第二章　新生兒基因篩查方法

第一節　基因篩查進展

新生兒疾病篩查是指在新生兒群體中，用快速、簡便、敏感的檢驗方法，對一些危害兒童生命、導致兒童體格及智能發育障礙的遺傳性疾病進行篩檢，做出早期診斷，可在患兒臨床癥狀出現之前給予及時治療，避免患兒機體各器官受到不可逆損害的一項系統保健服務。

1961年，美國Guthrie教授應用細菌抑制法，檢測干濾紙血片中苯丙氨酸的濃度篩查苯丙酮尿癥（phenylketonuria，PKU）。1973 年，Dussault 教授等用干血濾紙片采集新生兒末梢血，并通過放射免疫法測定T₄篩查先天性甲狀腺功能減退癥（congenital hypothyroidism，CH）；1975年，日本 Irie和Naruse教授通過干血濾紙片中測定TSH成功篩查CH。從此之后，以PKU與CH為主要疾病的新生兒早期篩查開創了新生兒疾病篩查的歷史，其良好的社會效益和經濟效益為以后進行更多新生兒疾病篩查提供了范例。1990年，美國杜克大學陳垣崇教授研究團隊首先提出了利用串聯質譜技術（tandem mass spectrometry，MS/MS）進行新生兒疾病篩查，此技術能在2～3分鐘內對干濾紙血片標本單次檢測同時分析數十種小分子代謝物，可以篩查出包括氨基酸、有機酸和脂肪酸氧化代謝紊亂在內的50多種遺傳代謝?。╥nherited metabolic disease，IMD），還可用于溶酶體貯積癥的篩查，實現了由傳統新生兒IMD篩查的“1種實驗-1個代謝物-1種疾病”向“1種實驗-多個代謝物-多種疾病”的轉變。由于MS/MS檢測快速、靈敏、高通量和選擇性強等特點，在新生兒IMD篩查應用中擴展了篩查疾病譜，提高了篩查效率及篩查特異度、靈敏度，無疑是自細菌抑制實驗篩查苯丙酮尿癥的40多年來在IMD篩查方面取得的最引人注目的進展，為新生兒IMD篩查開辟了新的領域，但由于新生兒血液中代謝物水平、酶活性等易受新生兒生理狀態、母體因素、采血時間等多種因素影響，如先天性腎上腺皮質增生癥（congenital adrenal hyperplasia，CAH）、甲 基 丙二酸血癥等疾病篩查結果假陽性率較高，陽性預測值低，大大增加了召回和隨訪難度；同時某些篩查指標特異度不強，存在漏篩風險，假陰性率高，如希特林蛋白缺乏所致新生兒肝內膽汁淤積癥（neonatal intrahepatic cholestasis caused by Citrin deficiency，NICCD）、戊二酸血癥Ⅰ型等。另外，部分遺傳代謝病的臨床表型具有高度異質性，需結合多種分析手段進行診斷，如MS/MS與血液酶學檢測或與尿液氣相色譜檢測相結合，對于高度疑似的疾病，最后仍需基因檢測確診，導致疾病周期長，延誤治療。此外，有些疾病沒有特異的代謝物可供方便檢測，使得直接對疾病的致病基因進行檢測是唯一的選擇。隨著基因測序技術的快速發展、醫學遺傳學研究的不斷深入，以及治療遺傳病的新藥不斷涌現，越來越多的由基因變異引起的遺傳病基因篩查和相關臨床研究在國內外廣泛開展，突顯了基于基因檢測的新生兒疾病篩查與診斷在出生缺陷三級防控中早診斷、早治療的廣闊前景。

一、新生兒基因篩查的基本原則

（一）疾病選擇原則

1968年，Wilson和Jungner回顧分析了新生兒篩查的歷史，提出了新生兒疾病篩查應符合的10項原則：①對篩查的疾病已有全面了解；②篩查的疾病可治療；③具有有效的診斷和治療設施；④可識別的早期癥狀；⑤具有迅速準確可靠的檢測方法；⑥適合群體大樣本檢測；⑦能及時報告和確診；⑧嚴格質量控制；⑨有干預和隨訪系統；⑩成本在經濟上平衡，強調不僅要通過可靠、經濟的方法篩選出嚴重的先天性疾病，更需要后期有效的治療及連續的隨訪干預。

2010年7月美國新生兒和兒童遺傳性疾病咨詢委員會（American Advisory Committee on Neonatal and Genetic Diseases）更新了候選病種的評估方法，目前國際上公認的新生兒疾病篩查病種的選擇標準為：①疾病危害嚴重，可導致殘疾或死亡；②發病率相對較高，且發病機制與異常產物已闡明；③疾病早期無特殊癥狀，但有實驗室指標能顯示陽性；④有準確可靠、適合在新生兒群體中大規模進行篩查的方法，假陽性率和假陰性率均較低，并易為家長所接受；⑤已建立有效治療方法，特別是通過早期治療能逆轉或減慢疾病發展，或改善其預后；⑥篩查費用、醫學治療效果及社會經濟效益的比例合理。

