實驗二 糖的薄層層析

【原理】

層析法是利用混合物中各組分物理化學性質的差別（如吸附力、溶解度、分子形狀、大小和極性等），使各組分以不同的程度分布在兩個相中。其中固定不動的稱固定相，流過此固定相的液體或氣體稱流動相。從而使各組分以不同的速度隨流動相向前移動而達到分離的目的。

20世紀初發現植物中各種顏色的色素可以在吸附柱上流動后排列成色譜，從而可以分離提取植物色素，故稱為色層分離法。后來無色物質也可利用吸附柱分離。1944年開始用濾紙做為固定相而出現了紙層析后，層析法不斷發展，成為生物化學中最常用的方法之一。根據其層析過程的機理不同，層析法不斷發展，成為生物化學中最常用的方法之一。根據其層析過程的機理不同，層析可分為以下幾種：

（1）吸附層析：利用吸附劑對各種物質吸附能力的不同，來達到分離的目的。

（2）分配層析：利用各種不同的物質在兩種不同溶劑中的分配系數的不同而達到分離的目的。

（3）離子交換層析：是利用離子交換劑對需要分離的各種離子有不同的親和力，而使其達到分離的目的。

（4）凝膠層析（分子篩層析）：是根據混合物中各種分子的大小及形狀不同，通過凝膠時，分子的擴散移動速率各異，而使大小不同的分子得到分離。

（5）親和層析：是利用高分子物質能與相應的配基特異性的可逆結合的原理而進行分離。

層析法按操作的方式不同，又可分為柱層析、紙層析和薄層層析等。

硅膠具有吸附其他物質的性能，而且它對各種糖的吸附能力是各不相同的。本實驗就利用這種吸附能力的差異，將硅膠在玻璃板上均勻地鋪成薄層，而后將糖的混合液點在薄層上，再用乙酸乙酯、甲醇、冰醋酸和水按一定比例構成的混合液為展開劑進行層析，能使混合的糖分離。再用Molish氏反應使糖顯色，其反應式如下：

層析的結果，可測得被測物質的Rf值。Rf值是用來表示物質被分離后的位置的數值，即物質的遷移率。它是被測物質的移動距離與溶劑移動距離之比。一般應用同一吸附劑和同一溶劑系統展開時，其Rf應相對恒定。因此可以根據Rf值來鑒定被分離的物質。但是被測物質Rf值尚與所用的操作方法、吸附劑的品質、薄層的厚度、溶劑的質量、滴加樣品的數量以及層析缸中蒸氣的飽和度等條件有關。為了避免上述因素的影響，一般都使用已知樣品與被測樣品在同一薄層上，在相同條件下層析，對照所得的Rf值而進行定性鑒定。

【操作】

（1）薄板制備：稱取硅膠G 2.5g于研缽中，加0.02mol/L硼酸溶液10mL，研調成均勻糊狀，鋪于5cm×15cm的玻璃板上。晃動玻璃板，使之均勻分布。置室溫20分鐘凝固后，置110℃烘箱中烘干半小時備用。

（2）點樣：用毛細管分別吸取乳糖、葡萄糖、甘油醛以及三者的混合液各少許，在距薄板一端1.5cm的起點線處，間距1cm分別點樣。點樣的直徑應小于3mm，待樣品干燥后展開。

（3）展開：以薄板30°傾斜放置于層析缸中，后慢慢沿缸壁注入展開劑約0.5cm厚度（注意展開劑的高度必須在薄板的起點線以下），展開劑其體積比為乙酸乙酯∶甲醇∶冰醋酸∶水=12∶3∶3∶2。密閉層析缸，讓其展開。當溶劑的前沿升高到距薄層頂端1cm處，取出薄板于室溫干燥10分鐘后置80℃烘箱中烘10分鐘。

（4）顯色：向薄板均勻噴灑α-萘酚-硫酸試劑，置110℃烘箱中烘3～5分鐘到斑點顯出為止。

（5）求出各點的Rf值。

【附注】

（1）。

（2）薄層層析法的優點是：①設備簡單，操作容易。②層析展開時間短，只需數分鐘到幾小時，即可獲得結果。③分離時幾乎不受溫度的影響。④可采用腐蝕性的顯色劑而且可以在高溫下顯色。⑤分離效率高。

（3）本實驗用0.02mol/L硼酸或用0.02mol/L醋酸鈉代替水來調制硅膠板，可使Rf值比較接近的糖得到更好的分離。

【試劑】

（1）硅膠G。

（2）0.02mol/L硼酸溶液。

（3）2%乳糖溶液。

（4）2%葡萄糖溶液。

（5）2%甘油醛溶液。

（6）2%乳糖溶液、2%葡萄糖、2%甘油醛等體積的混合液。

（7）展開劑：乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸-水（12∶3∶3∶2）。

（8）α-萘酚-硫酸試劑（Molish試劑）:15%α-萘酚乙醇溶液21mL，加濃硫酸13mL，再加乙醇81mL及水8mL混勻置棕色瓶中。要新鮮配制。