任務二 植物組織培養常用的儀器設備

植物組織培養是在嚴格無菌的條件下進行的。要做到無菌的條件，需要一定的設備、器材和用具，同時還需要人工控制溫度、光照、濕度等培養條件。

一、實驗室基本儀器設備

(一)常規設備

1．空調機

接種室的溫度控制，培養室的控溫培養，均需要用空調機。培養室溫度一般要求常年保持25 ±2℃，空調機可以保證室內溫度均勻、恒定。空調機應安置在室內較高的位置，如窗的上框以上的地方等，以便于排熱散涼，使室溫均勻。若將空調機安裝在窗以下位置，室內的上層溫度則始終難以降下來。

2．除濕機

濕度也要求恒定，一般保持70%~80%，濕度過高易滋長雜菌，濕度過低培養器皿內的培養基會失水變干，從而影響外植體的正常生長。當濕度過高時，可采用小型室內除濕機除濕；當濕度過低時，可采用噴水來增濕。

3．烘箱

可以用80~100℃的溫度，迅速干燥洗凈后的玻璃器皿。也可以用160~180℃的溫度，進行1~3h的高溫干燥滅菌。還可用80℃的溫度烘干組織培養植物材料，以測定干物質。

4．冰箱

有普通冰箱、低溫冰箱等。用于在常溫下易變性或失效的試劑和母液的儲藏，細胞組織和試驗材料的冷凍保藏，以及某些材料的預處理。

5．天平

包括扭力天平、分析天平、電子天平(圖2-6)和藥物天平(圖2-7)等。大量元素、糖、瓊脂等的稱量可采用感量為0.1g的藥物天平，微量元素、維生素、激素等的稱量則應采用感量為0.0001g的分析天平。有條件的，最好配用感量為0.0001g的電子天平。

6．顯微鏡

包括雙目實體顯微鏡(解剖鏡)、生物顯微鏡、倒置顯微鏡和電子顯微鏡。顯微鏡上要求能安裝或帶有照相裝置，以對所需材料進行攝影記錄。

(1)雙目實體顯微鏡 雙目實體顯微鏡下可進行培養材料(如莖尖分生組織、胚等)的分離，解剖和觀察植物的器官、組織，也可以從培養器皿的外部觀察細胞和組織的生長情況。

(2)生物顯微鏡 生物顯微鏡可用于觀察花粉發育時期以及培養過程中細胞核的變化。

(3)倒置顯微鏡 倒置顯微鏡物鏡在鏡臺下面，可以從培養皿的底部觀察培養物。

(4)電子顯微鏡 簡稱電鏡或電顯，是使用電子束來展示物件的內部或表面的顯微鏡。

7．水浴鍋

水浴鍋可用于溶解難溶藥品和熔化瓊脂條。

8．蒸餾水發生器

制備培養基所用的重蒸餾水，是將蒸餾水再蒸餾一次，使水中不含或少含某些離子，以便完全人為控制培養基成分。因此，實驗室設置一套蒸餾水發生器是必要的。蒸餾器一般有兩種，一種是用蒸餾水重新蒸餾，另一種是用自來水連續蒸餾兩次，以獲得重蒸餾水。此外，還可用純水發生器將自來水制成純凈的實驗室用水，生產速率可達到4L/h、15L/h或40L/h(因型號而異)。這種水與“試劑級”水比較，其雜質的含量仍然太高，但卻得到了質量一致的較好的實驗室用水。

