1.6　藥用植物親緣學與藥用基因組親緣學

直系同源基因是在物種形成過程中由共同祖先基因演變來的分布于不同物種的基因，在藥物發現過程中有助于動物模型的選擇和分析流程的建立。葛蘭素公司的Searls首次使用pharmacophylogenomics一詞，認為充分利用基因組數據挖掘直系同源基因，能更好地預測藥靶基因功能。比較實驗動物和人的基因組，不僅可找到保守功能元件，包括蛋白編碼基因和非編碼序列，而且能發現基因功能的遷移，從而使研究者充分認識物種間遺傳差異，避免選用不適當的動物模型和藥物篩選方案（郝等，2014）。

Searls提出的pharmacophylogenomics是針對藥靶的研究，而筆者提出藥用基因組親緣學，是在基因組及其相關的轉錄組和代謝組水平系統研究藥用植物的植物親緣關系-化學成分-療效（傳統療效及藥理活性）間的相關性的新興邊緣學科。藥用基因組親緣學在藥用植物領域可以有多方面的應用：① 基于基因組信息構建不同尺度的生命之樹，明確藥用植物類群間的系統發育和親緣關系；② 利用基因組數據估算分化時間并重建地理分布區，推測現存藥用植物/道地藥材的起源和空間分布格局及其形成機制；③ 基于時間樹，結合生態、環境因素及代謝創新性狀，探討藥用植物的多樣化進程和成因；④ 揭示藥用植物多樣性的來源和格局，基于生物多樣性探討藥用化合物（如次級代謝產物）多樣性，促進生合途徑解析和創新藥物發現；⑤ 預測藥用植物多樣性動態變化，提出相應的保護性開發策略，促進人工栽培和分子育種。可見針對藥用植物的基因組親緣研究的內容完全不同于Searls原初的概念，只是暫借用pharmacophylogenomics作為藥用基因組親緣學英譯。

筆者擬整合形態分類數據、代謝組和化學分類數據、基因組和轉錄組數據、藥理活性數據和傳統藥物學知識，探索以毛茛科藥用植物科屬為重點的藥用植物親緣學。毛茛科藥用植物在中藥學中的應用源遠流長，我國42屬約720種毛茛科植物中，有30屬約220種可供作藥用（《中國植物志》27卷24頁）。黃連、附子、烏頭、升麻、川木通等的原植物均屬毛茛科。民間廣泛使用的麻布七、水黃連、鐵破鑼、虎掌草、月下參、驢蹄草、星果草、白頭翁等草藥也屬于毛茛科。據筆者統計，在《中國藥典》2010年版正文收錄10個法定種，附錄收錄另10種，另外在可見的地方標準中至少收錄了另外的20種，共計40種，高于菊科、豆科等大科的收錄數量，居所有植物科中的第一位。毛茛科大部分族屬在我國均有悠久的藥用歷史，其防治疾病的科學價值經歷了時間的考驗。但目前對毛茛科的組學研究，尤其是基因組和轉錄組研究十分稀缺，對毛茛亞科多物種屬的近緣種間親緣關系了解較為粗淺，對唐松草亞科的一些多物種屬，如唐松草屬（朱和肖，1991a；郝等，2015b）、人字果屬（肖和王，1964；朱和肖，1991b），了解更少。這一現狀也為進行藥用基因組親緣學的實證研究提供了很多課題。

人字果屬約16種，分布于亞洲東部和喜馬拉雅山區。我國9種，分布于秦嶺以南的亞熱帶地區，均由肖培根和王文采在20世紀60年代正式命名（1979《中國植物志》27卷472頁）。據不完全調查，本屬至少7種在分布地區的民間用作草藥，具有確切的功效（陳等，2001）。例如，耳狀人字果全草止咳化痰、消炎，蕨葉人字果根狀莖消腫解毒，縱肋人字果全草健脾化濕、清熱明目，人字果根狀莖清熱解毒、消腫。但是此屬在毛茛科中是研究較少的，其藥用價值值得深入挖掘。基于4個分子標記和形態特征得到的系統樹提示，人字果屬與扁果草屬和擬扁果草屬聚為一支，而與耬斗菜屬、天葵屬和擬耬斗菜屬進化距離較遠（Hao等，2015b）。從預實驗結果看，人字果屬的化學成分獨具特色（參見第4章）。擬選擇耳狀人字果、蕨葉人字果、縱肋人字果和人字果4種，進行酶切位點相關DNA測序（RAD-Seq）。只有分別帶有接頭1和接頭2的酶切位點周邊的DNA片段會得到有意義的擴增，即為RAD標簽（圖1-9）（岳等，2012）。將所有RAD標簽序列連起來即代表物種的簡化基因組，可用于同屬物種或同種各居群的基因組親緣關系推斷（圖1-10）。在進化史近期發生快速輻射分化的同屬物種，往往由于有限幾個分子標記的系統發育信號不足和/或基因樹沖突，使得其親緣關系難以辨清。人字果屬和鐵線蓮屬以及毛茛目其他多屬均有此問題。以RAD-Seq為代表的簡化基因組測序能提供關于物種基因組進化和雜交的全局觀點，且無需事先知曉物種基因組的完整序列。基于此探索的科學問題：四種人字果的基因組親緣關系是什么？粉背葉人字果（進行轉錄組測序）與這4種人字果的親緣關系？化學分類與分子分類是否一致？如何從起源和進化角度解釋？本屬與唐松草亞科其他屬的藥用親緣關系？

