4.4　紅茂草種子萌發及組織培養最佳條件初探

4.4.1　材料與方法

（1）材料

①藥材

采自人工種植和野生的一年或兩年生紅茂草，分別采集根、莖、葉柄和花苞部位。

②儀器與試劑

ZHJH-2112B超凈工作臺（上海智城分析儀器制造有限公司）；生化培養箱；SZ-93自動雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）；DDS-307A電導率儀（上海精科）。

瓊脂（華美生物工程公司）；α-萘乙酸（NAA）（上海山浦化工有限公司）；6-芐基氨基嘌呤（6BA）（上海伯奧生物科技有限公司）；2，4-D（上?；瘜W試劑總廠）；其他試劑均為國產分析純試劑。

（2）方法

①紅茂草種子萌發實驗

選擇當年收獲的紅茂草飽滿種子100粒，將其浸泡48h。溶脹后，用無菌水沖洗4次，0.1%的赤霉素處理3min，再用無菌水沖洗5～6次，置于不同基質石英砂和蛭石中25℃進行種子萌發實驗，每組重復四次。同樣種子置于培養皿中25℃培養作為對照。

②紅茂草愈傷組織的誘導

a.外植體的初次培養　將適中大小的葉片（花苞、花柄、莖、根），用自來水沖洗1～2min后，無菌水沖洗4～6次，70%的酒精處理20～30s，無菌水沖洗4次，0.1%的升汞處理5min，無菌水處理6次，后接種在MS培養基中，每瓶接種5個，于每天光照12h的生化培養箱中（24+1）℃培養。

b.外植體和培養基的選擇　利用紅茂草不同的外植體進行愈傷組織的誘導，出現的數量和質量有很大差異。相同的外植體在不同的培養基上培養，出現的狀況亦不盡相同。本實驗選用三種培養基，分別為MS、B5、SH，其中pH值控制在5.7～5.9，蔗糖濃度為2.5%，瓊脂濃度為3.2‰～4‰。

c.激素的選擇　植物愈傷組織的形成與激素的種類和濃度有很大的關系，選擇適宜誘導紅茂草愈傷組織形成的激素和最佳濃度是實驗的關鍵。實驗選用組織培養常用的激素2，4-D和6-BA+NAA，2，4-D濃度設定為0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L；6-BA+NAA濃度設定為（0.5+0.2）mg/L、（1.0+0.2）mg/L、（0.2+0.5）mg/L、（0.2+1.0）mg/L。每個實驗組重復四次。

③紅茂草愈傷組織的培養

培養溫度為（25±2）℃，光照強度為50μmol/（m2·s），光照時間16h/d。在此條件下培養12d后，觀察并統計各培養基中不同外植體的誘導情況。

采用SPSS 17.0軟件對實驗數據進行方差分析，以最小顯著差數法（LSD）評價差異的顯著性。

4.4.2　結果及分析

（1）紅茂草種子萌發最佳基質

在不同的基質中，紅茂草種子萌發的態勢有很大差別，結果以百分率表示，見表4-7。對其進行方差分析，結果如表4-8所示。

由表4-9結果顯示，三種基質對紅茂草種子萌芽率的差異都達到極顯著差異，其中，石英砂作為基質時，紅茂草種子的萌發率最好，而蛭石作為基質時，萌發率最低。

（2）紅茂草愈傷組織誘導與培養

①不同外植體和培養基的選擇

對紅茂草不同外植體進行愈傷組織的誘導，在培養3～12d后，結果如表4-10及圖4-6～圖4-9所示。

由圖4-6～圖4-9可以看出，選用紅茂草的外植體誘導愈傷組織時，最好選擇兩年生的葉片或雌蕊來進行組織培養。

在幾種培養基中，愈傷組織在MS培養基上的誘導率最高，其次是B5培養基，SH培養基上的誘導率最差，但MS培養基在其生長過程中有明顯的褐化現象，而SH培養基未出現明顯的褐化。綜合愈傷組織誘導率及其生長狀況，選用MS培養基作為誘導紅茂草愈傷組織形成的培養基，B5培養基可作為繼代培養的培養基。

②不同激素與不同濃度的選擇

植物激素的種類，濃度與比例對誘導植物器官分化起著很重要的調節作用，利用兩組激素組合2，4-D和6-BA+NAA對紅茂草進行愈傷組織的誘導，結果見表4-11。對其進行方差分析，結果見表4-12。

方差分析結果顯示，F>0.01，P<0.01，表明不同濃度的不同激素之間有極顯著的差異，對此差異進行多重比較，如表4-13所示。

注：不同字母表示不同顯著性差異程度。

由多重比較可知，2，4-D 1.0與2，4-D 3.0mg/L和6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L之間的差異達到極顯著的程度，與2，4-D 0.5mg/L，2，4-D 2.0mg/L，6-BA 0.2mg/L+NAA 1.0mg/L之間達到顯著差異。實驗中，2，4-D 1.0mg/L實驗組形成愈傷組織所用時間較其他組短。故考慮綜合因素，在誘導紅茂草形成愈傷組織時，利用激素2，4-D濃度為1.0mg/L的效果最好。

4.4.3　結論

從罌粟科植物中提取生物堿等有效成分在醫學上已受到廣泛關注，而罌粟科植物中紅茂草的藥用價值也已經得到了很好的驗證。目前紅茂草作為藥材仍處于采集野生資源的狀態，極不利于大規模開發利用，而且對生態環境破壞較大。

本實驗結果表明，在室內人工控制條件下，紅茂草種子在石英砂基質中萌發效果好，雌蕊和兩年生的葉片是誘導愈傷組織形成的最佳外植體，選用紅茂草花苞和兩年生的葉片誘導形成愈傷組織，培養基MS+2，4-D（1.0mg/L）是最適合紅茂草愈傷組織的培養條件。在此條件下，誘導率最高，可達80%，且培養效果最好。紅茂草作為藥用種苗，通過植物組織或器官的離體培養和形態發生，可實現藥用種苗的大量快速繁殖。為保證紅茂草作為藥材的質量和產量，以植物激素誘導紅茂草產生愈傷組織，為大規模產業化生產實踐提供相關理論基礎。