9．酸度計

用于校正培養基和酶制劑的pH值。半導體小型酸度測定儀，既可在配制培養基時使用，又可在培養過程中測定pH值的變化。

10．離心機

用于分離培養基中的細胞以及解離細胞壁后的原生質體。一般轉速為3000~4000r/min即可。

(二)滅菌設備

1．高壓滅菌鍋

高壓滅菌鍋(圖2-8)是一種密閉良好又可承受高壓的金屬鍋，其上有顯示滅菌鍋內壓力和溫度的表頭。高壓滅菌鍋上還有排氣孔和安全閥。高壓滅菌鍋是對培養基和操作工具、器皿器具、工作服裝等進行滅菌的設備。在密閉的高壓蒸汽滅菌鍋內，當壓力表指示蒸汽壓增加到0.105MPa時，溫度則相當于121℃，在這種溫度下20min即可完全殺死細菌的繁殖體及芽孢。

2．干熱消毒柜

用于干燥洗凈后的玻璃器皿，也可用于干熱滅菌和測定干物重。一般選用200℃左右的普通或遠紅外消毒柜。用于干燥需保持80~100℃；干熱滅菌時需160℃保持1~2h；若測定干物重，則溫度應控制在80℃烘干至完全干燥為止。

3．過濾滅菌器

一些生長調節物質(如IAA、GA3)、有機附加物(如香蕉汁、椰子汁)等在高溫條件下易被分解破壞而喪失活性，可用孔徑為0.22μm微孔濾膜來進行除菌。過濾滅菌時需要一套減壓過濾裝置或注射器過濾組件。

4．接種器械滅菌器

接種器械滅菌器為電加熱高溫干式消毒滅菌，由數顯控制面板、石英珠、發熱層(板)組成，將電能轉化為熱能加熱石英珠，把接種的刀、剪、鉗、針插入石英珠內15~20s，便可完成對接種工具的消毒滅菌(圖2-9)。

5．臭氧發生器

臭氧發生器主要用于空氣的消毒殺菌。臭氧在常溫常壓下能自行分解成氧氣和單個氧原子，而氧原子對微生物有極強的氧化作用，臭氧氧化分解了微生物內部氧化葡萄糖所必需的酶，從而破壞其細胞膜，將它殺死，多余的氧原子則會自行重新結合成為普通氧氣分子。臭氧消毒殺菌效果好，不存在任何有毒殘留物，對多種細菌、病毒、芽孢均有很強的殺滅力。

6．紫外線燈

紫外線燈產生的紫外線具有殺菌作用。紫外線燈主要用于對接種室、緩沖室、培養室等處空氣和環境的消毒。

(三)無菌操作設備

1．超凈工作臺

超凈工作臺(圖2-10)原系工業上用于半導體元件與精密儀器的裝配，如今已成為組織培養上的一種最通用的無菌操作裝置。它占地小，效果好，操作方便。超凈工作臺的空氣通過細菌過濾裝置，以固定不變的速率從工作臺面上流出，在操作人員與操作臺之間形成風幕，凈化進入臺面的空氣，保證了臺面的無菌狀況。

2．無菌箱

條件不足時可用最簡單的無菌箱來代替超凈工作臺，前面裝玻璃，操作中便于觀察，左右兩側有兩個孔，孔內側有布質袖罩，無菌箱上方安裝紫外線燈和日光燈，箱內放置工作所需的物品。無菌箱比較簡易，容易辦到，但操作不方便，比較費工夫。

(四)培養設備

1．搖床(振蕩培養機)

在液體培養中，為了改善浸于液體培養基中的培養材料的通氣狀況，可用搖床來振動培養容器。振動速率每分鐘60~120次為低速，每分鐘120~250次為高速，植物組織培養可用每分鐘100次左右。搖床沖程應在3cm左右。沖程過大或轉速過高，會將細胞震破。

2．轉床(旋轉培養機)

轉床同樣用于液體培養。由于旋轉培養使植物材料交替地處于培養液和空氣中，所以氧氣的供應和植物材料對營養的利用更好。通常植物組織培養用1r/min的慢速轉床，懸浮培養需用80~100r/min的快速轉床。

