第五節　小膠質細胞功能實驗

小膠質細胞作為腦內常駐的免疫細胞，主要參與中樞神經系統的免疫和炎癥反應，當腦內微環境發生變化（如錯誤折疊蛋白、腦損傷或外源性免疫刺激）時，可迅速應激轉化成為具有變形和吞噬能力的激活狀態。阿爾茨海默病是一種最常見的神經變性癡呆，而帕金森病則是最常見的一種運動障礙性疾病。盡管兩種疾病的發病原因和病理改變不同，但膠質細胞活化和神經元的丟失都是其典型的病理特征之一，小膠質細胞引起的神經炎癥、趨化和遷移與吞噬功能的改變與其密切相關。在這些復雜的病理生理變化過程中小膠質細胞是否發生吞噬功能改變和清除能力障礙常是我們關注的問題。本節就體外實驗測定小膠質細胞趨化、遷移、吞噬功能做一介紹。

一、趨化和遷移實驗

1.材料

96孔細胞培養板、96孔收獲板等耗材，96 孔細胞遷移板（購自Cell biolabs Inc.，Cat No. CBA-106），無血清培養基，10%胎牛血清，細胞裂解液。

2.操作步驟（圖1-18、圖1-19）

（1）從4℃冰箱中取出96孔細胞遷移板，使其在室溫下平衡10min。

（2）制備小膠質細胞懸液，每毫升無血清培養基中含（0.1～1.0）×106 個細胞。

（3）無菌環境下，將96孔遷移板蓋子和聚碳酸酯膜層分開，向下室加入150ml含10%胎牛血清的溶液。

（4）將聚碳酸酯膜層放到下室96孔細胞培養板上（要確保下室的溶液中無氣泡），混勻小膠質細胞懸液，吸取100ml置于上室中，蓋好板于37℃培養箱中孵育2～24h。

（5）結束孵育后，用吸頭吸取150ml預熱的細胞分離液到無菌的96孔收獲板中。

（6）從培養箱中取出96孔細胞遷移板，取下中間聚碳酸酯膜層，輕柔滌蕩數次使膜上細胞進入到96孔收獲板的細胞裂解液中，放入37℃培養箱繼續反應30min。

（7）用4×細胞裂解液以1∶75比例稀釋熒光染料。

（8）吸取50ml/每孔稀釋液到96孔細胞培養板中，室溫下孵育20min。

（9）吸取150ml混合液到96孔細胞培養板，于480nm/520nm下波長下測定遷移率。

二、體外測定小膠質細胞吞噬功能（吞噬尼羅紅微球/α突觸核蛋白/Aβ）

1.材料

細胞培養板、玻片、離心管、吸頭等相關耗材，全部購自Nuck公司。培養基和溶液DMEM高糖細胞培養基，HBSS（購自Invitrogen），胎牛血清、胰蛋白酶（購自Hyclone）；重組體人Hilyte? Fluor488-α-突觸核蛋白1-140（貨號55457）；重組體人Hilyte555-Aβl-42（購自Anaspec Inc.，貨號60480）。α-突觸核蛋白A53T突變體（購自Rpeptide，貨號S-1002-2）；α-突觸核蛋白WT（購自Rpeptide，貨號S-1001-2）、AlexaFluor488鬼筆環肽（購自Invitrogen）。

2.操作步驟

（1）制備聚合狀態的α-突觸核蛋白

① Syn/磷酸鹽緩沖液：37℃中以1mg/ml（70μmol/L）溶解，260轉/分持續震蕩14天。

② 將α-突觸核蛋白（Syn）/磷酸鹽緩沖液稀釋為1μmol/L孵育30～60min做核轉位（如NFATs），測定吞噬作用則孵育4h；測定炎癥反應則孵育4～18h。

（2）制備聚合狀態的Aβ： 1.0mg的Aβ（貨號60480）用100%的六氟異丙醇（HFIP）溶解配制成1mmol/L，通風櫥內風干，加入42ml的二甲亞砜溶解，再加入2173ml HBSS，配成母液濃度100μmol/L的Aβ漩渦或超聲混勻即得到單體可溶性Aβ，放于37℃培養箱孵育7天即為纖絲狀。

