3.4 融合用細胞的制備

3.4.1 免疫動物

取8～12周齡與骨髓瘤細胞同種系的Balb/c小鼠，以含蛋白質200μg/500μL的抗原與等量福氏完全佐劑充分乳化，注入小鼠腹腔內，間隔2～4周用福氏不完全佐劑乳化抗原，多采用皮下多點注射。第二次免疫后約一周，尾靜脈采血，檢測抗體效價（一般用ELISA法），對符合要求的小鼠，再以20μg/100μL的抗原溶液進行脾內直接注射，加強免疫，3天后取脾臟用于細胞融合。

顆粒性抗原都具有較好的免疫原性，如系完整的細胞抗原，不必使用佐劑，用PBS等溶液充分洗滌培養的細胞，以去除可能存在的異源蛋白，如牛血清白蛋白等。先以2×107細胞進行腹腔免疫，3周后用同樣劑量的抗原再加強免疫，3天后取脾臟制備脾細胞懸液用于融合。

K?hler等曾經使用小鼠骨髓瘤細胞系X63/Ag8進行了與小鼠、大鼠、家兔、人和蛙等不同種動物脾細胞或者淋巴細胞的融合試驗比較，結果表明，用于融合的脾細胞或者淋巴細胞，在種系發生上與小鼠骨髓瘤細胞的距離越大，則獲得功能性雜交體的困難越大。為獲得功能性雜交體，選擇與骨髓瘤細胞屬于同一品系的免疫動物。常用動物是Balb/c小鼠，因為用于融合的骨髓瘤細胞系來源于Balb/c小鼠，而且應用Balb/c小鼠的免疫脾細胞與骨髓瘤細胞融合而得到的雜交瘤細62胞，與Balb/c小鼠的組織相容性相一致，因此，接種入Balb/c小鼠腹腔不會被排斥，便于獲得含有抗體的腹水。

腹腔內注射是最常用的免疫途徑，較其他途徑能注射更多的免疫原，而且抗原不會直接進入血液循環系統。皮下局部注射可以將抗原注射到淋巴結引流區，一般皮下注射的總量不超過100μL，皮下多點注射有利于增加免疫效果。融合前進行抗原沖擊時，脾內免疫有良好的免疫效果，但有較高的技術要求。最好一次免疫3只小鼠，取混合脾細胞融合；或者各取一個脾臟分別進行三個獨立的融合試驗，以避免單用一個脾臟時可能出現的不足之處。

3.4.2 骨髓瘤細胞的復蘇和培養

要取得良好的細胞融合效果，所用的骨髓瘤細胞必須處于良好的生理狀態。

1．骨髓瘤細胞的復蘇

將冷凍的骨髓瘤細胞從液氮罐內取出，立即放入37℃水浴中，融化后逐滴加入完全培養液約3mL,1000r/min離心5min，重復1次。將沉淀細胞移入細胞培養瓶中，加DMEM完全培養液，置CO2培養箱內培養。復蘇的細胞活力有所下降，死亡細胞較多，應注意適時更換培養基和細心觀察。如活細胞數較少，可加入飼養細胞，將有助于細胞的生長。

2．骨髓瘤細胞的培養

骨髓瘤細胞（Sp2/0或NS-1）培養在含10%～15%小牛血清的完全培養液中，如細胞數低于104個/mL時，細胞生長緩慢，一般在104～5×105個/mL時呈對數生長，此時細胞渾圓，透亮，大小均一，排列整齊，呈半致密分布。當細胞密度超過106個/mL以上時，細胞便停止分裂，表現皺縮、發暗，細胞漿中出現顆粒。當細胞處于對數生長的中期時，可按1∶3～1∶10的比例稀釋傳代。一般每3～4天進行一次傳代或擴大培養，然后選處于旺盛生長、形態良好的對數生長期細胞供融合使用。

