3.5 細胞融合

3.5.1 制備飼養細胞層

1）取Balb/c小鼠3～4只，頸椎脫位法處死后，浸泡在75%乙醇或1∶1000新潔爾滅溶液中消毒15min。

2）將小鼠固定于蠟盤上，腹部朝上，用無菌剪刀在其腹部皮膚剪一小口，注意勿剪破腹肌，再剝離腹部皮膚，暴露腹肌，用滅菌注射器將DMEM培養液5mL注入小鼠腹腔內，右手固定注射器，使針頭留置在腹腔內，左手輕輕按摩其腹部約1～2min。

3）用原注射器抽取腹腔內液體（每只小鼠約可得4～4.5mL腹腔液），取出后置于預冷的50mL離心管中。

4）以1000r/min離心10min，棄上清液，將細胞懸于20mL HAT培養液中，混勻后將細胞懸液滴加于96孔培養板的小孔中，每孔0.1mL，放置5%～7% CO2,37℃，飽和濕度的培養箱中培養備用。

3.5.2 制備骨髓瘤細胞懸液

1）在融合前7～10天將凍存在液氮中的骨髓瘤細胞（Sp2/0）復蘇，培養1～2代。

2）選擇生長旺盛、形態良好的細胞進行擴大培養。在融合前48 h，將細胞接種于100mL培養瓶中，約4～6瓶，每瓶加DMEM完全培養液15mL，含細胞數為5×104～105個/mL。放置5%～7%CO2,37℃，飽和濕度的培養箱中培養備用。

3）在細胞融合當天收集處于對數生長期的細胞于50mL塑料離心管中，1000r/min離心10min，用無血清培養液洗兩次，最后將細胞懸浮于40mL DMEM培養液中。

4）取細胞懸液0.1mL，加0.5%臺盼藍染液進行細胞計數和細胞活力檢測。取細胞懸液一滴加于血細胞計數板的計數室中，置低倍顯微鏡下觀察、計數，透亮不著色的活細胞應占90%以上。計數后，吸取2×107個細胞的懸液注入滅菌的50mL塑料離心管中備用。

3.5.3 制備免疫脾細胞懸液

1）取同批經免疫的Balb/c小鼠2只，經眼眶或腋下血管取血，分離血清供檢測抗體用。將小鼠處死后，局部消毒剖腹，無菌取出脾臟。

2）將脾臟放于無菌培養皿內的不銹鋼網上，立即加入5mL預冷的無血清DMEM培養液，用滅菌的注射器柄輕壓脾臟，使脾細胞經過網孔濾入培養皿中。吸取網下的細胞懸液，再加入10mL無血清培養液洗滌，輕壓脾臟，吸取網下的細胞懸液，移入無菌的50mL塑料離心管內，加無血清培養液至30mL。

3）將細胞懸液離心沉淀后用培養液洗滌一次，懸于10mL培養液中。

4）同前法進行細胞計數和活力檢測。取108個脾細胞懸液備用。

3.5.4 細胞融合

1）取40mL HAT培養液，15mL DMEM無血清培養液和1mL 50% PEG（Mr=2000）分別置于37℃水浴中預溫。另備盛37℃水的500mL燒杯一只。PEG使兩種細胞的膜融合，PEG的相對分子質量越大，濃度越高，融合率越高，但其粘度和細胞毒性也隨之增大。我們實驗室一般用相對分子質量1000～2000，濃度為50%的PEG。

2）分別取兩種細胞懸液[骨髓瘤細胞（2～5）×107，脾細胞1×108]加入50mL塑料離心管中，混勻，并加DMEM無血清培養液至40mL。

3）將兩種細胞懸液充分混勻后，1000r/min離心10min，倒盡上清液，用手指彈擊管底，使兩種細胞混勻成糊狀。

4）將離心管置于37℃預溫的盛水燒杯中，用吸管吸取0.7mL預溫的50% PEG溶液，然后，將吸管尖端插入管底，輕輕攪動細胞沉淀，同時緩緩滴加50% PEG溶液。1min內加完，放入燒杯溫水中，靜置90 s。

由于融合時所用的PEG是一種高滲溶液，以至于細胞在驟然接觸時極易產生滲透性休克。因此，無論在滴加PEG進行融合時或是最初加入培養基稀釋時，都必須十分緩慢。

5）立即滴加37℃ 15mL預溫的DMEM無血清培養液，使PEG稀釋而停止作用。滴加方法是前30 s加1mL；后30 s加3mL；然后在1min內加完15mL培養液。

6）補加DMEM無血清培養液至40mL,1000r/min離心10min，棄上清。

7）在離心收集的細胞中加40mL含10%～15%胎牛血清的HAT培養液，用吸管輕輕混勻，滴加到已含有飼養細胞的4塊96孔細胞培養板的小孔中，每孔0.1mL，放置5%～7%CO2,37℃，飽和濕度的培養箱中培養。