3．恒溫箱

恒溫箱又稱培養箱，可用于植物原生質體和酶制劑的保溫，也用于組織培養材料的保存和暗培養。恒溫箱內裝上日光燈，可進行溫度和光照實驗。

4．光照培養箱和人工氣候箱

光照培養箱和人工氣候箱可自動控制溫度、濕度和光照，主要用于試管苗培養和移栽。

5．培養架

培養架是進行固體培養時，擺放培養材料的設備。它有多層，每層均有照明設備。在培養架的頂部多安裝反光膜或反光鏡，以增強光照，每層架的隔板可采用玻璃板、金屬網或木板。

二、實驗室常用器皿、器械

(一)常用器皿

1．培養器皿

配制培養基和進行培養都需大量的器皿。器皿按材料可分為玻璃器皿和塑料器皿兩種。玻璃器皿需用堿性溶解度小的優質硬質玻璃制成，以保證長期儲藏藥品與培養的效果；塑料培養器皿需用耐高溫高壓的材料制成。玻璃培養器皿的優點是透光度好、容易清洗，缺點是容易破碎；塑料培養器皿的優點是不容易破碎、成本較低，但缺點是透光度較玻璃培養器皿差、遇火焰易熔化。目前制成的塑料器皿可以進行高溫高壓滅菌，并對培養物無害。故現在在很多實驗室內，玻璃培養器皿和制備培養基所需的其他玻璃器皿都已被塑料器皿所取代。特別是那些用于原生質體、細胞、組織和器官培養的塑料器皿，在出廠時即是無菌的。這種塑料器皿在國外已得到普遍應用，在國內也已生產并被使用。

按其形狀可分為試管、三角瓶、圓形培養瓶和培養皿等。也有進行轉動培養并使液體流動時用的L形管和T形管；還有在瓶外用顯微鏡觀察細胞的分裂和生長情況，并便于攝影記錄的長方形扁瓶、圓形扁瓶、平型有角試管和無角試管等。這些不同類型的培養器皿都可用來培養植物材料，但具體采用哪一種，有時取決于實驗性質，有時取決于器皿使用是否方便，有時還取決于研究工作者的愛好與資金實力等。在一般的組織和細胞培養工作中，玻璃試管和三角瓶是廣泛應用的器皿。當然，在條件不許可的情況下，各種大小的廣口玻璃瓶，有時甚至牛奶瓶和罐頭瓶也都可以利用，特別在快速繁殖時更是如此。不過在組織培養中只應用硼硅酸鹽玻璃器皿，鈉玻璃對某些組織可能是有毒的，重復使用時毒害會更明顯。

(1)試管 特別適合用少量培養基及試驗各種不同配方時選用，在莖尖培養及花藥和單子葉植物分化長苗培養時更顯方便，有圓底的和平底的兩種。

(2)三角瓶 是植物組織培養中最常用的培養器皿，適合于各種培養，固體或液體、大規模或小規模都行。常用的是50mL、100mL、150mL和300mL的三角瓶。其優點是：采光好、瓶口較小不易失水和不易被污染。

(3)L形管和T形管 為專用的旋轉式液體培養試管。

(4)培養皿 適用于單細胞的固體平板培養、胚和花藥培養以及無菌發芽。常用的有直徑為40mm、60mm、90mm和120mm的培養皿(圖2-11)。

(5)果醬瓶 常用于試管苗的大量繁殖，一般用200~500mL的規格(圖2-12)。

2．實驗器皿

主要是量筒(25mL、50mL、100mL、500mL和1000mL)、量杯、燒杯(100mL、250mL、500mL和1000mL)(圖2-13)、吸管、滴管、容量瓶(100mL、250mL、500mL和1000mL)、稱量瓶、試劑瓶、玻璃缸、玻璃瓶、塑料瓶、酒精燈、儲藏母液的棕色玻璃瓶(圖2-14)等。

(二)分注器

分注器可以把配制好的培養基按一定量注入培養器皿中。一般由4~6cm的大型滴管、漏斗、橡皮管及鐵夾組成。還有量筒式的分注器，上有刻度，便于控制。微量分注還可采用注射器。

