實驗八 凝膠層析法人離血紅蛋白與溶菌酶

【原理】

凝膠層析又稱凝膠過濾，是根據樣品中各種物質分子量的不同，將樣品通過凝膠柱來達到分離的目的。

當一混合的蛋白質溶液通過凝膠柱時，分子直徑小于凝膠孔隙的可以進入膠粒內部，分子直徑大于孔隙的不能進入。因此，小分子蛋白質在前進路上通過膠粒時遭到的阻力大，所以流速慢。相反地，大分子蛋白質不會進入膠粒內部，可以比較順利地通過膠粒間的空隙而流出，所以阻力小，流速快。由于流速不同，就可以把分子大小不同的蛋白質分開，因此將凝膠稱為“分子篩”。

凝膠顆粒是多孔性的網絡結構，其特點為化學性質穩定，不帶電荷，與其他物質的吸附力很弱，制成的顆粒機械性能好，不易破碎變形，使液體在層析柱中具有較好的流速。

凝膠過濾的原理可用圖2-8-1表示。

兩種分子大小不等的蛋白質混合溶液經多孔的凝膠顆粒“1”時，小分子蛋白質進入凝膠顆粒，大分子蛋白質不能進入“2”、“3”，因此大分子的蛋白質先被洗出“4”。

用于凝膠過濾的凝膠，有交聯葡聚糖凝膠（Sephadex）、聚丙烯酰胺（Bio-Gel）、瓊脂糖（Sepharose）等。各種凝膠都是三度空間的網狀高聚物，具有一定的孔徑和交聯度。根據被分離物質的分子大小，形狀可選不同類型的凝膠，交聯度愈小，則孔徑（網眼）愈大，能進入凝膠的分子就愈大，根據交聯度的高低，例如Sephadex可分為G10～200，其他凝膠同樣可分不同型號，見表2-8-1。

本實驗使用Sephadex G-50為層析床，將血紅蛋白（紅色、分子量64500左右）與溶菌酶（分子量11400左右）從混合液中分開。血紅蛋白紅色，分子量較大，可觀察到較快地洗脫；溶液酶分子量較小，洗脫得較慢，可用雙縮脲反應，檢查其被洗脫的情況。用蒸餾水為溶劑。

【操作】

（1）凝膠的準備：Sephadex G-50稱取2～4g置于錐形瓶中，加蒸餾水30mL，于沸水浴中煮沸1小時（此為加熱膨脹，如在室溫時膨脹，需放置3小時）取出，待冷致室溫時再裝柱。

（2）裝柱：取直徑為0.8～1.5cm，長度為17～20cm的層析柱1支，在柱底部填少許玻璃棉或海綿圓墊，自頂部緩緩加入稀薄的Sephadex G-50懸液，開始下沉時關閉出口，待底部凝膠沉積1～2cm時，再打開出口，凝膠即逐層上升，加至距柱頂3cm左右即可。操作過程中，應防止氣泡與分層現象的發生。如表層凝膠凹陷不平時，可用細玻璃棒輕輕攪動表面層，讓凝膠自然沉降，使表層平整。

（3）樣品制備：①血紅蛋白的制備。取草酸鉀抗凝血2mL于離心管中，離心5分鐘，棄去上層血漿，用0.9%NaCl溶液洗血細胞2次，每次用5mL，要把血細胞攪起，離心后盡量倒去上清液。加水5mL，混勻，放冰箱過夜使充分溶血，再離心10～15分鐘（2000r/min），使血球膜殘骸沉淀，取上清透明液放冰箱備用。②溶菌酶溶液（150g/L）。③取血紅蛋白稀釋液0.3mL，加溶菌酶0.3mL，此混合物作為樣品。

（4）加樣與洗脫：加樣時先將出口打開，使層析床面蒸餾水流出，待液面幾乎平齊凝膠表層時，關閉出口（不可使凝膠表層干掉）用滴管將樣品（約0.8mL）緩緩地沿層析柱內壁小心加于床表面，注意盡量不使床面擾動，然后打開流出口，使樣品進入床內，直到床面重新露出，用上法加1～2倍于樣品體積的蒸餾水（這樣可使樣品稀釋最小，而樣品完全進入床內）。當此少量蒸餾水將近流干時，反復加入多量蒸餾水，進行洗脫，直至兩帶分開為止。

（5）檢查：觀察血紅蛋白在層析床中色帶位置，不斷加蒸餾水洗脫。待血紅蛋白洗脫完，用試管分別收集洗脫液，每5滴一管，每管加20%NaOH 10滴，0.5%CuSO41滴，（即雙縮脲反應），檢查溶菌酶的洗脫情況。若為紫色，即為陽性，一般開始幾管為陰性，隨之為陽性，接著顏色逐漸加深，出現一個頂峰，以后逐漸減弱變為陰性，表示溶菌酶已洗脫完畢。

【試劑】

（1）交聯葡聚糖凝膠（Sephadex）G 50。

（2）草酸鉀抗凝血液。

（3）0.9%NaCl溶液。

（4）溶菌酶溶液（0.15g/mL）。

（5）20%NaOH溶液。

（6）0.5%CuSO4溶液。