（3）小膠質細胞吞噬尼羅紅熒光微球

① 多孔板熒光測定

·將小膠質細胞接種于96孔細胞培養板（每孔5×104個細胞），在不含血清的α-突觸核蛋白中分別孵育4h和18h。

·溶解尼羅紅熒光微球（購自Invitrogen），使其濃度為0.03%（用0.1%牛血清白蛋白/磷酸鹽緩沖液孵育的尼羅紅按1∶70比例稀釋）。

取15ml A混合溶液（1%牛血清白蛋白8ml+磷酸鹽緩沖液152ml+0.03%尼羅紅16ml）加入到1ml培養基中。

·將細胞分為兩組：一組用熒光微球孵育；另一組不加熒光微球，各1h。

·為了去除細胞外或細胞外質膜相關的熒光微球的非特異性信號，去掉培養基后用含有0.25mg/ml臺酚藍的磷酸鹽緩沖液將細胞孵育2min，再用磷酸鹽緩沖液漂洗3次。

·用PBST（1% Triton-PBS）裂解細胞。

·用熒光成像讀板儀測定細胞內的熒光微球，535nm波長熒光處激發，575nm發射。

② 吞噬細胞的圖像定量分析

·將小膠質細胞接種于有蓋玻片的24孔細胞培養板（每孔1×105個細胞），并用不同濃度的α-突觸核蛋白處理，測定指定時間。

·按照如上方法加入尼羅紅熒光微球。

·用磷酸鹽緩沖液漂洗細胞并于2%～4%的多聚甲醛中固定。

·加入AlexaFluor488鬼筆環肽（購自Invitrogen），于室溫孵育1h。用4′，6-二脒基-2苯基吲哚（DAPI）或Topro-3進行核染色。

·共聚焦顯微鏡掃描定量（購自Zeiss，型號LSM510），見圖1-20。

·用PBST（1% Triton-PBS）裂解細胞。

（4）小膠質細胞對于α-突觸核蛋白或Aβ的吞噬作用

① 多孔板熒光測定

·從不同基因型的小鼠獲得的原代小膠質細胞接種于96孔細胞培養板（每孔5×104個細胞），24h后，加入濃度為500μmol/L的熒光標記的α-突觸核蛋白中37℃處理4h；或加入5μm纖絲狀Aβ在37℃培養箱孵育30min。

·為了終止細胞外或者細胞外質膜相關的熒光α-突觸核蛋白/Aβ或非特異性信號，去掉培養基然后用含有0.25mg/ml臺酚藍的磷酸鹽緩沖液終止2min，再用磷酸鹽緩沖液漂洗2次。

·用熒光成像讀板儀測定細胞內的熒光微球，激發波長和發射波長分別為503nm/525nm（或者相應波長的紅色熒光波段）。

② 圖像分析小膠質細胞的吞噬作用

·將小膠質細胞接種于有蓋玻片的24孔細胞培養板（每孔1×105個細胞），并用不同聚合狀態的α-突觸核蛋白/Aβ處理預定時間，去除上清液。

·加入濃度為500nmol/L的熒光標記的α-突觸核蛋白或Aβ，37℃孵育，4h。

·為了終止細胞外或細胞外質膜相關的熒光α-突觸核蛋白/Aβ或非特異性信號，去培養基，然后用含有0.25mg/ml臺酚藍的磷酸鹽緩沖液終止2min，再用磷酸鹽緩沖液漂洗2次。

·用磷酸鹽緩沖液漂洗細胞并于2%～4%的多聚甲醛中固定。

·加入AlexaFluor488鬼筆環肽或者555鬼筆環肽（購自Invitrogen），并于室溫下孵育1h。用4′，6-二脒基-2苯基吲哚（DAPI）或Topro-3進行核染色。

·共聚焦顯微鏡下定量（購自Zeiss，型號LSM510），然后用軟件Image J進行小膠質細胞的區域分布和密度分析（圖1-21）。

HilyteTM Fluor 488人α-突觸核蛋白以1mg/ml濃度冰凍保存于10mmol/L磷酸鈉緩沖液中（pH=7.0）。如果一周內使用則保存在2～4℃下，于-80℃下可保存12個月。避光保存且避免凍融循環。

（潘曉東　宋　悅）