(三)離心管

離心管用于離心，將培養的細胞或制備的原生質體從培養基中分離出來，并進行收集。

(四)刻度移液管

在配制培養基時，生長調節物質和微量元素等溶液，用量很少，只有用相應刻度的移液管才能準確量取。同時，不同種類的生長調節物質不能混淆，這就要求專管專用。常用的刻度移液管容量有0.1mL、0.2mL、0.5mL、2mL、5mL、10mL等(圖2-15)。

(五)常用的器械(圖2-16)

(1)鑷子 尖頭鑷子，適用于取植物組織和分離莖尖、葉片表皮等。長20~25cm的槍形鑷子，可用于接種和轉移植物材料。

(2)剪刀 常用的有解剖剪和彎頭剪，一般在轉移植株時用。

(3)解剖刀 常用的解剖刀，有長柄和短柄兩種。刀片也有雙面及單面之分，可以經常更換。對大型材料如塊莖、塊根等就需用大型解剖刀。

(4)接種工具 包括接種針、接種鉤及接種鏟，用來接種花藥或轉移植物組織。

(5)鉆孔器 取肉質莖、塊莖、肉質根內部的組織時使用。鉆孔器一般做成T形，口徑有各種規格。

(6)其他 燃燒工具用的酒精燈、用于熔解培養基的帶有磁攪拌器的電爐、用于加速熔解瓊脂培養基的微波烘箱、用于貯備去離子水和重蒸餾水的大型塑料桶、試管架以及轉移培養瓶、試管架的搪瓷盤或塑料框等。

實驗2-1 植物組織培養實驗室設計及常用設備儀器的使用

一、實驗目的

1．能夠根據要求進行植物組織培養實驗室的設計，并繪制出實驗室草圖。

2．認識組織培養必需的儀器、器皿，掌握幾種主要設備的使用方法。

二、器材與試劑

1．植物組織培養實驗室，測量尺、記錄本等。

2．組織培養常用的儀器設備和器具，如電子天平(精密度1/100、1/10000)，高壓滅菌鍋，電冰箱，超凈工作臺，光照培養箱，精密pH(5.4~7.0)試紙，酒精燈，玻璃器皿(試劑瓶、燒杯、量筒、容量瓶、移液管、培養瓶等)，接種器械(鑷子、解剖刀、剪刀等)，滅菌器等。

三、方法及步驟

1．教師講解實驗室的規章制度及有關注意事項，實驗室各組成部分的功能與設計要求。

2．學生分組，在老師的帶領下參觀實驗室，講解各個分區的功能。同時，教師介紹組織培養實驗室常用設備及其使用方法。

3．教師與學生共同討論實驗室的規劃設計問題。

4．學生根據要求自己動手設計實驗室，繪制組織培養實驗室草圖。

四、注意事項

實驗前指導教師和實驗員必須做好充分的準備，明確組織培養實驗室的規章制度及其特殊性，強調參觀的紀律要求。

五、實驗報告

1．繪制一幅植物組織培養實驗室的設計圖。

2．寫出植物組織培養實驗室各個組成部分的功能及儀器設備。

實驗2-2 器皿及用具的洗滌與環境消毒

一、實驗目的

1．通過實驗使學生樹立無菌觀念，養成良好的無菌操作習慣。

2．掌握實驗室常用器皿及用具的洗滌方法。

3．掌握實驗室環境的消毒方法。

二、器材與試劑

(1)材料與試劑 去污粉、肥皂、洗衣粉、重鉻酸鉀、工業濃硫酸、2%鹽酸溶液、蒸餾水。

(2)儀器與用具 試管、三角瓶、培養皿、培養瓶、試劑瓶等容器；量筒、燒杯、移液管等量具；鑷子、剪刀、解剖刀、接種針等器械。

三、方法及步驟

1．器皿及用具的清洗

(1)洗滌液配制 常用的洗滌液有70%酒精、0.1%~4%高錳酸鉀溶液、1%稀鹽酸溶液、4%重鉻酸鉀-硫酸溶液(鉻酸洗液)、10%~20%洗衣粉溶液及洗滌劑溶液等。

