1　材料與方法

（1）材料

①儀器

Agilent 1200型組合式全自動高效液相色譜儀，包括Agilent G1315B DAD檢測器、G1328B手動進樣器及配套的Agilent Chemstation for LC 3D化學工作站（version A.10.02）；電子分析大平為Sartoirus BT 2245型。

②試藥

異紫堇堿對照品為木實驗室分離純化，經NMR，HR-ESI-MS，X-Ray等光譜波譜技術鑒定為木品，純度為98.6%；異紫堇堿樣品為木實驗室采用大孔吸附樹脂技術自制產品（批號20121001、20121015、20121020、20121103、20121115、20121125），乙腈為色譜純；磷酸、三乙胺為分析純；實驗用水為一次蒸餾水。

（2）方法

①色譜條件

色譜柱SinoCrom ODS-BP C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相（體積比，以下略）乙腈-0.2%磷酸（50∶50，三乙胺調pH至6.02）；檢測波長270nm；流速1.0mL/min，柱溫30℃；進樣體積20μL。在上述條件下，異紫堇堿對照品溶液和供試品溶液高效液相色譜圖如圖5-30所示。

②溶液的配制

a.對照品儲備液　取異紫堇堿對照品約15mg精密稱定，置于5mL量瓶中，加流動相使其溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

b.對照品溶液　精密吸取對照品儲備液200μL置5mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

c.供試品儲備液　取批號20121115異紫堇堿樣品約15mg精密稱定，置于5mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

d.供試品溶液　精密吸取供試品儲備液200μL置5mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

5.6.2　結果與分析

（1）專屬性實驗

將供試品儲備液加流動相稀釋至約60μg/mL。分別以0.1mol/L鹽酸溶液、3mol/L氫氧化鈉溶液和30%過氧化氫溶液為強破壞條件，進行酸破壞、堿破壞和氧化破壞實驗。另取2份分別放進90℃的水浴（2h）和在254nm紫外燈照射（1h），進行熱破壞和紫外線破壞實驗。

將上述破壞后的供試品溶液照前述的色譜條件進行降解產物檢出實驗（圖5-31）。結果表明，經酸、熱和紫外條件破壞的供試品溶液的色譜圖均有不同程度的雜質峰產生，特別是在酸條件下和紫外破壞條件。但是在堿和氧化條件下，供試品溶液相對比較穩定。

（2）線性范圍

精密吸取對照品儲備液適量，分別用流動相稀釋得濃度為30μg/mL、60μg/mL、120μg/mL、180μg/mL、240μg/mL、300μg/mL的系列溶液，分別取20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以異紫堇堿峰面積Y為縱坐標，對照品溶液濃度X為橫坐標，進行線性回歸處理，得回歸方程：

Y=41.13X-330.3（R2=0.9999）

結果表明異紫堇堿濃度在30～300μg/mL范圍內線性關系良好。

取上述對照品溶液適量，加流動相逐級稀釋后依法測定，以10倍噪音（S/N=10）和3倍噪音（S/N=3）計算最低定量限和檢出限分別為0.03ng和0.0075ng。

（3）精密度實驗

取前述對照品儲備液加流動相稀釋至60μg/mL，精密吸取20μL，連續進樣5次，峰面積RSD（n=5）為1.6%，本方法精密度良好。

（4）穩定性實驗

取同一份供試品溶液，用流動相稀釋至約100μg/mL，在上述相同色譜條件下，分別于室溫放置0、2h、4h、6h、8h、10h、24h后進樣測定，計算得異紫堇堿峰面積的RSD為2.7%（n=7）。表明供試品溶液在室溫下24h內穩定。

（5）重復性實驗

取20121115批號樣品，按照前述方法分別制備5份供試品溶液，測定異紫堇堿含量為96.9%，RSD為0.02%（n=5），說明方法重復性良好。

（6）回收率實驗

取20121115批號樣品約15mg，精密稱定，稱取5份，分置s mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻。精密吸取此溶液200μg，置s mL量瓶中，再精密加入對照品溶液20μg，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取20μg，進樣測定，結果如表5-27所示。

（7）耐用性實驗

①流動相pH變化

將流動相pH分別調為5.75、6.02、6.25，取同一份供試品溶液，精密吸取（20μg/L），進樣測定，記錄峰面積，計算異紫堇堿峰面積的RSD（n=6）為2.8%。

②流動相比例變化

將流動相乙腈-三乙胺比例分別調為48∶52、50∶50、52∶48，取同一份供試品溶液，精密吸取20μg，進樣測定，記錄峰面積，計算異紫堇堿峰面積的RSD（n=6）為0.75%。

③柱溫變化

將柱溫分別調為25℃、30℃、35℃，取同一份供試品溶液，精密吸取（20μg），進樣測定，計算異紫堇堿峰面積的RSD（n=6）為1.5%。

④檢測波長變化

將檢測波長分別調為265nm、270nm、275nm，取同一份供試品溶液，精密吸取20μg，進樣測定，記錄峰山面積，計算異紫堇堿峰山面積的RSD（n=6）為2.6%。

（8）含量測定

精密吸取前述方法制備的供試品溶液及對照品溶液，用流動相稀釋至線性范圍后，精密吸取20μg，按上述色譜條件進行分析，按外標法以峰面積計算異紫堇堿的含量，6批樣品的含量結果如表5-28所示。

5.6.3　結論

根據上述含量測定和有關物質檢查方法，對樣品進行二極管陣列檢測，由DAD光譜圖可知，木品和專屬性實驗產生的降解物質在270nm處有最大吸收，故選擇270nm作為檢測波長。

以0.2%磷酸水溶液（用三乙胺調節pH）-乙腈（50∶50）為流動相，考察其pH對異紫堇堿色譜行為的影響。結果表明，pH對主峰與相鄰雜質峰間的分離度、保留時間、對稱性均有影響。流動相的pH越高，異紫堇堿在色譜中的保留時間越長。而pH為6.02時主峰與相鄰雜質峰間的分離度、保留時間、拖尾因子均較好，因此確定流動相的最佳pH為6.02。

上述流動相的其他條件不變，改變流動相中乙腈的濃度，考察異紫堇堿的色譜行為變化。實驗結果表明，乙腈濃度對異紫堇堿主峰與相鄰雜質峰間的分離度、保留時間均有顯著的影響。隨著乙腈濃度的增加，主峰與相鄰的雜質峰間的分離度減小，保留時間縮短，當乙腈濃度為50%時，保留時間在8min左右，能滿足含量測定的快速要求。乙腈濃度對主峰對稱性影響較小。因此，確定流動相中乙腈濃度為50%。

在實驗過程中發現，本品對紫外線和高溫敏感，故實驗操作應盡最避免強光照射及高溫環境。