新生兒疾病基因篩查在遵守上述原則的基礎上，同時還需要遵守以下原則：①測序或其他遺傳學方法不應取代原有的新生兒疾病篩查方法；②醫療團隊需有較好的遺傳學基礎與大數據分析能力；③嚴格保護嬰兒及其家人隱私。

（二）知情同意原則

新生兒基因檢測就是對新生兒的基因進行篩查，對新生兒的一些先天性疾病患病風險和兒童藥物敏感基因進行評估和提示。新生兒基因篩查的首要流程就是對其父母進行相關知識的宣教和知情同意選擇。新生兒基因篩查應遵循自主性（知情選擇）、有益性（良好效益）、安全性（避免傷害）和公平性（公正平等）的規則。同時，基因篩查項目制訂需要充分考慮疾病的發病率、篩查技術的可行性、推廣性及可治性等關鍵問題。在我國新生兒疾病篩查遵循知情選擇原則，具有法律約束，但并非強制性。目前主要通過新生兒疾病篩查宣傳手冊、演講等方式讓家屬了解新生兒基因篩查的方法和意義，簽訂書面知情同意并簽字執行。

（三）個人信息保密原則

新生兒由于沒有完善的自我認知，無自主選擇能力，通常其知情同意選擇和決定權只能由其父母或其他家屬代為行使，甚至有些棄嬰選擇做新生兒篩查的權利也只能完全由醫生決定。新生兒基因篩查更是涉及多機構多環節的系統工程，新生兒和其監護人信息隨著血樣卡片要經過標本采集醫院、快遞公司或郵局，以及篩查中心三個環節多個醫護人員，醫務人員要嚴格遵守醫務工作者道德操守，減少無關人員參與，降低信息外漏概率，為其保守個人信息應是每個醫護人員遵守的職業操守和義務。

（四）保證標本質量原則

新生兒的基因篩查目前已經覆蓋除鄉鎮衛生院級別以外的各級別醫院，不同醫院的醫護人員、工作環境分配不同，導致樣本采集量、儲存方式、保存時間、遞送路途、檢測指標等各方面都難免存在差異。標本采集的質量是新生兒篩查最重要的環節，應該注重采血過程、血樣保存時間及轉運過程，避免對測定結果產生不良影響，檢測機構應安排固定專人負責新生兒篩查標本的采集與送檢。紙血片標本晾干后要用篩查中心提供的封口袋密封裝在專用遞送信封內，減少信息泄漏機會，才能提高新生兒篩查的質量，盡量減少假陽性和假陰性的發生。

（五）治療和隨訪尊重家屬意愿原則

對于篩查陽性和確診的患兒，通常其家屬都會出現精神焦慮、痛苦、絕望等負面情緒，因此需要相關人員做好安撫、溝通和解釋工作，從而緩解家屬的精神壓力；同時也要在尊重監護人和家屬意愿的原則上積極開展治療和進行隨訪。新生兒基因篩查費用有相對便宜和昂貴之分，建議診療費用可否納入醫保以緩解患兒家庭經濟壓力。國內和國外研究均顯示新生兒篩查具有良好的成本效益比，這些都證明了新生兒基因篩查的可行性。新生兒篩查的出現，改善了患兒今后的生活質量，減輕了社會壓力，也符合醫學倫理學有利原則。

（六）資源配置公平公正原則

新生兒基因檢測篩查還應具備公平原則，讓每位新生兒都享有相等的權利和資源保障。目前，我國新生兒基因檢測和診斷服務覆蓋率低、服務能力不足、效能不高，以及遺傳病診斷區域發展不平衡。此外，當前新生兒基因檢測價格較為昂貴，有些區域尚未納入醫保，這些都導致了新生兒基因檢測的供需不平衡。國際人類基因組倫理委員會在《藥物基因組學社會共濟、公平和管理問題聲明》中也提到，公平的目的在于降低不同人群健康的不平等，努力實現醫療衛生資源公平分配。資源配置的公正表現包括機會公正和實質公正，機會公正即每個新生兒機會均等地獲取基因檢測資源；實質公正則強調按需分配，即根據需要原則，優先保障新生兒享受基因檢測資源。隨著基因組學的發展，運用基因檢測技術進行相應疾病的篩查診斷成為當前醫療衛生服務的新項目。因此，如何保證公正原則，合理公正地分配醫療資源，實現新生兒基因檢測的公益性，讓每位新生兒機會均等，盡可能讓每個新生兒獲得公平的檢測機會對保障新生兒的健康權利，滿足其基本的醫療需求有重要意義。因此，新生兒基因篩查應在公正原則的倫理要求下，平等公正地配置新生兒基因檢測醫療資源，滿足廣大民眾的基本醫療需求，保護新生兒的健康利益。