在藥用植物親緣學框架下進行中藥資源研究的一個代表性例證是關于烏頭屬的親緣學研究（肖等，2006；Hao等，2013a）。毛茛科烏頭屬全世界約有300余種，其中超過半數分布在中國。發現牛扁亞屬是以牛扁堿和C18-二萜生物堿為主的類群，由于其毒性中等，因而可從中尋找鎮痛、抗炎等新藥前體。烏頭亞屬下唐古特烏頭系和圓葉烏頭系是以內酯型二萜生物堿為主的類群，毒性較小，是新藥尋找的重點研究類群。褐紫烏頭系則以C20-二萜生物堿如光翠雀堿和宋果靈為主，雜有高度進化的烏頭堿型二萜生物堿如烏頭堿等成分。化學分類上不支持其獨立成為一個分支。顯柱烏頭系是以含大茴香酸酯基的烏頭堿型二萜生物堿以及塔拉薩敏和查斯曼寧胺醇類為主的類群，是塊根較大的“大烏頭”的主要來源，具大毒。烏頭系以含15-羥基的單酯、雙酯或多酯以及胺醇類烏頭堿型二萜生物堿為主，且酯基中無大茴香酸酯基，此系是草烏的主要植物來源，具大毒。顯柱烏頭系、烏頭系、興安烏頭系和蔓烏頭系可能代表烏頭亞屬進化的類群。從二萜生物堿化學成分來看，露蕊烏頭亞屬與烏頭屬另外兩亞屬差別很大，結合分子系統發育研究、形態學和細胞學結果，支持其為一單獨屬，介于翠雀屬和烏頭屬之間（Wang等，2013）。基于細胞核和葉綠體DNA序列的分子系統樹將形態極相近的九系分為兩群（Hao等，2015a），一為甘青烏頭系、圓葉烏頭系、保山烏頭系和短柄烏頭系，均非單系群而是彼此交織；另一為烏頭系、興安烏頭系、顯柱烏頭系、蔓烏頭系和準噶爾烏頭系（圖1-11），亦均非單系群，化學分類數據支持此分群。為了烏頭資源的可持續利用和發現高效低毒的新化合物，有必要將近年涌現的高通量技術用于烏頭研究。基因組學和轉錄組學技術（參見第3章）將在促進烏頭生物活性化合物研究中發揮關鍵作用。

毛茛科是一個比較原始的真雙子葉植物類群，已知代表性藥用化合物包括芐基異喹啉生物堿、毛茛苷、三萜皂苷和二萜生物堿等。筆者結合近年植物化學研究進展，對毛茛科所含主要化學成分類型和分布進行了系統歸納總結（參見第5章）。毛茛苷和木蘭花堿在一些屬（如毛茛屬、鐵線蓮屬和驢蹄草屬等）共存，而非交替出現（Xiao，1980）。結合了療效數據（肖等，1986）的藥用親緣分析（彭等，2006a，2006b），支持基于分子標記和形態數據提出的分類系統。毛茛科可分為五個亞科：毛茛亞科，唐松草亞科，黃連亞科，黃毛茛亞科和白根葵亞科。毛茛亞科可分為十族。鐵線蓮屬與白頭翁屬和銀蓮花屬（圖1-12）均屬于銀蓮花族，均含較多五環三萜皂苷；鐵線蓮屬還含有黃酮、花青素、木質素、香豆素和生物堿等（孫等，2009；Hao等，2013b），其中五環三萜皂苷已用于化學分類研究。升麻族中，類葉升麻屬和升麻屬的療效和化學成分相近，因此兩屬的親緣關系也近（高等，2008；Hao等，2013c）。由于它們果實的形態差異，以及細胞學特征不同，考慮這兩屬為升麻族植物的一個分支，且類葉升麻屬較升麻屬更為進化。從化學分類學的角度來看，鐵破鑼屬含有特殊鐵破鑼皂苷，可以成為一個獨立的分支。基于細胞核ITS序列的系統發育樹支持以上分析（Hao等，2015a）。黃三七屬既和鐵破鑼屬一樣含有五環三萜和鐵破鑼型環阿爾廷烷四環三萜類，又和升麻屬、類葉升麻屬一樣含有吲哚生物堿，因此認為它是鐵破鑼屬和升麻屬、類葉升麻屬之間的過渡類型。可從毛茛亞科各族選擇10個代表種（貓爪草，小木通，美花草，星果草，驢蹄草，升麻，鐵筷子，黑種草，北烏頭和金蓮花），進行高通量轉錄組測序，從組裝的Unigene中找到單拷貝直系同源基因（＞400），聯用這些基因序列構建系統進化樹，結合化學和形態分類、藥理活性和傳統藥物學資料，考察轉錄組數據在藥用親緣關系推斷中的可用性。

