第三章 男性不育相關(guān)檢查

一、精液檢測(cè)

（一）精液粗略估算

禁欲2～7天，精神狀態(tài)良好，來(lái)院手淫取精液于潔凈容器中，送實(shí)驗(yàn)室（若院外取精，至少1小時(shí)內(nèi)）36℃恒溫箱保存，待液化后判斷精液外觀、量、液化情況、黏稠度、酸堿度等，取一小滴精液滴于載玻片上，蓋蓋玻片，400倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)5～10個(gè)視野內(nèi)精子數(shù)量和活率，平均值乘以106/ml，即粗略估算出精子的濃度。由于精子本身存在一定生理波動(dòng)，再加上外界的干擾會(huì)影響精液檢測(cè)的結(jié)果，如果精子存在問題，建議1周后，3周內(nèi)再次復(fù)查有利于對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確判斷。

（二）精子存活率檢測(cè)

1.意義：精液常規(guī)檢測(cè)，無(wú)法區(qū)分死精子與不動(dòng)精子，通過伊紅Y染色可以測(cè)出活精子的正確比例。

2.原理：染料通過精子受損的細(xì)胞膜將精子染成紅色，結(jié)構(gòu)完整的精子不著色。

3.試劑：伊紅Y500mg溶于100ml生理鹽水即可。

4.操作步驟：取新鮮精液5ml滴于玻片上，加等量伊紅Y染液混勻，蓋蓋玻片染色1min后光鏡下觀察。

5.結(jié)果計(jì)算：精子存活率=未著色精子數(shù)/計(jì)數(shù)精子總數(shù)

（一般計(jì)數(shù)200條精子，其中死精子呈紅色，活精子不著色。）

（三）計(jì)算機(jī)輔助精液分析（CASA）

1.工作原理：精子形態(tài)圖像和精子運(yùn)動(dòng)圖像被CCD攝像頭采集后，經(jīng)視頻輸出口輸入到監(jiān)視器和計(jì)算機(jī)圖像采集卡中，計(jì)算機(jī)相應(yīng)的操作軟件根據(jù)設(shè)定的精子大小和灰度、精子運(yùn)動(dòng)的位移及精子運(yùn)動(dòng)的其他有關(guān)參數(shù)，對(duì)采集到的圖像進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析處理。分析結(jié)果打印輸出并保存。

2.操作步驟

（1）接通電源，依次打開主機(jī)電源開關(guān)、顯微鏡、監(jiān)視器、錄像機(jī)、恒溫臺(tái)、打印機(jī)及計(jì)算機(jī)；

（2）鼠標(biāo)點(diǎn)擊《動(dòng)態(tài)分析系統(tǒng)》，輸入檢測(cè)對(duì)象的相關(guān)信息（姓名、年齡、編號(hào)、送檢時(shí)間及精液的一般情況，同時(shí)測(cè)精液的pH）；

（3）將待檢的精液10μl（微升）注入專用的精子計(jì)數(shù)板中，置于顯微鏡操作平臺(tái)上，平衡1～3分鐘；

（4）鼠標(biāo)點(diǎn)擊“活動(dòng)顯示”，調(diào)好焦距；

（5）鼠標(biāo)點(diǎn)擊“計(jì)算分析”，根據(jù)情況選擇“中低密度”項(xiàng)或“高密度”項(xiàng)，調(diào)整灰度和域值大小使之盡量采集全部精子而不采集非精子成分，開始計(jì)算分析；

（6）進(jìn)入計(jì)算分析狀態(tài)后，重新分割新閾值（100～110）和中心閾值（12～16），計(jì)數(shù)圓細(xì)胞數(shù)，開始計(jì)算，采集數(shù)據(jù)，至少5個(gè)視眼，大于200條精子進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)修正，結(jié)束分析；

（7）全部保存，打印。

二、精漿生化檢測(cè)

（一）α- 葡萄糖苷酶的測(cè)定（葡萄糖氧化酶法）

1.意義：精漿α-葡萄糖苷酶由附睪上皮細(xì)胞分泌產(chǎn)生，與精子的成熟和精子的運(yùn)動(dòng)密切相關(guān)，其在精漿中的含量可以反應(yīng)附睪的功能。

2. 原理：麥芽糖有兩個(gè)吡喃葡萄糖殘基，由α-1，4糖苷鍵相連，經(jīng)α-葡萄糖苷酶水解糖苷鍵可生成相應(yīng)量的葡萄糖，再用葡萄糖氧化酶法測(cè)定葡萄糖的生成量。

