3.3 雜交瘤細胞的篩選原理

細胞的DNA合成有主要生物合成途徑和補救途徑。主要生物合成途徑就是利用谷氨酰胺（Gln）或單磷酸尿苷酸在二氫葉酸還原酶的催化下合成DNA；補救途徑則利用次黃嘌呤（hypoxanthine）或胸腺嘧啶脫氧核苷（thymidine）在次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase, HGPRT）或胸腺嘧啶脫氧核苷激酶（thymidine kinase, TK）的催化作用下補救合成DNA。

HAT（次黃嘌呤、氨基喋呤aminopterin和胸腺嘧啶脫氧核苷）培養(yǎng)基中的氨基喋呤是二氫葉酸還原酶的抑制劑，因此能有效地阻斷DNA合成的主要合成途徑。一般細胞DNA的主要生物合成途徑可以被氨基喋呤所阻斷，但細胞仍然可以經(jīng)補救途徑（或稱應急途徑）進行合成。如果給細胞提供胸腺嘧啶脫氧核苷和次黃嘌呤，在TK和HGPRT酶的存在下，DNA的合成仍然可以發(fā)生，但如果缺少其中一種酶，DNA合成就不能發(fā)生（圖3.3）。用于細胞融合的骨髓瘤細胞系是經(jīng)過毒性藥物（8-氮鳥嘌呤或5-溴脫氧尿嘧啶等）誘導而選擇產(chǎn)生的代謝缺陷型細胞，所以細胞內(nèi)缺少TK或HGPRT酶。當氨基喋呤存在時，能夠阻斷核酸（DNA）合成的主要途徑，因此要通過補償途徑合成DNA，這時就需要HGPRT酶利用次黃嘌呤合成DNA或TK酶利用胸腺嘧啶脫氧核苷合成DNA。在這種情況下，因骨髓瘤細胞及其自身融合物缺乏HGPRT酶或者TK酶，在HAT培養(yǎng)液中迅速死亡；免疫脾細胞及其融合物雖有HGPRT酶和TK酶，但因為缺乏于組織培養(yǎng)條件下繁殖的能力，是一種短命的細胞，在培養(yǎng)液中不能生長繁殖，一般在5～7天內(nèi)死亡；只有骨髓瘤細胞與免疫脾細胞融合的雜交瘤細胞獲得了骨髓瘤細胞所具有的永生化且繁殖力極強的特征，同時又從免疫脾細胞得到功能性HGPRT酶和TK酶的基因產(chǎn)物，因此，這種雜交瘤細胞在HAT選擇培養(yǎng)液中生長繁殖。各類細胞經(jīng)HAT選擇培養(yǎng)液培養(yǎng)，結果只有雜交瘤細胞才能得以生長繁殖。

圖3.3 用HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細胞的原理

在PEG存在下進行細胞融合后，即將細胞懸浮于HAT培養(yǎng)液中，分別滴入96孔培養(yǎng)板的小孔中（每孔0.1mL），置5%～7%CO2,37℃，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，約培養(yǎng)2周，融合的細胞繁殖形成集落（克隆），接著，用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）或放射免疫試驗（RIA）等敏捷方法檢測培養(yǎng)液中有無分泌的特異性抗體，將產(chǎn)生特異性抗體孔的雜交瘤細胞移到24孔培養(yǎng)板中擴大增殖，進行克隆化，再擴大增殖，這樣便可建立能分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。通過體外培養(yǎng)或將雜交瘤細胞接種于同系小鼠或裸鼠腹腔內(nèi)繁殖，即可獲得大量的單克隆抗體。

以下介紹單克隆抗體制備程序。