3.2 雜交瘤技術制備單克隆抗體的基本原理

1）淋巴細胞產生抗體的克隆選擇學說，即一個致敏的B細胞克隆只產生一種抗體。動物體內的B細胞在特定外來抗原的刺激下，每個致敏的B細胞可以大量增殖分化成漿細胞，以分泌只針對于該抗原單一決定簇的抗體。這種抗體具有特異性，動物免疫作用就是用特定的外來抗原對動物進行一次或多次免疫，以刺激識別該抗原的B細胞大量增殖，從而得到大量產生專一反應的B細胞。

2）細胞融合技術產生的雜交瘤細胞可以保持雙方親代細胞的特性。

3）利用代謝缺陷補救機理篩選出雜交瘤細胞，并進行克隆化，然后進行大量培養增殖，制備所需的McAb。

單克隆抗體是建立在經過細胞融合而獲得的雜交瘤細胞基礎之上的。利用B細胞雜交瘤技術，分離出產生某種預定性質單克隆抗體的雜交瘤細胞，這種選擇性制備單克隆抗體的技術又稱抗體工程。其中包括兩種親本細胞（骨髓瘤細胞和預先免疫過的小鼠脾細胞）的選擇和制備、細胞融合、雜交瘤細胞的篩選和克隆化、單克隆抗體的制備和特性鑒定以及純化等。這是一項長周期、連續性高的實驗技術，涉及大量細胞培養、免疫和生物化學等方法（圖3.1）。

用于免疫小鼠的抗原如混有無關組分，作某種程度的提純則更為有利。在基礎免疫3周后，進行第二次免疫（加強免疫），第3天取出小鼠脾臟，通過金屬網制備游離的單個脾細胞懸液。然后，將脾細胞與骨髓瘤細胞在聚乙二醇（polyethyleneglycol, PEG）存在下進行融合。當兩個細胞緊密接觸的時候，其細胞膜可能融合在一起，而融合的細胞含有兩個不同的細胞核，稱為異核體（heterokaryon），在適當的條件下，它們可以融合在一起，產生具有原來兩個細胞基因信息的單個核細胞，稱為雜交細胞（hybrid cell）。現在已知能誘導細胞融合的因子有病毒、化學試劑和電脈沖。1962年Okada發現屬于副粘液病毒的仙臺病毒可以誘發小鼠體內艾氏腹水瘤細胞彼此融合；1965年Harris用仙臺病毒介導人的Hela細胞與小鼠艾氏腹水瘤細胞融合成功后，最早被廣泛采用的融合劑是仙臺病毒。但是，以仙臺病毒作為融合劑，存在著制備困難、使用劑量難以控制、僅利于產生IgM的細胞融合以及融合效率低等缺點。1975年Pontecorvo報道，PEG能有效地促進哺乳動物細胞融合，而且融合效率較仙臺病毒高100～300倍。PEG具有來源方便、重復性好以及融合率較高等顯著優點，而逐漸取代仙臺病毒，成為淋巴細胞雜交瘤技術中應用最廣泛的融合劑。PEG促進細胞融合的確切機制尚不是很清楚，可能的機制是PEG可使細胞聚集在一起，PEG可能與鄰近細胞膜的水分相結合，使細胞之間只有幾個埃的空間的水分被取代，由此降低細胞表面的極性，導致脂質雙層不穩定，引起細胞膜的融合（圖3.2）。

圖3.1 單克隆抗體的制備程序

因為PEG誘導的細胞融合是非特異性的，所以在制備單克隆抗體的細胞融合階段，除了所希望的脾細胞與骨髓瘤細胞可發生融合外，骨髓瘤細胞之間或脾細胞之間也會發生融合。此外，還會剩下許多未融合的骨髓瘤細胞和脾細胞。因此，骨髓瘤細胞和脾細胞通過用PEG處理后，為五種細胞的混合體，須將脾細胞和骨髓瘤細胞的融合細胞——雜交瘤細胞篩選出來。

圖3.2 PEG介導的細胞融合的可能機制