二、新生兒基因篩查技術進展

按照Wilson-Jungner標準，用于新生兒篩查的技術必須簡便可靠。根據不同疾病的特征指標或臨床表型，很多技術被應用于新生兒疾病篩查。經過60年來的發展，新生兒疾病篩查技術不斷發展和更新，從基于生化、酶學的傳統篩查技術到目前發展迅速的基因檢測技術，使新生兒疾病基因篩查項目已展現出良好前景，但新生兒疾病基因篩查仍處在探索之中。

（一）新生兒疾病傳統篩查技術

1.細菌抑制法

是對干血濾紙片中的苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）進行半定量測定，早期主要應用于苯丙酮尿癥的篩查，具有結果直觀、操作簡單，不需要特殊儀器設備等優點，但該檢測方法在實驗中引起誤差的影響因素較多，結果判讀受主觀因素的影響較大，且只能進行半定量檢測，精確度不夠，不能為臨床提供一個明確治療依據。

2.酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）

是以酶標記的抗原或抗體作為主要試劑的免疫檢測方法，具有快速簡便、易于標準化等優點，在早期先天性甲狀腺功能減退癥篩查中得到廣泛應用，但該法靈敏度較低，容易漏檢，且酶液容易受溫度影響，有效期較短，強光照射也會影響試劑靈敏度。

3.時間分辨熒光免疫法（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）

是一種非放射性核素免疫分析法，通過測定干血濾紙片中促甲狀腺素和 17α-羥孕酮（17α-HOP）含量分別對新生兒先天性甲狀腺功能減退癥與先天性腎上腺皮質增生癥進行篩查，因檢驗結果更為可靠而逐步取代了ELISA。該法主要具有標記物制備簡便、儲存時間長、無放射性污染、檢測重復性好等優點，極大地提升了光學分析的靈敏度。

4.熒光法

化學熒光定量法是國內推薦的PKU篩查方法，通過檢測反應產物的熒光強度測定計算受檢樣本中Phe濃度。相對于細菌抑制法，該檢測方法靈敏度高、抗干擾能力較強，能準確測序Phe含量，對臨床的治療診斷有較大的意義，且還可用于診斷有遺傳基因缺陷的無癥狀的家屬和患者，但操作較為煩瑣。熒光斑點法是目前各國常用的直接測定葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥的篩查方法，國內許多實驗室采用熒光斑點試驗作為初篩，然后采用G6PD/6PGD比值法做定量診斷。該方法操作簡便、快捷、重復性好、費用低廉，適用于大批量樣本篩查，但結果易受主觀判斷影響、對輕度患者檢出率不高、對樣本新鮮度要求高、結果易受樣本保存方法的影響等問題。

5.串聯質譜法

高效液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）系統，可一次檢測氨基酸和肉堿等40多種指標，同時篩查出氨基酸代謝異常、脂肪酸代謝異常及有機酸血癥等50余種IMD，大大提升了篩查效率，實現了從“一種實驗檢測一種疾病”到“一種實驗檢測多種疾病”，特異度高、靈敏度強、檢測快速、通量高的特點。但是有些疾病不能用MS/MS篩查，包括先天性甲狀腺功能減退癥、聽力損傷、囊性纖維化和生物素酶缺乏癥等。另外，代謝物指標受多種因素影響，且部分指標變化對疾病判斷的特異性不高而容易造成漏診。

雖然傳統新生兒篩查通過檢測代謝物濃度或酶活性簡便易行且成本較低，但方法學具有局限性，篩查病種有限，因新生兒血液中代謝物水平、酶活性等易受新生兒生理狀態、母體因素、采血時間等多種因素影響，先天性腎上腺皮質增生癥等疾病篩查結果假陽性率較高；而某些篩查指標特異度不高，NICCD和戊二酸血癥Ⅰ型等假陰性率高。另外，部分IMD的臨床表型具有高度異質性，需結合多種分析手段進行分析診斷，如MS/MS與血液酶學檢測或尿液氣相色譜檢測相結合，對于高度疑似的疾病，最后仍需基因檢測確診，導致疾病周期長，延誤治療。此外，有些疾病沒有特異性代謝物可供檢測，使得直接對疾病的致病基因進行檢測是唯一的選擇。

（二）基于基因檢測的新生兒疾病篩查技術

基因檢測技術可以彌補生化、酶學、MS/MS等篩查方法的不足。根據不同基因致病變異的特點，可以采取不同的基因檢測方法進行新生兒疾病篩查。

1.實時熒光定量PCR（QF-PCR）

通過熒光探針（Taqman探針）或熒光染料（SYBR）標記實現對PCR產物量增加過程中的實時監控，在PCR到達指數期時進行定性或半定量檢測。熒光定量PCR技術主要應用于新生兒耳聾基因、脊髓性肌萎縮、地中海貧血、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥、重癥聯合免疫缺陷病、X連鎖無丙種球蛋白血癥等疾病篩查。該技術具有特異度強、靈敏度高、操作簡便等特點，但只能針對已知突變位點進行設計和檢測。

