第一章　原代神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞功能測(cè)定

第一節(jié)　原代皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元培養(yǎng)

皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元是最常用于神經(jīng)功能檢測(cè)的神經(jīng)細(xì)胞類型。分離后的神經(jīng)元可以用于細(xì)胞毒性試驗(yàn)、觀察細(xì)胞存活、突觸形態(tài)學(xué)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染等離體實(shí)驗(yàn)，也適用于神經(jīng)電生理、藥理學(xué)的研究。海馬因受解剖結(jié)構(gòu)的影響，取材小、因此獲得率較低。通常情況下皮質(zhì)和海馬的原代神經(jīng)元在形態(tài)學(xué)上不會(huì)有太明顯的區(qū)別。本節(jié)介紹應(yīng)用新生（24h以內(nèi)）或孕17～19天的胎鼠，采用急性分離、木瓜蛋白酶消化的方法培養(yǎng)皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元，并結(jié)合免疫細(xì)胞化學(xué)或免疫熒光的方法鑒定所培養(yǎng)的神經(jīng)元的純度。

1.實(shí)驗(yàn)對(duì)象

胎鼠［孕（18±1）天］、新生鼠（出生24h內(nèi)）。

2.實(shí)驗(yàn)材料

（1）器械：無(wú)菌培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、離心管、吸頭（tip）、手術(shù)器械一套（眼科剪、眼科鑷、顯微鑷等）。

（2）試劑：Neurobasal-A 培養(yǎng)基（購(gòu)自Gibco，貨號(hào)10888-022）、L-谷氨酰胺（L-Glutamine，購(gòu)自Gibco，貨號(hào)25030）、B27無(wú)血清添加劑（B27 serum-free supplements，購(gòu)自Gibco，貨號(hào)17504-1044）、多聚賴氨酸（Poly-D-lysine，購(gòu)自SIGMA，貨號(hào)P-1274）、青霉素/鏈霉素溶液100×（Penicillin/Streptomycin Solution，購(gòu)自Hyclone，貨號(hào)SU30010）、木瓜蛋白酶（Papain，購(gòu)自Worthington），乙二胺四乙酸（EDTA，100mmol/L，pH 7.2）、溶解木瓜蛋白酶的平衡鹽溶液（溶木鹽，pH 7.2）［137mmol/L氯化鈉+5.3mmol/L氯化鉀+1mmol/L氯化鎂+25mmol/L葡萄糖+10mmol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）緩沖液+3mmol/L氯化鈣］。

（3）試劑配劑

① 培養(yǎng)基（50ml）：Neurobasal-A培養(yǎng)基（49ml）加入B27無(wú)血清添加劑（1ml）、青霉素/鏈霉素溶液（100×，0.25ml）、L-谷氨酰胺（0.5ml）。

② 木瓜蛋白酶溶液：以一只小鼠為例，配制1.5ml溶木鹽+25ml 木瓜蛋白酶+30ml 乙二胺四乙酸（EDTA）+少量的DNAase和左旋半胱氨酸，無(wú)菌過(guò)濾后，于4℃冰箱中備用。

3.操作步驟

（1）包被：培養(yǎng)前晚上用多聚賴氨酸（25μg/ml）鋪于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板，使其完全覆蓋底面，置于培養(yǎng)箱至少1h或過(guò)夜，用超純水清洗培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板3遍，置培養(yǎng)箱中待其干燥。

（2）取腦：75%乙醇（酒精）全身消毒胎鼠或新生鼠，斷頭處死，無(wú)菌條件下分層剪開(kāi)頭皮、顱骨，用眼科鑷?yán)_(kāi)，小心取出全腦，放于盛有冰冷溶木鹽的平皿中。

（3）分離海馬、皮質(zhì)：以腦中線為起點(diǎn)，小心撥開(kāi)大腦顳葉皮質(zhì)，暴露出新月?tīng)詈ｑR回，小心夾出海馬組織，分離皮質(zhì)，顯微鏡下用眼科剪、顯微鑷分離腦膜、血管膜。

（4）消化和分散：將皮質(zhì)或海馬組織置于裝有木瓜蛋白酶溶液的離心管中，37℃培養(yǎng)箱消化20min，每10min晃動(dòng)1次。吸棄消化液，用完全培養(yǎng)基洗3遍，再加入3～4ml 完全培養(yǎng)基吹打10～15次，靜置1min后，用吸頭吸取上清液至另一干凈的離心管中，再加3～4ml完全培養(yǎng)基吹打、沉淀10～15次，依次吹打，直至沉淀完全分散成單細(xì)胞懸液。

（5）計(jì)數(shù)和接種：混勻所有吹打后的上清液，取少量細(xì)胞懸液以臺(tái)酚藍(lán)染液觀察存活率并計(jì)數(shù)。按1×105/cm2的密度將細(xì)胞種入預(yù)先包被多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)（37℃，5%二氧化碳，飽和濕度）。24h以后換液，之后每3～4天換液一次。

（6）神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)觀察：分散培養(yǎng)的神經(jīng)元，在接種1h后即可貼壁，細(xì)胞呈單個(gè)圓形或橢圓形。2～3天后細(xì)胞明顯增大，突起長(zhǎng)出并延伸。6～7天時(shí)神經(jīng)元在相差顯微鏡下可見(jiàn)具有明顯的光暈。此時(shí)神經(jīng)元呈三角形或多邊形，邊界清晰，胞體明亮，胞核和核仁清晰可見(jiàn)。在培養(yǎng)過(guò)程中神經(jīng)元之間的纖維聯(lián)系逐漸豐富，并形成網(wǎng)絡(luò)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，神經(jīng)元逐漸退化變性，表現(xiàn)為神經(jīng)元胞體光暈消失，胞體皺縮，突起萎縮，有的出現(xiàn)空泡，直至脫落，造成神經(jīng)元的數(shù)量逐漸減少。

（7）神經(jīng)元的鑒定：細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛固定后，β3-微管蛋白（β-Ⅲ-tublin）免疫細(xì)胞化學(xué)染色，胞漿和軸突著色，4′6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）復(fù)染核可以鑒定。圖1-1為典型的神經(jīng)元染色。

（張　靜）