虎耳草目芍藥科（Paeoniaceae）是單屬科，由毛茛科芍藥屬（Paeonia）獨立而來。芍藥屬約35種，分為3個組，即牡丹組（Sect. Moutan）、北美芍藥組和芍藥組（Sect.Paeonia），中國是芍藥科植物的起源、演化、分化發展及多樣性中心，特別是牡丹組為我國特有植物。深入探討芍藥屬藥用親緣關系，闡明該屬植物的分類學地位和種間關系，可為資源利用和保護提供依據（何，2010；何等2010）。基于對牡丹種子的化學成分研究，系統分析中國產芍藥屬種子的化學成分含量與分布，統計分析揭示其化學分類學意義；快速色譜分析白芍、赤芍和牡丹皮的指紋特征，用化學計量學方法分析三味藥材化學成分的差異，探討三味藥材藥性的差異與化學成分差異之間的相關性；基于芍藥屬牡丹組和國產芍藥組的指紋圖譜，進行化學分類學探討，揭示芍藥屬根部主要次生代謝產物分布特點。探討芍藥屬（科）的藥用植物親緣學關系，根據藥用植物親緣學理論展望牡丹種子資源利用前景。對牡丹（P. suffruticosa）成熟種子的乙醇提取物進行分離，通過多種波譜學技術鑒定其中31個化學成分，其中芪類成分11個，單萜苷類11個，黃酮類4個，其他類5個。10種芪類化合物具有清除DPPH自由基和誘導Keap1-Nrf2-ARE信號通路的適度活性，可能有抗癌、抗衰老、抗炎的應用潛力。用HPLC-DAD技術分別建立了同時測定10種芪類和8種苷類化合物的含量測定方法，對芍藥屬種子46份樣品（牡丹組32份，6種4變種1雜種；芍藥組14份，3種）進行含量測定，用主成分分析（PCA）探討芍藥屬化學分類學。對傳統藥用部位根/根皮進行指紋圖譜研究（He等，2010，2014）。用HPLC整體柱快速分析比較白芍、赤芍和牡丹皮81份樣品的指紋圖譜，建立圖譜共有模式，PCA能很好地區分三味藥材。用HPLC-DAD方法對國產芍藥屬52份樣品（牡丹組8種29份，芍藥組6種23份）根部的主要次生代謝產物進行全面分析，分別建立牡丹組和芍藥組的圖譜共有模式，用PCA分別比較兩組植物，均顯示不同程度的區分。化學分類結果與基于形態和地理分布的經典分類較為一致，只有四川牡丹（P. decomposita）例外，其為牡丹和野牡丹兩亞組間的過渡種。根據相同的代謝指紋圖譜，鳳丹（P. ostii）和牡丹（P. suffruticosa）是同一物種。野牡丹（P. delavayi）代謝輪廓變異大，但與黃牡丹P. ludlowii（P. lutea）無顯著差異，提示兩物種親緣關系較近（圖1-13）。上述結果結合今后的基因組親緣分析，對芍藥屬和相關類群的化學分類和藥用親緣研究具有指導意義。

近年藥用親緣研究還涉及小檗科（彭等,2006c），百合科貝母屬（Hao等，2013d）、冬青科冬青屬（Hao等，2013e）、五味子科（劉，2009；許等，2008）和唇形科鼠尾草屬（Li等，2008，2013）等。基于薯蕷科薯蕷屬（Dioscorea）植物形態分類學和分子分類學，通過分析薯蕷屬植物傳統藥效和植物化學成分，對薯蕷屬藥用植物親緣關系進行綜合研究（黃等，2015）。中國薯蕷屬植物約17種，富含甾體皂苷，均屬根狀莖組（Sect.Stenophora Uline），其他植物均為塊莖，富含多糖、鞣質等化學成分，表現出不同的藥效作用。根據薯蕷屬植物已知的化學成分和藥效作用，結合經典形態分類學，將薯蕷屬植物歸為甾體皂苷組、多糖組、多酚組、黃獨素組、薯蕷堿組和其他組。以5個苯乙醇苷類化合物為對照品，采用HPLC-UV測定，探討苯乙醇苷類在苦苣苔科藥用植物中的分布規律及其在系統發育上的重要作用（白等，2013）。苯乙醇苷類廣泛分布在苦苣苔科植物中，不同種類的苯乙醇苷類成分在不同植物類群中分布有明顯差異：阿克苷在本科植物分布廣泛；paraboside B、isonuomioside A、paraboside Ⅱ、paraboside Ⅲ在自然界較少見，在本類群呈間斷分布。結果從化學成分方面佐證了形態學支持的苣苔科芒毛苣苔族比長蒴苣苔族進化的觀點。這些研究均需要在組學層面繼續深化。