3.相關(guān)試劑：購(gòu)自深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程有限公司。

4.操作方法

5.結(jié)果計(jì)算

α-葡萄糖苷酶（U/一次射精l）=詳見酶標(biāo)儀操作及結(jié)果計(jì)算。

參考值：≥20U/一次射精。

（二）精漿果糖的測(cè)定（吲哚法）

1. 意義：精漿果糖由精囊腺分泌產(chǎn)生，是精子代謝的能量來(lái)源，其降低會(huì)引起精子的活力低下，導(dǎo)致不育，對(duì)其的測(cè)定可以了解精囊腺的功能。

2. 原理：果糖與吲哚在強(qiáng)酸、加熱環(huán)境中生成有色復(fù)合物，該物質(zhì)在470nm波長(zhǎng)有最大吸收峰，其吸光度大小與果糖含量成正比。

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4.操作方法

取精漿20ml，加稀釋液200ml，加50ml去蛋白液，混合，加堿性溶液50ml，室溫靜置15min，2000r/min離心5min，取上清液備用。

將2.24mmol/L的果糖標(biāo)準(zhǔn)液向下稀釋為1.12、0.56、0.28、0.14mmol/L四個(gè)濃度，上酶標(biāo)儀制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。

5.結(jié)果計(jì)算

果糖（mmol/一次射精）=詳見酶標(biāo)儀操作及結(jié)果計(jì)算

參考值：一次射精≥13mmol。

（三）精漿鋅的測(cè)定（改良PAR法）

1. 意義：精液中鋅是前列腺的功能指標(biāo)之一，鋅直接參與精子生成、成熟、激活和獲能過程，對(duì)精子活力、代謝及其穩(wěn)定性都有重要作用。

2. 原理：鋅與吡啶偶氮間苯二酚在屏蔽劑的作用下，于pH9.5的反應(yīng)體系中生成特異的鋅—色原復(fù)合物，在470nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，其吸光度大小與鋅含量成正比。

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4.操作方法：精漿、標(biāo)準(zhǔn)品各40ml于微孔板內(nèi)，然后分別加屏蔽劑200ml稀釋，充分混勻。

5.結(jié)果計(jì)算

鋅濃度（mmol/一次射精）：詳見酶標(biāo)儀操作及結(jié)果計(jì)算

參考值：一次射精≥2.4mmol。

（四）酶標(biāo)儀操作及結(jié)果計(jì)算

α-葡萄糖苷酶：

將反應(yīng)后的標(biāo)本按下列排放：

置于酶標(biāo)儀待測(cè)板處

開機(jī)（同時(shí)開啟打印機(jī)），待酶標(biāo)儀準(zhǔn)備好后，按下列程序輸入：

順序輸入5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)值和位置

按開始鍵，完成。

結(jié)果計(jì)算：將測(cè)得的R值和RB值和精液量輸入對(duì)應(yīng)的位置，確認(rèn)即可。

果糖：

將反應(yīng)后的標(biāo)本按下列排放：

置于酶標(biāo)儀待測(cè)板處

開機(jī)（同時(shí)開啟打印機(jī)），待酶標(biāo)儀準(zhǔn)備好后，按下列程序輸入：

順序輸入5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)值和位置

按開始鍵，完成。

結(jié)果計(jì)算：將測(cè)得的兩個(gè)R值和精液量輸入對(duì)應(yīng)的位置，確認(rèn)即可。

鋅：

將反應(yīng)后的標(biāo)本按下列排放：

置于酶標(biāo)儀待測(cè)板處

開機(jī)（同時(shí)開啟打印機(jī)），待酶標(biāo)儀準(zhǔn)備好后，按下列程序輸入：

按開始鍵，完成。

結(jié)果計(jì)算：將測(cè)得的空白值、標(biāo)準(zhǔn)值、測(cè)定值和精液量輸入對(duì)應(yīng)的位置，確認(rèn)即可。

（五）精子頂體酶定量測(cè)定

1.意義：精子頂體是特化了的溶酶體，內(nèi)含多種水解酶，頂體酶定量檢測(cè)可以評(píng)價(jià)精子質(zhì)量，是輔助診斷男性不育的有效指標(biāo)。

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3.操作方法

將7.5/所測(cè)精子密度所得毫升數(shù)各加于T、C管，3000r/min，離心20min，棄去精漿

4.結(jié)果計(jì)算

精子頂體酶活性

5.參考標(biāo)準(zhǔn)：48.2～218.7μIU/106精子

6.注意事項(xiàng)