2.基因芯片

該技術基本原理是核酸雜交，根據DNA互補配對原則，利用基因探針識別特定基因，通過檢測雜交信號的強度及分布，對待檢序列進行定性或定量檢測。常用的基因芯片是親和表面芯片，其原理是將大量檢測探針以預先設計的方式固定在玻片、硅片及纖維膜等載體上組成密集的探針陣列，將樣本通過PCR擴增并進行熒光標記，然后與芯片探針雜交，再用激光掃描雜交信號，通過芯片判別系統進行信號讀取及判斷，得到基因表達或突變的信息。多用于新生兒耳聾基因篩查、囊性纖維化（cystic fibrosis，CF）、杜氏肌營養不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）二階篩查等，利用聚合芯片電泳的方法還能早期篩查診斷脆性X染色體綜合征。此外，基因芯片技術也被應用于葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥和苯丙酮尿癥的基因檢測。該技術具有高通量、自動化、微型化等優點，檢出率及準確性高，適合于臨床大樣本的篩查。

3.MassARRAY核酸質譜技術

該系統基于基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術，整合了PCR技術的高靈敏度、芯片技術的高通量和質譜技術的高精確度，是目前唯一應用質譜技術直接檢測單核苷酸變異的技術平臺。其原理是進行待測基因靶向PCR擴增后的產物，加入目標變異序列特異延伸引物，在變異位點上，延伸1個堿基。然后將制備的樣品分析物與芯片基質共結晶，將該晶體放入質譜儀的真空管用強激光激發，核酸分子轉變為亞穩態離子按照其質荷比率分離，在真空小管中飛行到達檢測器。主要特點為高準確度和靈基因分型分析。

4.二代測序

也稱為下一代測序（next generation sequencing，NGS），能同時對幾十萬甚至幾百萬DNA分子進行平行測序。與一代測序（Sanger法）相比，NGS可以以很低的成本對大量的DNA序列測序，可以同時覆蓋多個基因的所有編碼序列。根據檢測覆蓋范圍的不同分為三大類：靶向測序（targeted sequencing，TS）、全外顯子組測序（whole exome sequencing，WES）及全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）。TS 針對一組特定疾病基因組成檢測包（Panel），對特定疾病相關的致病基因進行靶向捕獲或富集，然后進行NGS測序。該技術檢測周期短，可一次性檢測多個基因，小范圍的檢測具有更高測序深度、靈敏度強。WES是對整個基因組中所有編碼序列進行測序，可以檢出整個外顯子區域的突變，相比于Panel測序范圍更大，還能發現新的致病突變，尤其適用于對目標疾病診斷沒有明確方向時進行檢測。WGS覆蓋整個基因組，較WES覆蓋區域更廣，在檢測非編碼區變異、拷貝數變異、線粒體基因組變異等方面更具優勢，相比于WES在疑難病例診斷方面效率更高，但是成本高和數據分析的挑戰，使該技術在臨床應用上具有局限性。

三、新生兒基因篩查進展

20世紀初期，遺傳學家摩爾根通過果蠅的遺傳實驗，認識到基因存在于染色體上，并且在染色體上呈線性排列，從而得出了染色體是基因載體的結論。1909年丹麥遺傳學家約翰遜（W.Johansen）在《精密遺傳學原理》一書中正式提出“基因”概念。20世紀50年代沃森和克里克提出了DNA雙螺旋結構以后，人們進一步認識了基因的本質，即基因是具有遺傳效應的DNA片段。研究結果還表明，每條染色體只含有1～2個DNA分子，每個DNA分子上有多個基因，每個基因含有成百上千個脫氧核苷酸。基因（遺傳因子）是產生一條多肽鏈或功能RNA所需的全部核苷酸序列?；蛑С种幕緲嬙旌托阅埽瑑Υ嬷姆N族、血型、孕育、生長、凋亡等過程的全部信息。生命繁衍、細胞分裂和蛋白質合成等重要生理過程，生物體的生、長、衰、病、老、死等一切生命現象都與基因有關。它也是決定生命健康的內在因素。進入21世紀后，很多科學家和臨床醫師應用PCR和NGS等分子生物學技術，探索對新生兒疾病進行基因檢測和基因篩查。目前，基因檢測技術在國內外新生兒疾病相關研究進展主要集中在以下三方面：①對于生化指標異常者再次使用干血濾紙片進行基因篩查，包括CF、DMD和NICCD等疾?。虎趯μ囟òl病機制明確的疾病直接進行靶向基因或DNA篩查，包括遺傳性耳聾、重癥聯合免疫缺陷?。╯evere combined immunodeficiency disease，SCID）、脊髓性肌萎縮（spinal muscular atrophy，SMA）、脆性X染色體綜合征（fragile X syndrome，FXS）等疾病；③基于NGS技術在新生兒疾病基因篩查的探索性研究，通過WES或WGS技術在新生兒遺傳病風險預測、攜帶者篩查和疾病診斷方面研究。

