5.2　酸性染料比色法測定紅茂草中總生物堿的含量

5.2.1　材料與方法

（1）材料

UV-751GD型紫外-可見光分光光度計（上海分析儀器廠）、RE52-99型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）、AB104-S型精密電子分析天平（瑞士梅特勤公司）、SH8-Ⅲ型循環水式多用真空泵、索氏提取器、pH計等。

紅茂草采自甘肅林區，由青海大學張英博士鑒定，經自然風干、粉碎過80目篩。異紫堇堿標準品（購自ABCR Gmbh & Co.KG im Schlehert公司，批號166401，規格10mg）、溴甲酚綠、枸櫞酸、磷酸氫二鈉、氯仿，其余試劑均為國產或進口分析純。

（2）方法

①不同濃度緩沖液的配制

準確稱取枸櫞酸5.0g加水溶解至250mL為A液，磷酸氫二鈉18.0g加水溶解至250mL為B液，分別取A、B液61.0mL和39.0mL，混勻，調pH=4.0。另取四組A液各61.0mL，四組B液各39.0mL，將A、B試液混合，得四組混合液，再分別向其中滴加枸櫞酸或磷酸氫二鈉，至四份混合液的pH分別為3.5、4.5、5.0、5.5，待用。

②溴甲酚綠溶液的配制

準確稱取溴甲酚綠0.1g加pH=4.0枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖液溶解至100mL，搖勻靜置。同法配制pH為3.5、4.5、5.0、5.5的溴甲酚綠緩沖液，待用。

③供試品溶液的制備

取紅茂草干燥粉末10.0g置于索氏提取器中，加入150mL 65%的乙醇回流1h，抽濾。同法提取兩次，合并濾液，轉入旋轉蒸發儀中，40℃減壓濃縮2h，然后于50mL容量瓶中定容，即得供試品溶液。

④測定波長的選擇

準確吸取0.5mL供試品溶液，加入pH=4.0的枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液至2.0mL。加入1.5mL溴甲酚綠溶液、10.0mL氯仿，振搖3min，靜置0.5h，用分液漏斗分取氯仿液待測；另取2.0mL枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，加入1.5mL溴甲酚綠溶液、10.0mL氯仿，振搖3min，靜置30min，用分液漏斗分取氯仿液作參比液。將得到的兩組氯仿液分別轉入到兩個玻璃比色皿中，用紫外-可見分光光度計在不同波長下測其吸光度。

⑤緩沖溶液pH的選擇

用移液管準確量取0.5mL稀釋后的供試品溶液，加pH=3.5的枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖液溶至2.0mL，再加10.0mL氯仿。振搖3min，靜置30min，用分液漏斗分取氯仿層待測。用移液管準確量取pH=3.5的枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖液溶2.0mL，準確加入1.5mL溴甲酚綠溶液和10.0mL氯仿，振搖3min，靜置30min，用分液漏斗分取氯仿層作參比。將得到的氯仿層溶液分別轉到比色皿中，并在415nm波長下利用紫外-可見分光光度計測吸光度。同法測pH=4.0、4.5、5.0、5.5時的吸光度。

⑥酸性染料用量的選擇

準確吸取1.0mL稀釋后的供試品溶液，加入1.0mL溴甲酚綠溶液，pH=4.0的枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液1.0mL、10.0mL氯仿，振搖3min，靜置30min，分取氯仿液待測。另取pH=4.0的枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖液溶2.0mL，加入1.0mL溴甲酚綠溶液、10.0mL氯仿，振搖3min，靜置30min，分取氯仿液作參比。將氯仿液轉至比色皿中，在415nm波長下測其吸光度。同法測酸性染料量為1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL時的吸光度。

⑦標準曲線的繪制

準確量取配置的異紫堇堿標準品溶液1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL，按1.2.4項測定方法進行測定，在415nm處測其吸光度，以標準品濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

⑧穩定性實驗

取異紫堇堿標準溶液2.0mL，按標準曲線測定方法，每隔1h測定其吸光度，觀察吸光度隨時間的變化情況。

⑨精密度實驗

取異紫堇堿標準溶液2.0mL，按標準曲線測定方法，制備標準品供試液和空白對照液，在415nm波長處測定，重復測定5次。

⑩樣品含量的測定

樣品供試液三份各0.5mL，按1.2.4項測定方法進行測定，在415nm處測其吸光度，根據標準曲線計算紅茂草中總生物堿的含量。

5.2.2　結果與分析

（1）波長的選擇

供試液波長的選擇結果，如圖5-7所示。

可知在415nm波長處，稀釋后的供試液有最大吸光度，因此選擇該處為測定的最適波長。

（2）比色條件的選擇

變化緩沖溶液pH值和酸性染料用量，得出最佳適用條件，其結果如表5-4所示。

可知在pH=4.0的酸性條件下，稀釋后的供試液有最大吸光度；當酸性染料溴甲酚綠溶液加入量為1.5mL時，吸光度最大。

（3）標準曲線的繪制

根據樣品含量測定的結果，得回歸方程：Y=0.0320X-0.0330，R2=0.9997，如圖5-8所示。

（4）穩定性實驗

穩定性實驗結果表明，待測液在5h內穩定，其RSD=0.045%（n=5）。

（5）精密度實驗

精密度實驗結果表明，重復測定5次。結果RSD=0.530%（n=5）。

（6）樣品含量的測定

根據標準曲線計算紅茂草中總生物堿的含量，其結果如表5-5所示。

表明異紫堇堿標準品在21.60～54.00mg/mL范圍內具有良好的線性關系，酸性染料比色法測定的紅茂草總生物堿含量為1.386%。

5.2.3　結論

酸性染料比色法是在一定的pH條件下，紅茂草中生物堿類（B）可與氫離子結合成鹽（BH+），酸性染料溴甲酚綠解離成陰離子（In-）。陰陽離子結合成有色離子對化合物（BH+·In-），可以定量的被有機溶劑（如氯仿）提取，在一定波長下測定該有色溶液的吸光度，可計算出生物堿的含量。本實驗以異紫堇堿為標準品，分別在波長為415nm、pH=4.0的枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液、1.5mL 0.1%溴甲酚綠染色劑作用下，測定出紅茂草生物堿的最大吸光度，并計算出其生物堿含量為1.386%。該法快速、準確、簡便，可以適用于紅茂草中總生物堿含量的測定。