4%重鉻酸鉀-硫酸溶液(鉻酸洗液)的配制方法：稱取25g重鉻酸鉀，加水500mL，加溫溶化，冷卻后再緩緩加入90mL工業濃硫酸即配成較稀的洗液。鉻酸洗液可加熱使用，增強去污作用，一般可加熱到45~50℃。鉻酸洗液可以重復使用，直到溶液變成青褐色為止。

(2)器皿及用具清洗 新購置的玻璃器皿因有游離堿性物質，可采用酸洗法洗滌。先用1%稀鹽酸溶液浸泡4h以上，然后用自來水沖洗；再加洗衣粉溶液及洗滌劑溶液刷洗，用自來水沖洗；最后用蒸餾水沖洗后，瀝干備用。

日常使用過的容器應先除去瓶內殘渣，用自來水沖洗，再用10%~20%洗衣粉溶液及洗滌劑溶液浸泡、刷洗，洗衣粉及洗滌劑溶液加熱后去污力更強，然后用自來水沖洗，最后用蒸餾水沖洗后，瀝干備用。

吸管、滴管等較難刷洗的玻璃器皿及用具可先放入鉻酸洗液中浸泡數小時，取出后用自來水沖洗30min，再用蒸餾水沖洗，稍瀝水后置于干燥箱內烘干備用。吸管、滴管等首次使用前也必須用洗滌液泡洗。

金屬用具一般不宜用各種洗滌液洗滌，可用酒精擦洗，并保持干燥，新購置的金屬器械若表面有潤滑油或防銹油，可用棉球蘸取四氯化碳(CCl4)擦去油脂，再用濕布擦凈，干燥備用。塑料用品一般用合成洗滌劑洗滌，因其附著力較強，必須反復沖洗多次，最后用蒸餾水沖洗，瀝干備用。

2．接種室、培養室環境消毒

(1)藥劑熏蒸 接種室、培養室應定期采用甲醛和高錳酸鉀熏蒸消毒，一般每年2~3次。每1m3空間用5~8mL甲醛、5g高錳酸鉀。先將稱好的高錳酸鉀倒入一個較大的容器內(玻璃罐頭瓶或陶瓷罐)，放入房屋中間的地面上，再將量取的40%甲醛溶液緩慢倒入，當煙霧產生后操作人員應迅速離開，并密封門窗。2~3d后再開啟門窗，排出甲醛廢氣。另外，也可選用冰醋酸加熱熏蒸消毒。

(2)藥液噴霧 經常用0.25%新潔爾滅溶液(取5%新潔爾滅原液50mL，加水950mL配成)或漂白粉液(取漂白粉10g，加水140mL配成，現配現用，配好后靜置1~2h，取上清液)或70%酒精噴霧，對接種室、培養室空間及墻壁、超凈工作臺消毒。噴霧要均勻，不留死角，并注意安全。

(3)紫外線照射 每次接種前打開緩沖室、接種室和超凈工作臺內的紫外線燈，照射20~30min。

(4)藥液擦拭 用棉布或毛巾蘸取70%酒精或0.1%高錳酸鉀溶液擦拭培養架等，做好衛生清理工作。

四、注意事項

實驗前指導教師和實驗員必須做好充分的準備，教師應特別強調在操作過程中注意安全。教師講解示范后，學生分組操作。學生應輪流負責實驗室器皿洗滌、環境清潔、消毒劑空氣污染狀況檢測。