（一）基因檢測作為新生兒疾病的二階篩查

CF是白種人中最常見的常染色體隱性遺傳病。1979年，Crossley團隊發現CF患兒干血斑中免疫反應性胰蛋白酶（immunoreactive trypsin，IRT）濃度顯著升高。繼而，澳大利亞和美國等國家開始采用IRT/IRT方法對新生兒進行CF篩查，即對IRT指標初篩異常患兒召回再次采血檢測IRT，但臨床發現一些患兒二次召回采集的血樣中IRT水平急劇下降。因此，20世紀90年代初美國威斯康辛州與澳大利亞一起開發了IRT/DNA篩查方法，即對IRT指標初篩異?；純?，使用已有干血斑檢測CFTR基因突變進行二次篩查。IRT/DNA二階篩查路徑的應用，可以避免二次篩查IRT水平降低的問題，使CF篩查的靈敏度明顯提升。直到2010年，美國50個州都已開展CF新生兒二階基因篩查。

DMD可以通過測定干血斑中肌酸激酶（creatine kinase，CK）濃度進行新生兒篩查，但該方法具有較高的假陽性。2012年，Mendell等首次建立了CK濃度檢測聯合DMD基因檢測的二級篩查方法，首先測定干血斑中CK濃度，再對CK濃度較高樣本，利用同一血斑采用多重連接探針擴增技術（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）分析 DMD 基因的變異情況。在37 649例男性新生兒受試者中，發現6例有DMD基因外顯子缺失變異，其CK水平均 ＞ 2 000U/L。另有 3例 CK 水平 ＞ 2 000U/L 的樣本中未發現DMD基因異常，但發現了肢帶肌營養不良相關基因變異。研究表明，通過二次基因篩查既能有效降低CK篩查假陽性，還能為篩查陽性新生兒的初次隨訪提供路徑。隨后，澳大利亞和中國浙江大學醫學院附屬兒童醫院開展了該方法的試點研究。在該院開展的DMD新生兒篩查試點研究，采用檢測CK對96 409例男性新生兒干血斑樣本進行了篩查，共發現400U/L＜ CK ＜ 700U/L 的新生兒 396 例，CK ＞ 700U/L 新生兒83例，再次通過基因檢測，最終確診17例DMD和2例BMD，男性新生兒發病率為1：4 560。

NICCD是一種因SLC25A13基因表達異常導致的希特林蛋白（Citrin）功能缺陷，進而造成一系列生化代謝紊亂的隱性遺傳病。現主要通過MS/MS測定干血斑中瓜氨酸濃度進行該疾病的早期篩查。由于新生兒出生后瓜氨酸濃度可能不會立即升高，導致該疾病MS/MS漏篩較多。浙江大學醫學院附屬兒童醫院一項研究，將3萬余例瓜氨酸為18～38μmol/L（瓜氨酸指標的cut-off值為38μmol/L）的新生兒，采用MassARRAY技術平臺進行SLC25A13基因熱點突變位點檢測，確診了5例MS/MS漏篩的NICCD患兒，表明MS/MS聯合基因篩查能提高NICCD的檢出率。

目前，基于NGS的超高重PCR、MassARRAY核酸質譜技術和靶向測序Panel等常用于新生兒疾病的二階基因篩查與診斷，對于初篩陽性的樣本，在不召回新生兒前提下二次使用剩余的干血斑，能有效降低初篩假陽性率，同時能避免因二次采樣引發漏診的可能。

（二）特定新生兒疾病的靶向基因篩查

前面把靶向基因作為NGS中的一類，但下面多個疾病用的是一代測序（如SCID、X連鎖無丙種球蛋白血癥、脊髓性肌萎縮和脆性X染色體綜合征）。

SCID是原發性免疫缺陷（primary imm unodeficiency disease，PID）中最嚴重的疾病類型，T淋巴細胞在胸腺正常發育過程中，抗原受體編碼基因需進行DNA剪切并重組，切下來的DNA形成一種副產物，T細胞受體剪切環（TRECs），表達αβT細胞受體的T細胞中，70%在成熟晚期都產生Rec-Jα TREC，采用巢式-實時定量檢測新生兒干血斑中游離TRECs數量，可以反映外周血最新產生的T淋巴細胞數量，目前已廣泛應用于新生兒SCID篩查，TREC拷貝數減少或缺失，提示懷疑SCID。2008年，美國Wisconsin首次開展了SCID和其他T淋巴細胞減少癥的新生兒篩查試點項目，共篩查了207 696例新生兒，其中72例結果異常，經T淋巴細胞計數后發現33例異常樣本，陽性預測值為45.83%，特異度為99.98%，假陽性率為0.018%。最終確診了5例SCID/嚴重T淋巴細胞減少癥患兒，證實了該篩查方法的靈敏度和特異度均高。2010年，在一系列循證審查的基礎上SCID被納入全北美新生兒的推薦通用篩選計劃（Recommended Uniform Screening Panel，RUSP）。目前，SCID新生兒篩查已在美國各州廣泛開展。2010年，臺灣大學累計對106 391名新生兒進行了SCID篩查，發現5例結果顯示異常，其中2例確診為SCID，新生兒SCID發病率約為1：53 196。現英國、法國、西班牙和巴西等國也陸續開展SCID新生兒篩查的試點研究，我國內地尚未廣泛開展相關工作。