1972年Potter第一次從腹腔注射礦物油的Balb/c小鼠中分離出骨髓瘤細胞株MOPC（mineral oil plasmacytoma），而且由這一細胞株衍生出來其他骨髓瘤細胞株。HGPRT缺陷細胞亞株在Milstein實驗室建立，簡稱為X63。K?hler等人又進一步誘發產生了一株丟失免疫球蛋白重鏈的變異細胞亞株，簡稱為NS-1，隨后又進一步誘發出完全不分泌免疫球蛋白的P3-653和Sp2/0等（表3.1）。由于有些骨髓瘤細胞分泌免疫球蛋白（Ig），與脾細胞融合后形成的雜交瘤，除了分泌脾細胞分泌的特異性抗體外，還同時分泌骨髓瘤細胞本身分泌的Ig，因此獲得的抗體不純。

一株好的小鼠骨髓瘤細胞株應當具備如下幾個特點：①穩定，易培養；②自身不分泌免疫球蛋白；③融合率高；④是HGPRT缺陷株，便于用HAT培養基篩選雜交瘤細胞。目前在我國最常用于融合的骨髓瘤細胞多選用NS-1或者Sp2/0，這兩個細胞系的優點是，骨髓瘤細胞本身不分泌抗體，所以融合后的雜交瘤細胞只分泌B細胞親本分泌的抗體。表3.1列舉了常用于融合的小鼠骨髓瘤細胞系的特征。

3.4.3 飼養細胞的培養

在組織培養中，單個或少數分散的細胞不易生長繁殖，若加入其他活細胞，便能促進這些細胞的生長繁殖，這種加入的細胞稱為飼養細胞。其增強細胞繁殖的作用可能是由于這類細胞在培養液中釋放一種非種屬特異性生長因子之故。許多種細胞都具有此種作用，如成纖維細胞、胸腺細胞、外周血淋巴細胞、脾細胞等，最常使用的是小鼠腹腔細胞，因其來源和制備較為方便，同時其中的巨噬細胞還有清除死亡細胞及少量污染細菌的作用。

在細胞融合、雜交瘤細胞的篩選和擴大培養以及克隆化過程中，由于早期階段，雜交瘤細胞數量較少，均需添加飼養細胞，其數量應大于104個/孔才有效。一般每只小鼠可取得（3～5）×106個腹腔細胞。可將細胞濃度調至2×105個/mL，在24孔培養板的小孔中加入0.5mL（約105個細胞）；如用96孔培養板，每孔可加0.1mL（2×104個細胞）。

3.4.4 血清的選擇

在細胞融合、雜交瘤細胞的篩選和擴大培養以及克隆化過程中，都必須在DMEM或者RPMI 1640培養基中加入10%～15%的胎牛血清。使用未經支原體污染的優質血清，是決定雜交瘤工作成功的關鍵。在融合工作開始之前，對每一批血清都要檢查支原體確實陰性，而且還應達到沒有飼養細胞時能使骨髓瘤細胞良64好生長的標準。

細胞培養液DMEM-0，含10%～15%胎牛血清的HAT培養基。

HAT培養基的配制。①氨基喋呤（A）儲存液（×100,4×10-6mol/L）：稱取1.76mg氨基喋呤（Mr=440.4），加90mL三蒸水，0.5mL 1mol/L氫氧化鈉，待氨基喋呤充分溶解后，加0.5mL 1mol/L鹽酸使中和，再加三蒸水至100mL，過濾除菌，按每管1mL分裝，放置-20℃保存。②次黃嘌呤和胸腺嘧啶脫氧核苷（HT）儲存液（×100, H:10-2mol/L; T:1.6×10-3mol/L）：稱取136.1mg次黃嘌呤（Mr=136.1）,38.8mg胸腺嘧啶脫氧核苷，加100mL三蒸水，放入40～45℃水浴中，完全溶解后過濾除菌，按每管1mL分裝，放置-20℃保存。③在含血清的DMEM培養液100mL中加入HT（×100）和A儲存液（×100）各1mL，混勻即成HAT培養液；若僅加HT（×100）儲存液1mL，則為HT培養液。