5.3　鉬酸鈉檢測法測定紅茂草膠囊中生物堿的含量

5.3.1　材料與方法

（1）材料

①儀器與試劑

TGL-20型臺式高速冷凍離心機（長沙湘儀離心儀器有限公司）、UV-9200型紫外分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）、UV-2450型紫外-可見分光光度計（日本島津）、AUY-220分析天平（日本島津）。

鉬酸鈉、濃硫酸、異紫堇堿標準品（購自ABCR Gmbh & Co.KG im Schlehert公司，批號166401，規格10mg）、三重蒸餾水等。

1%鉬酸鈉-濃硫酸試劑　取10mL濃H2SO4在不斷攪拌下注入90mL水中，加入1g鉬酸鈉溶解后備用。

②樣品

紅茂草水提噴霧粉末（來自于本生物工程實驗室）、紅茂草膠囊（來自于由天水市某醫院藥劑科）。

（2）方法

要建立一種新的檢測紅茂草膠囊中生物堿含量的方法，首先對其所需的試劑，反應條件即時間，溫度，試劑用量要進行優化選擇。實驗以紅茂草生物堿和試劑反應后通過紫外吸收法測得的OD值的大小為考察指標，對其進行單因素和正交實驗研究。考察各因素的影響效果及適宜范圍，確定最佳反應條件。

①單因素實驗

指示劑量180μL、225μL、270μL、315μL、360μL、405μL、450μL；水浴溫度：50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃；水浴時間0min、5min、10min、15min、20min、25min、30min。

②正交實驗

在單因素的基礎上，建立L9（33）正交表，以水浴時間（A）、1%鉬酸鈉-濃硫酸量（B）、水浴溫度（C）為影響因素（如表5-6所示）進行正交實驗，優化最佳實驗參數。

③最大吸收光譜波長的選擇

準確稱取紅茂草生物堿標準品20mg溶于20mL的蒸餾水中，配制成1mg/mL的生物堿溶液，以3000r/min離心10min，取上清液備用。按表5-7所示，分別向每支試管中加入各種試劑后，振蕩混勻，在70℃條件下水浴20min，使反應完全。

以1號管為空白對照，將2號管在UV2450型紫外-可見光光度計上于190～500nm波長范圍內掃描，確定紅茂草生物堿標準品中總生物堿的最大吸收波長。以3號管在為空白對照，將4號管在UV2450型紫外-可見光光度計上于190～500nm波長范圍內掃描，確定紅茂草生物堿顯色反應生成的淺藍色物質的最大吸收波長。以1∶9稀硫酸為空白對照，將鉬酸鈉-濃硫酸試劑在UV2450型紫外-可見光光度計上于190～500nm波長范圍內掃描，確定鉬酸鈉-濃硫酸試劑的最大吸收波長。

④用紫外吸收法測定樣品膠囊生物堿量

a.標準曲線的繪制　準確稱取紅茂草生物堿標準品50mg溶于50mL的蒸餾水中中，配制成1mg/mL的標準生物堿溶液，以3000r/min離心10min，取上清液備用。按表5-8分別向每支試管中加入各種試劑后，振蕩混勻，在70℃條件下水浴20min，再選用光程為1cm的石英比色皿，用1號管調零點，在310nm波長處分別測定各管溶液的光密度值。以質量為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

b.紅茂草膠囊樣品含量測定　準確稱取樣品50mg溶于50mL的蒸餾水中中，配制成1mg/mL的樣品溶液，按上述方法處理樣品。在1～5號試管內，分別加入5mL生物堿液，測定樣品吸光度，對照標準曲線，得出樣品中生物堿質量（mg）。

5.3.2　結果與分析

（1）單因素實驗

①指示劑量對反應結果的影響

由圖5-9可知隨著指示劑用量的增加，OD值也隨著不斷增大，當達到360μL時，OD值最大，后來值開始下降，綜合考慮指示劑消耗和成本，所以指示劑量選擇360μL。

②水浴溫度對反應結果的影響

由圖5-10可知在一定范圍內，隨溫度的升高，OD值也不斷，當水浴溫度為70℃時，OD值最大，后來OD值緩慢下降，故水浴溫度選擇70℃。

③水浴時間對反應結果的影響

由圖5-11可知OD值隨著反應時間的增加而增大，但當超過20min后，OD值開始緩慢下降，從節省時間角度考慮，水浴時間選用20min比較合適。

（2）正交實驗

按正交實驗設計，測定不同條件下紅茂草生物堿反應后的顏色，透明度的變化情況，重復三次取平均值，從而確定紅茂草中生物堿的最佳檢測方案，其結果如表5-9、表5-10所示。