X連鎖無丙種球蛋白血癥（X-linked agammaglobulinemia，XLA）是一種原發性免疫缺陷，由BTK基因突變導致成熟的外周B淋巴細胞數量嚴重減少而引起。B淋巴細胞在正常發育過程中，抗原受體編碼基因需進行DNA剪切并重組，切下來的DNA形成一種副產物，即免疫球蛋白K刪除重組切除環（intronRSS-Kde recombination excision circles，KRECs），利用定量 PCR 檢測 KRECs可以反映最新產生的B淋巴細胞數量。2011年，Nakagawa團隊開展了檢測新生兒干血斑中KRECs對XLA和非XLA進行篩查的方法學研究，通過RT-PCR對30例XLA患者、5例非XLA患者，以及133例新生兒和138例不同年齡段的健康人群的干血斑中KRECs檢測，發現XLA和非XLA患者樣本中均檢測不到KRECs，證實測定干血斑中的KRECs可用于XLA和非XLA的大規模新生兒篩查。隨后，瑞典、西班牙、塞維利亞和伊朗等國相繼開展了XLA和SCID（KREC/TREC）聯合篩查試點研究。

脊髓性肌萎縮（spinal muscular atrophy，SMA）是一種常染色體隱性神經肌肉疾病，發病率約為1：（5 000～10 000）。約 95% 的 SMA 患者因 SMN1基因純合缺失引起。2016年12月基因治療藥物諾西那生鈉（Nusinersen）注射液獲FDA批準，2017年獲歐盟批準上市；2019年2月該藥品在中國獲批。應基因治療藥物的問世，2017年美國紐約開展了SMA新生兒篩查試點，該項目采用RT-PCR技術檢測新生兒干血斑中SMN1基因7號外顯子的拷貝數。共招募3 826例新生兒受試者，結果顯示SMA突變總體攜帶率為1.5%，檢出1例SMN1基因7號外顯子純合缺失患兒，該患兒隨后被納入NURTURE臨床試驗項目，并在15日齡時接受了諾西那生鈉治療，1周歲時未發現任何呼吸問題。此項研究初步證明了SMA新生兒篩查的可行性，并建議將SMA納入新生兒篩查病種。2018年，SMA被美國RUSP納入首要篩查病種。目前美國已有6個州開展SMA新生兒篩查。同年，我國臺灣省也發表了SMA篩查研究結果，采用RT-PCR技術對120 267例新生兒進行初篩，發現15例陽性，再采用數字PCR（ddPCR）進行復查，最終確診7例SMA患兒，證實通過早期篩查可以在癥狀產生前發現SMA患者，有利于早期進行治療干預。2019年，Kariyawasam等報道了澳大利亞SMA新生兒篩查項目的實施情況，共計篩查103 903例新生兒，10例陽性，最終確診9例患兒，4/9（44%）新生兒在出生后4周內出現SMA相關臨床癥狀，新生兒SMA篩查在支持父母早期決策，促進個性化治療方案實施等方面，展現出重要的臨床應用價值。

脆性X染色體綜合征（fragile X syndrome，FXS）是最常見的單基因引起的遺傳性智力低下綜合征，其發病機制是由于X染色體上FMR1基因5'端非翻譯區三核苷酸重復序列（CGG）n動態突變引起。FXS篩查可以應用PCR技術擴增FMR1基因的啟動子區域，檢測（CGG）n的重復數來鑒別患者及攜帶者。自1995年起，加拿大、美國和西班牙等多個國家和地區開展了FXS新生兒篩查的方法學及篩查研究。2012年，美國發表了對14 207例新生兒（7 312例男性和6 895例女性）的篩查報告，結果顯示灰區［54 ＞（CGG）n＞ 45］攜帶率，男性為 1/112，女性 1/66；前突變［200 ＞（CGG）n ＞ 54］攜帶率男性為1/430，女性1/209；發現 1例男性全突變［（CGG）n ＞ 200］，證實FXS新生兒篩查技術上的可行性，同時表明美國地區前突變攜帶率較高。雖然對FXS進行篩查在技術上是可行的，但因FXS無有效的治療方法，是否對FXS展開新生兒篩查還存在爭議。此外，FMR1基因前突變對新生兒影響具有不確定性，且前突變攜帶者較為普遍，對篩查出前突變的家庭進行遺傳咨詢帶來較大負擔。

先天性耳聾通過傳統的新生兒聽力篩查，無法發現遲發性和藥物性耳聾，而其中部分是由于遺傳因素導致的。2006年，Morton等首次提出對少數遺傳性耳聾相關基因（GJB2、SLC26A4和MT-RNR1基因）進行篩查有利于提高對遲發性語前耳聾的檢出。2007年，我國一項多中心（11個省12家醫院）新生兒遺傳性耳聾基因篩查研究，共14 913例新生兒在接受常規聽力篩查，同時針對mtDNA12S rRNA、GJB2和SLC26A4基因進行了基因篩查。結果顯示306例新生兒攜帶1個或2個基因突變，總體攜帶率為2.05%。其中7例攜帶GJB2或SLC26A4基因的純合或復合雜合變異；18例攜帶12S rRNA基因致病突變。隨后，我國臺灣、成都、北京、天津和廣東等省市也開始遺傳性耳聾基因篩查項目。截至2018年底，全國接受遺傳性耳聾基因篩查的新生兒數量超過320萬，檢出總突變率為4.4%，其中藥物致聾基因攜帶者約8 400人，避免了受檢者和家庭成員約80 000多人因使用藥物不當而致病。

