4.7　紅茂草各組織器官中生物堿保質期的測定

4.7.1　材料與方法

（1）材料

①樣品

規范化種植的紅茂草，自2008年3月1日到6月1日，根據生長期采樣，共計10個批次。根、葉采收后洗凈，自然風干，60℃烘箱中烘干至恒重，粉碎過篩，干燥保存、備用。

②儀器與試劑

UV-2450紫外-可見分光光度計（北京瑞利儀器分析有限公司產品）、AB104-S精密電子分析天平（瑞士梅特勤公司產品）。

紅茂草生物堿對照品（異紫堇堿）本生物工程實驗室制備、保存，20mg/mL。其余試劑均為國產或進口分析純。

（2）方法

①樣品供試液的制備

稱取紅茂草各器官粉末各5.0g，加400mL 95%的乙醇溶液浸泡1～2d，再經超聲波處理1h，過濾，殘渣以50mL 95%的乙醇溶液分3次洗滌，合并提取液，用2倍體積的石油醚萃取色素，收集下層生物堿液，蒸餾濃縮至無醇味。加入無水乙醇，沉淀24h，過濾，回收乙醇，趁熱加0.5%活性炭脫色，冷卻、靜置、過夜。用1mol/L NaOH溶液調pH至中性，過濾，加熱濃縮至50mL，微孔濾膜（0.22μm）濾過，所得濾液即為實驗所需供試液。

②最大吸收光譜波長的選擇

將對照品和樣品供試液在190～500nm波長范圍進行光譜掃描，以確定紅茂草生物堿的最大吸收波長。

③標準曲線繪制

精密吸取紅茂草對照品供試液5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、30μL，置于干燥的試管中，加去離子水梯度稀釋至10mL，濃度分別為0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mL、0.06mg/mL。以去離子水作空白對照，在210nm波長處測OD值。以濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線。

④樣品含量的測定

稱取不同生長期不同器官的紅茂草樣品，制成測試品溶液，測其OD值，并計算生物堿含量，進行方差分析。

⑤精密度與穩定性實驗

精密度　按樣品含量測定項操作，連續測定吸收值6次，記錄OD值。

穩定性　按樣品含量測定項操作，每隔30d測定1次OD值，觀察不同保存期時間內OD值的變化。

4.7.2　結果與分析

（1）測定波長的分析

紫外-可見分光光度計掃描光譜顯示，對照品和樣品在210nm波長處均有最大吸收值，吸收光譜峰相同（圖4-11、圖4-12），故本含量測定實驗選定210nm作為測定波長。

從紫外-可見分光光度計掃描圖譜可以看出，根與葉片的吸收光譜相同，最大吸收波長210nm都位于2號波峰，對應生物堿含量最高；1、3號波峰的吸收波長也處于紫外范圍，其峰譜面積小，生物堿含量較少。由于對照品為全草生物堿，故吸收峰較根和葉片多。其中，標示的1、2、3號波峰基本一致。

（2）標準曲線的分析

經回歸分析得回歸方程：Y=53.99384X-0.02640，R=0.9866（n=6）。

實驗表明，紅茂草生物堿在0.01～0.06mg/mL范圍內與吸收度呈良好的線性關系。

（3）精密度與穩定性測定

統計分析6次吸收值（0.121、0.121、0.120、0.121、0.122、0.120），RSD=0.52%（n=6），表明儀器有較好的精密度，實驗結果如表4-26所示。

從以上4批樣品測定結果看出，OD值變化很小，樣品有效成分在所測2年時間內穩定性良好，可長期保存。

4.7.3　結論

生物堿及其生物堿鹽都能溶于甲醇或乙醇，但甲醇毒性很大，而乙醇在生物堿的提取與分離中是最常用的半極性溶劑。紅茂草中生物堿主要以游離生物堿和鹽類生物堿兩種形式存在，游離生物堿大都不溶或難溶于水，能溶或易溶于醇類、甘油等有機溶劑；而鹽類生物堿多溶于水，不溶或難溶于有機溶劑。本實驗采用95%乙醇和無水乙醇溶液作為提取溶劑，取得了較好的提取效果。超聲波產生的振動作用能夠使生物細胞壁及整個生物體破裂，加快了細胞內物質的釋放、擴散和溶解，同時提高破碎速度和提取率，被浸提的物質在細胞破碎的瞬間，生物活性物質保持不變。在95%乙醇浸泡紅茂草干草粉末時，適當使用超聲波進行振蕩處理，可以提高生物堿的產率。

本實驗利用乙醇同時提取生物堿和色素，石油醚進行萃取分離色素，進而純化了生物堿，避免利用丙酮分離色素。其優點在于：降低了成本，避免回收丙酮所引起的危險，更重要的是不僅提高了生物堿的純度，減少對人體的危害，而且簡化了提純工藝。

生物堿代謝受組織特異性調控，其常積累足夠高的濃度分布在植物最需保護、最易受環境侵害的部位比如嫩葉、芽尖及幼根的外表皮組織，并且遇到環境脅迫和生物侵害時瞬間大量合成。據文獻報道，生物堿主要在植物的根、葉片中合成，故本實驗采集這兩種器官做為實驗材料。紅茂草不同器官中以葉片生物堿含量最高，根次之，無顯著差異，表明生物堿可能主要由葉片合成，通過莖運輸到其他器官。這是因為葉片的光合作用或其轉化產物是生物堿的底物，葉片光合作用旺盛，產生的底物多，所以合成的生物堿也多，因而葉可能是生物堿的主要產生器官。幼根的生物堿含量也比較高，表明幼根等活性較強的部位也能合成和積累部分生物堿。本研究確定紅茂草組織器官中生物堿的保存期限，但仍需進一步的測定和驗證。