實驗九 肝組織中核酸的分離與鑒定

【原理】

組織細胞中的核糖核酸（RNA）與脫氧核酸（DNA）大部分與蛋白質結合而形成核蛋白。核蛋白質被三氯醋酸沉淀后，用10%NaCl溶液提取核酸的鈉鹽，再加入醇可使核酸鈉沉淀析出。

RNA與DNA均可被硫酸水解產生磷酸、有機堿（嘌呤和嘧啶）和戊糖（RNA含核糖，DNA含脫氧核糖），此三類化合物可用下述方法鑒定之。

（1）磷酸與鉬酸銨作用產生磷鉬酸，后者在還原劑氨萘酚磺酸作用下形成藍色的鉬藍。

（2）嘌呤堿與硝酸銀產生灰褐色的嘌呤銀化合物。

（3）核糖經濃鹽酸或濃硫酸作用生成糖醛，后者和3,5-二羥甲苯縮合而成綠色化合物。

（4）脫氧核糖在濃酸中生成ω-羥[基]-γ-酮[基]戊醛，它與二苯胺作用生成藍色化合物。

【操作】

（1）制備勻漿：將小白鼠1只，拉斷脊椎致死，部腹取出全部肝組織，用清水沖凈血污后，用濾紙吸干，用剪刀剪碎，再加0.9%NaCl液2mL于研缽中制成勻漿。

（2）分離提取：取全部勻漿于離心管（或小試管）內，加2%三氯醋酸2mL，用玻棒攪勻，靜置3分鐘，3000r/min離心3分鐘。棄上清液，于沉淀中加入10%NaCl液2mL，充分混勻，置沸水浴中加熱8分鐘，用玻棒邊加熱邊攪拌（防止玻管底破裂），使之充分生成核酸鈉化合物。取出放冷，3000r/min離心3分鐘。將上清液倒入另一試管內，逐滴加入95%冷乙醇2mL，邊加邊攪拌，待析出白色沉淀。靜置5分鐘后，再3000r/min離心5分鐘，倒去上清液后沉淀備用。

（3）核酸水解：于上述沉淀（核酸鈉）中加入5%H2SO44mL，用玻棒攪勻，在沸水浴中加熱10分鐘，即得核酸水解液。

（4）RNA與DNA成分的鑒定：

嘌呤堿的鑒定：取中試管2支，分別標明測定管與對照管，依次加入各試劑（表2-9-1）。

加入AgNO3后，置沸水浴中5分鐘，觀察兩管顏色有何變化。

磷酸的鑒定：取長試管2支，分別標明測定管與對照管，然后依次加入各試劑（表2-9-2）。

充分混勻，放置3分鐘，再置于沸水浴中3分鐘，比較兩管顏色。

核糖的鑒定：取長試管2支，分別標明測定管與對照管，然后依次加各試劑（表2-9-3）。

將兩試管放入沸水浴內加熱5分鐘，比較兩管之顏色。

脫氧核糖的鑒定：取長試管2支，分別標明測定管與對照管，依次加入各試劑（表2-9-4）。

將兩管同時放入沸水浴中，5分鐘后觀察管顏色之差別。

【試劑】

（1）2%三氯醋酸。

（2）95%乙醇。

（3）0.9%NaCl溶液。

（4）10%NaCl溶液。

（5）5%H2SO4溶液。

（6）5%AgNO3溶液。

（7）鉬酸銨試劑：在20mL水中溶解2.5g鉬酸銨加5 mol/L H2SO430mL，用水稀釋至100mL。此試劑可在冰箱中保存30天。

（8）氨[基]萘酚磺酸：市售氨[基]萘酚磺酸（1,2,4-Aminonaphthal-Sulfonic acid）為暗紅色，可純煉如下：在100mL熱水（90℃）中溶解15gNaHSO4及1g Na2SO4，加1.5g商品氨[基]萘酚磺酸，攪勻使其大部分溶解（僅少量雜質不溶解），趁熱過濾，再迅速使濾液冷卻。加1mL濃鹽酸（12mol/L）有白色氨[基]萘酚磺酸沉淀析出，過濾并用水洗滌固體數次，再用乙醇洗滌，直至純白色為止，最后用乙醚洗滌，并將固體放置在暗處，使乙醚揮發，將此提純的氨[基]萘酚磺酸保存于棕色瓶中。

取15%NaHSO3溶液195mL（必須透明），加入0.5g純化的氨[基]萘酚磺酸及20%液Na2SO35 mL。并在熱水浴中攪拌使固體溶解（如不能全部溶解，再加20%Na2SO3溶液每次數滴，但加入量以1mL為限度），置冷處可保存2～3周，如顏色變黃時，要重新配制。

（9）二苯胺試劑：取1g純的二苯胺溶于100mL冰醋酸（AR）中，加入2.75mL濃硫酸，放在棕色瓶中，此試劑也須臨時配置。

（10）3,5-二羥甲苯試劑：取比重1.19 HCl100mL加入FeCl3·6H2O 100mg及二羥甲苯100 mg，混勻溶解后，置于棕色瓶中，此試劑必須在使用前新鮮配制。市售之3,5-二羥甲苯必須用苯重結晶1～2次，并用活性碳脫色方可使用。