（三）基于NGS技術的WES/WGS新生兒基因篩查的探索

2013年美國國立衛生研究院（National Institutes of Health，NIH）和美國國立人類基因組研究所（National Human Genome Research Institute，NHGRI）投入2 500萬美元共同資助了4個研究團隊，探索基因組測序在新生兒疾病篩查中的應用及影響，包括：①對個體和公眾健康的影響；②對醫生和家長態度的影響；③對公共衛生系統支出的影響。其中3個項目采用WES技術（BabySeq/NBSeq/NC NEXUS），1個為 WGS 技術（STATseq）。

BabySeq項目入選標準：①出生在波士頓婦女醫院（BWH）且入住健康嬰兒室（WNN）的新生兒或轉入波士頓兒童醫院和婦女醫院（BCH/BWH）新生兒重癥加護病房（neonatal intensive care unit，NICU）的新生兒；②至少有一個生物學父母進行遺傳咨詢、提供DNA、簽署新生兒檢測同意書。排除標準：①父母不會講英語；②父母不愿意將基因報告寫入醫療記錄或發送給他們的初級保健醫生；③母親或父親年齡 ＜ 18歲；④母親或父親不具備決策能力；⑤新生兒日齡超過42天；⑥多胎妊娠；⑦臨床考慮不適合抽取1ml血液的任何新生兒；⑧在受試招募前已做過臨床外顯子檢測；⑨缺少生物學父母（如知道）或養父母（如果合適）的知情同意。開始接洽了3 860個家庭，其中3 424個來自健康新生兒家庭（WBN），436個來自NICU患兒家庭，總入組率為6.9%［WBN隊列為6.5%（n=223），NICU患兒隊列為10.3%（n=45）］；拒絕入組的原因中，對此研究不感興趣家庭竟占了58%。該項目納入了127例健康新生兒和32例NICU患兒，對1 514個基因進行了測序，NGS顯示15/159（9.4%）新生兒有兒童期發病的風險（包括10例健康新生兒和5例NICU患兒），健康新生兒測序組中還發現一個成人期發病的BRAC2基因突變。NICU患兒測序組中發現2個成人期發病基因突變，分別為BRAC2和導致Lynch綜合征的MSH2基因。140例（88%）新生兒至少攜帶一個兒童期發病的隱性致病突變，8/159（5%）新生兒檢測到藥物基因組學突變，表明NGS能有效預測患病風險和攜帶者，且目前已有的新生兒篩查則無法進行預測。所有入組的新生兒均會收到新生兒基因測序報告（neonatal gene sequencing report，NGSR），該 報 告包含與兒童期疾病和可能與兒科藥物基因組學相關的風險和攜帶者情況。此外，患病的新生兒會進行基于適應證的分析，該分析包含所有導致新生兒疾病的基因變異，并可以選擇是否查詢與嬰兒護理相關的藥物基因組學變異。制定報告標準的目的是最大程度地提高收益和減少低外顯率、遲發性，以及證據不足等帶來的不確定性。

NGSR基因報告標準：①兒童期疾病風險（＜ 18歲發病），有充分的證據表明該基因會導致高外顯率的兒童期疾?。虎谠趦和瘯r期進行干預可能避免后續重大疾病發生相關的具有中等證據或中等外顯率的基因，此類致病變異報告帶來的收益可能會超過其帶來的不確定性；③與兒科藥物基因組強關聯的基因（Pharm GKB數據庫中class 1和2A基因），包括與惡性高熱相關的RYR1、硫嘌呤毒性相關的TPMT，以及與溶血性貧血相關的G6PD；④符合以上標準的基因攜帶者情況；⑤只報告致病和疑似致病的變異。

NGSR包含的三類基因：A類，對兒童期發病的疾病具有很高的預測價值的基因，包含884（58%）基因-疾病對；B類，具有中度證據和/或外顯率的基因，兒童期無創干預可防止破壞性結果；或成人期發病，但兒童期的無創干預可能顯著改善臨床結果，包含70（4.6%）基因-疾病對；C類，缺乏導致疾病的證據，具有低/中度外顯率或與成人發病條件有關，沒有證據表明兒童期非侵入性治療起作用，但與患者的癥狀相關。BabySeq項目研究存在局限性，是一小隊列研究、樣本少，另外先證者外顯子可能遺漏新發突變。