（1）精子分離后，一定要小心吸除上清液，不能丟失精子；

（2）溶酶劑4℃保存會(huì)出現(xiàn)結(jié)晶現(xiàn)象，使用前請(qǐng)37℃溫育至完全溶解。

三、精液生精細(xì)胞檢測(cè)

（一）意義

精液中生精細(xì)胞檢查可反映睪丸生精功能情況，與精漿生化指標(biāo)結(jié)合可鑒別阻塞性無(wú)精子癥和非阻塞性無(wú)精子癥。

（二）操作步驟

將精液洗滌后沉淀涂片，采用瑞—吉染色或Diff-Quik法染色。

（三）結(jié)果判斷

1.精原細(xì)胞：在電鏡下分A、B兩型，A型體積小呈卵圓形，B型體積較大呈球形。染色，A型又分為Ad（暗A(chǔ)型）、Ap（亮Ap型），Ad型細(xì)胞核呈圓形、深染，核內(nèi)染色質(zhì)顆粒細(xì)小，在核中常顯示大而淡染的胞核，有1～2個(gè)核仁；Ap型細(xì)胞核呈卵圓形，核內(nèi)染色質(zhì)顆粒粗大，不易被蘇木精著色呈淡染，有1～3個(gè)核仁；B型核為圓形，核周有塊狀染色質(zhì)，染色質(zhì)顆粒著色淺，有1～2個(gè)核仁；

2.初級(jí)精母細(xì)胞：細(xì)胞體積比精原細(xì)胞大，初級(jí)階段與B型精原細(xì)胞不易區(qū)分，隨著生長(zhǎng)，細(xì)胞質(zhì)不斷增多，體積增大，胞質(zhì)豐富，直徑＞18mm。核仁明顯；

3.次級(jí)精母細(xì)胞：細(xì)胞體積小，呈圓形，直徑12mm，核染色質(zhì)呈網(wǎng)狀，其在分裂間期停留時(shí)間很短；

4.精子細(xì)胞：形態(tài)多樣，大小各異，其體積比次級(jí)精母細(xì)胞小，細(xì)胞呈圓形，核小而著色深，核旁有高爾基復(fù)合體，胞質(zhì)內(nèi)含有線粒體，呈顆粒狀散在分布。

四、內(nèi)分泌檢測(cè)

男性生殖相關(guān)激素檢測(cè)主要是FSH、LH、PRL、T、E2等，檢測(cè)方法一般采用放射免疫測(cè)定法和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。

FSH和LH均為糖蛋白激素，由共同的α-亞單位和各自特異的β-亞單位組成，β-亞單位決定激素的特異性，在垂體產(chǎn)生和分泌。它們的合成和分泌由下丘腦分泌的GnRH調(diào)節(jié)，同時(shí)還受T、E2的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，睪丸合成分泌的抑制素和激活素等也參與它們的調(diào)節(jié)。FSH和LH呈脈沖式分泌，2小時(shí)左右一個(gè)脈沖，但性成熟男性一般在一個(gè)相對(duì)較窄的范圍內(nèi)波動(dòng)。

PRL是一種蛋白激素，由垂體分泌，在T存在的條件下，促進(jìn)男性前列腺和精囊腺的生長(zhǎng)，增強(qiáng)LH對(duì)間質(zhì)細(xì)胞的作用，使T合成增加。呈脈沖分泌，每天有14個(gè)脈沖波，基礎(chǔ)分泌呈晝夜規(guī)律變化，中午最低，下午輕度升高，夜間入睡后顯著升高，午夜至凌晨達(dá)高峰，上午逐漸下降，情緒、創(chuàng)傷等應(yīng)激對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響大。

T是一種類固醇激素，由睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成和分泌，通過正負(fù)反饋和旁分泌調(diào)節(jié)體內(nèi)的濃度，正常情況下睪丸內(nèi)T濃度較外周血高百余倍，睪丸內(nèi)高T濃度對(duì)精子的產(chǎn)生至關(guān)重要，外周血T主要參與機(jī)體的生理需要和內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)作用。T與白蛋白、性激素結(jié)合球蛋白和皮質(zhì)醇結(jié)合蛋白等相結(jié)合形成結(jié)合睪酮，體內(nèi)游離睪酮約占2%，研究發(fā)現(xiàn)具有生物活性的睪酮包括游離睪酮和清蛋白結(jié)合睪酮。