五、實驗報告

寫出器皿及用具的洗滌步驟。

知識小結

※植物組織培養實驗室設計

1．基本要求：遠離污染源、交通便利、合理規劃面積和組成，按照操作流程來設計。

2．實驗室構成：準備室、緩沖室、無菌操作室、培養室、移栽馴化室等。

3．實驗室類別：普通實驗室、家庭組培室、組培工廠。

※植物組織培養實驗室主要設備

1．滅菌設備：高壓滅菌鍋、干熱消毒柜、過濾無菌器、接種器械滅菌器、臭氧發生器、紫外線燈。

2．無菌操作設備：超凈工作臺、無菌箱。

3．培養設備：搖床、轉床、恒溫箱、光照培養箱、人工氣候箱、培養架。

4．其他設備：解剖鏡、顯微鏡、培養器皿、稱量儀器、分裝設備、離心機、酸度計等。

復習測試題

一、名詞解釋(每題4分，共32分)

1．無菌操作室

2．高壓滅菌鍋

3．過濾滅菌器

4．超凈工作臺

5．搖床

6．培養架

7．分注器

8．接種工具

二、填空題(每空1分，共22分)

1．植物組織培養是一項技術性較強的工作。為確保培養成功，植物組織培養的全過程要求嚴格的____ 和____，在專門的植物組織培養 ____內進行。

2．一個標準的植物組織培養實驗室能夠滿足整個組織培養工藝流程，通常需要具備以下四個單元：____ 、緩沖室、____ 和____。

3．植物組織培養實驗室的大小、繁簡可以根據組培目的而定，但必須能夠完成____、____ 和____ 三個基本環節。

4．常見的培養器皿有試管、____ 、____ 和 ____。

5．植物組織培養的無菌操作需要 ____、____ 、____、____等金屬用具。

6．清洗玻璃器皿用的洗滌劑主要有肥皂、____、____和 ____。

7．新購置的玻璃器皿的清洗步驟是，先用____ 浸泡，然后用 ____洗凈，清水沖洗，最后 ____沖淋1遍，干后備用。

三、是非題(每題1分，共5分)

( )1．無菌操作室適當位置應吊裝1~2盞紫外線燈，用以經常地照射滅菌。

( )2．瓶口封塞可用多種方法，但要求絕對密閉，以防止培養基干燥和雜菌污染。

( )3．分注器的作用是把配制好的培養基按一定量注入培養器皿中。

( )4．干燥箱用于干燥需保持80~100℃；進行干熱滅菌需保持120℃，達1~3h。

( )5．培養室濕度要求恒定，一般保持相對濕度70%~80%。

四、選擇題(每題1分，共5分)

1. ____用于配制培養基時添加各種母液及吸取定量植物生長調節物質溶液。

A．移液管

B．分注器

C．過濾滅菌器

D．酸度計

2.____ 用于切取很小的外植體(如莖尖分生組織、胚胎等)和解剖、觀察植物的器官、組織等。

A．倒置顯微鏡

B．電子顯微鏡

C．雙目實體顯微鏡

D．普通生物顯微鏡

3．離心機用于分離培養基中的細胞以及解離細胞壁內的原生質體，一般選擇低速離心機，每分鐘____ 轉左右即可。

A．1000

B．2000

C．3000

D．4000

4．植物組織培養的振動速率可用每分鐘____ 次左右，搖床沖程在____ 左右。

A．100,3cm

B．100,2cm

C．200,3cm

D．200,3cm

5．培養室溫度一般要求常年保持____ ℃左右。

A．20

B．22

C．25

D．28

五、問答題(每題6分，共36分)

1．一個植物組織培養實驗室的設計需要考慮哪些因素？

2．植物組織培養實驗室的各分室分別起哪些作用？

3．無菌操作室為什么一般配有緩沖室？緩沖室有何功能？

4．已被真菌等雜菌污染的玻璃器皿應該如何清洗？

5．實驗室環境消毒有哪些方法？

6．請根據所在教室實際情況，將其設計改造成一個植物組織培養實驗室。