①表示顯著；②表示極顯著。

（3）最大吸收光譜波長的選擇

UV掃描光譜顯示，紅茂草生物堿標準品在196～210nm波長處具有最大吸收值（圖5-12）。

UV掃描光譜顯示，紅茂草生物堿顯色反應生成的淺藍色物質在310nm波長處具有最大吸收值（圖5-13）。

UV掃描光譜顯示，1%鉬酸鈉-濃硫酸試劑在218nm波長處具有最大吸收值（圖5-14）。

由上各圖可知，紅茂草生物堿標準品在196nm波長處有最大吸收值，1%鉬酸鈉-濃硫酸試劑在218nm波長處具有最大吸收值，紅茂草生物堿顯色反應生成的淺藍色物質在310nm波長處具有最大吸收值，三者之間的差異較大，故可以通過采用紫外吸收法建立紅茂草膠囊中生物堿量的測定方法。

（4）用紫外吸收法測定樣品膠囊生物堿量

①標準曲線的繪制

由圖5-15可知，Y=0.1281X+0.0165（R2=0.9992），接近于1，說明其吸光度與生物堿濃度呈良好的線性關系。

②紅茂草膠囊樣品含量測定

見表5-11、表5-12。

計算1～5號樣品中的生物堿含量：

1號質量分數=9.346mg/50mg=18.690%

2號質量分數=9.350mg/50mg=18.700%

3號質量分數=9.360mg/50mg=18.720%

4號質量分數=9.365mg/50mg=18.730%

5號質量分數=9.340mg/50mg=18.680%

③檢測實驗

通過配置1mg/mL異紫堇堿的標品溶液，按如上方法操作，測得OD值為0.1240，帶入Y=0.1281X+0.0165得X=0.493mg，其值略小于0.50mg，結果說明其方法可行。

5.3.3　結論

有些生物堿能和某些試劑反應生成特殊的顏色，叫做顯色反應，常用于鑒識某種生物堿，常用的顯色劑有礬酸銨-濃硫酸溶液（Mandelin試劑）、鉬酸銨-濃硫酸溶液（Frohde試劑）、甲醛-濃硫酸試劑（Marquis試劑）濃硫酸和濃硝酸等，鉬酸銨-濃硫酸溶液為1%鉬酸鈉或鉬酸銨的濃硫酸溶液，它遇烏頭堿顯黃棕色，小檗堿顯棕綠色，阿托品不顯色。本實驗采用紅茂草生物堿液與1%鉬酸鈉-濃硫酸的顯色反應來研究并確立紅茂草中生物堿含量的檢測方法。紅茂草生物堿1mg/mL與360μL 1%鉬酸鈉-濃硫酸試劑在70℃水浴20min，生成淺藍色物質，通過紫外-分光光度計檢測淺藍色物質最大吸收峰為310nm，并用1mg/mL異紫堇堿標準品對此方法進行驗證，得檢測值0.493mg略小于實際值0.50mg，以此建立有一種檢測紅茂草生物堿含量的新方法，用建立的檢測方法對甘肅省天水市某醫院生產的紅茂草膠囊中生物堿的含量檢測，結果表明生物堿平均含量在18.65%～18.75%之間。

雖然目前國內對紅茂草藥物進行了大量的研究，但對紅茂草生物堿的顯色反應及對應用于臨床藥品中生物堿含量測定的研究報道卻很少，此方法的建立對于紅茂草在醫藥領域的應用提供了一定的理論依據。顯色反應受生物堿純度的影響很大，生物堿愈純，顏色愈明顯。由于紅茂草中所含的生物堿種類比較多，生物堿液與1%鉬酸鈉-濃硫酸反應生成的藍色物質，還未精確到某一確定的生物堿，本實驗只是選取異紫堇堿作為一種測定指標，后續實驗還需做進一步研究。影響紅茂草生物堿與1%鉬酸鈉-濃硫酸反應的因素很多，本實驗僅對影響其反應的相關因子溫度、時間、1%鉬酸鈉-濃硫酸用量進行了研究，但諸如pH等其他因素對本實驗反應的影響還需今后做進一步明確。