E2是一種類固醇激素，主要由雄激素在芳香化酶的作用下形成，據(jù)研究睪丸內(nèi)雌激素濃度可高達(dá)萬(wàn)余pg/ml，較外周血高千余倍，在男性體內(nèi)作用比較復(fù)雜，參與精子的形成、睪酮作用的協(xié)調(diào)等。

五、遺傳學(xué)檢查

遺傳因素與嚴(yán)重少精子癥和無(wú)精子癥關(guān)系密切，且有影響下一代的風(fēng)險(xiǎn)，因此，針對(duì)精液嚴(yán)重異常的患者檢查染色體就顯得非常重要。

染色體是基因的載體，是組成細(xì)胞的基本成分，是染色質(zhì)分裂周期中的一個(gè)階段——中期。在染色體檢查時(shí)，首先抽取外周血培養(yǎng)、積累分裂中期的細(xì)胞，將盡量多的細(xì)胞中止于中期，而不向分裂的后期和末期發(fā)展，再經(jīng)過G顯帶或C顯帶制備成片，觀察每一條染色體的情況，判斷是否存在異常。

Y染色體微缺失是基因水平的測(cè)定，通過抽取外周血，提取DNA，根據(jù)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳，觀察是否存在基因缺失。具體每一區(qū)域缺失的意義見“男性不育臨床疾病篇”。

六、免疫學(xué)檢查

男性自胎兒、新生兒、青春期到成年的生殖復(fù)雜發(fā)育過程導(dǎo)致生殖系統(tǒng)具有多種抗原性，在正常情況下，有血睪屏障、精漿免疫抑制活性物質(zhì)和免疫活性細(xì)胞的作用，不發(fā)生免疫反應(yīng)。當(dāng)血睪屏障被破壞和免疫功能障礙時(shí)就會(huì)產(chǎn)生針對(duì)生殖的免疫反應(yīng)，從而通過損害精子的運(yùn)動(dòng)、阻止精子穿過宮頸黏液、抑制精子頂體的活性、胚胎毒性作用等影響生育。但是免疫因素對(duì)生育的影響必須是免疫問題存在生殖系統(tǒng)、作用于生殖系統(tǒng)才能影響生育。目前常用的檢查方法有酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）、免疫珠法（IBT）、混合抗球蛋白反應(yīng)實(shí)驗(yàn)（MAR）、精子凝集試驗(yàn)（TAT）、精子制動(dòng)實(shí)驗(yàn)（SIT）等。下面簡(jiǎn)單介紹MAR檢查。

1. 意義：用于男、女性不育患者的病因分析，為男、女性免疫性不育的診斷、治療提供重要依據(jù)。

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3.操作方法：取新鮮液化的精液標(biāo)本10μl于載玻片上，加10μl乳膠抗原充分混勻，再加10μl抗血清亦充分混勻，蓋上蓋玻片，置（37℃）5min，顯微鏡下觀察結(jié)果。

4.結(jié)果判斷

（-）：活精子在乳膠顆粒之間自由游動(dòng)；

（+）：活精子與乳膠顆粒黏附凝集在一起百分率在10%～25%；

（++）：活精子與乳膠顆粒黏附凝集在一起百分率在25%～50%；

（+++）：活精子與乳膠顆粒黏附凝集在一起百分率在50%～75%；

（++++）：活精子與乳膠顆粒黏附凝集在一起百分率大于75%。

5.注意事項(xiàng)：試劑切忌冷凍，使用時(shí)應(yīng)恢復(fù)至室溫并搖勻。

七、生殖系統(tǒng)B超

由于超聲檢查的敏感性及其方便、易行的特點(diǎn)，已經(jīng)成為陰囊內(nèi)疾病最常用的輔助檢查手段。同時(shí)由于現(xiàn)代超聲技術(shù)的發(fā)展，高分辨率的機(jī)器能探測(cè)到小至1mm的病變，因此，在對(duì)由于各種原因如陰囊外傷、疼痛、不育、對(duì)側(cè)睪丸腫塊、附睪腫塊、鞘膜積液、不明原因腹膜后腫塊患者進(jìn)行陰囊超聲檢查時(shí)有可能發(fā)現(xiàn)一些臨床上體檢未能捫及的睪丸腫塊。

近幾年比較熱門的是睪丸微石癥，男性不育癥中發(fā)病率6.2%，以輸精管內(nèi)鈣質(zhì)沉積為特征，多雙側(cè)睪丸同時(shí)累及，早期曾認(rèn)為是一種良性疾病，目前認(rèn)為有發(fā)生睪丸腫瘤的傾向。