NBSeq項目則通過對1 570例新生兒干血濾紙片樣本基因測序與MS/MS結果比較，評估外顯子測序在新生兒干血濾紙片篩查中的應用潛力，探索其是否可以提升或替代目前的MS/MS篩查技術的可行性。結果顯示基因檢測作為二階篩查或補充篩查方法，可降低MS/MS篩查假陽性率，從而提高篩查的特異度，同時輔助非特異性生化指標可鑒別診斷。

NC NEXUS項目探索能否擴大WES在新生兒篩查中的應用，設計和評估基于NGS的新生兒篩查分析框架，明確相關倫理、法律和社會影響等，當患兒家庭需要做出決定時，對他們想要了解的WES相關信息進行分類，開發輔助決策系統幫助臨床醫生和家長在復雜檢測結果中做出合理決定。

STATseq項目對NICU住院患兒隨機分組，一組為新生兒篩查的標準化檢測途徑，一組為快速WGS+標準化檢測，比較兩組在疾病診斷率、診斷時間、評估發病率和死亡率、醫生和家屬的受益情況等。共42例患兒進行快速WGS檢測，診斷率明顯高于對照組（43% vs. 10%）；臨床受益率也高于對照組（31% vs. 2%）。對于NICU住院患兒，快速WGS可作為一階檢測，但該技術在臨床的適用性需要進一步明確。

英國也已開始將WGS應用于新生兒疾病篩查的試點研究。2019年7月，Genetic Alliance UK發布了一份報告，推薦盡快試行新生兒的WGS篩查新生兒疾病，并就試行項目可能遇到的問題和挑戰進行了分析和討論。同年11月5日，英國衛生部部長宣布英國國家衛生部計劃從20 000例兒童的基因測序試點研究開始，將對每個在英國出生的新生兒進行基因測序，以檢測新生兒的遺傳病風險并提供可預測的個體化的護理。

復旦大學附屬兒科醫院周文浩團隊、浙江大學附屬兒童醫院趙正言團隊等，在早期使用醫學外顯子檢測方案，聚焦NICU住院患兒的疑似遺傳病快速診斷、建立新生兒遺傳病基因檢測標準、新生兒IMD的二階篩查、遺傳咨詢培訓、應用Panel、WES甚至WGS在新生兒疾病基因篩查等方面，進行了大量的探索。

四、新生兒基因篩查的挑戰

通過基因測序來進行新生兒疾病篩查，也面臨著很多挑戰。隨著越來越多遺傳病治療方法和新藥的出現，符合新生兒篩查原則的病種越來越多，在這些疾病中，基于酶學、代謝物等篩查技術已無法滿足更多的篩查需求，很多疾病都無法用傳統的篩查技術來鑒別，故基因測序技術特別是NGS技術的篩查方法，將成為一種重要的補充。全球基因組學與健康聯盟（Global Alliance for Genomics and Health，GA4GH）是由400多家醫療保健、研究、疾病宣傳、生命科學和信息技術機構組成的國際合作機構，期望通過共享基因組和臨床數據共同促進人類健康，他們就基因組技術用于基于人群的新生兒篩查提出了八項建議，并在此職權范圍內，成立了全球聯盟監管和道德工作組的兒科工作組，以解決與兒童健康特別相關的問題?，F歸納為以下七點。

1.每個嬰兒都有平等獲得篩查的機會。通過任何方法進行的新生兒篩查，包括基因組檢測，如果作為公共衛生計劃采用，在該管轄區內出生的每個嬰兒都應該平等獲得檢測的機會。

2.設立公共數據庫，新生兒基因篩查結果的解釋基于對每個測試基因的良性變異及致病變異的了解。需要在一個可自由訪問的數據庫（同時適當保護個體嬰兒及其家人隱私）中公布該計劃中包含的每個基因的特定人群等位基因頻率、每個等位基因的致病性評價，以及支持致病性解釋的證據。

3.僅限新生兒期診斷并在兒童期有效治療或干預的疾病。

4.依據新生兒篩查完整體系管理，包括確診檢測、治療干預、臨床隨訪、遺傳咨詢、質量保證、公共和專業教育及行政監管體系。

5.通過新一代測序或其他基因組方法進行的新生兒篩查，應僅被視為當前一級篩查計劃的補充。

6.不應替代現行所篩病種的篩查方法。目前新生兒篩查的任何疾病不應該用NGS或其他基因組方法取代，除非基因組技術已被證明對疾病具有相同或更好的靈敏度和特異度。遺傳異質性和復雜性使基因檢測不可能像當前篩選方法一樣靈敏或特異，即使是遺傳異質性和復雜性較少的疾病，基因組檢測也不是基于人群的新生兒篩查的最有效方法。

7.謹慎進行政策和倫理評價（基因組和Panel）。需進行研究以證明基因組、Panel測序的臨床效用和成本效益，并在新生兒基因篩查實施之前解決突出的健康政策和倫理問題。新生兒基因組篩查必須避免損害當前篩查計劃的有效性和無意傷害兒童及其家人，各個國家和地區在倫理層面須達成政策共識，如基因組臨床意義不明（variant of undetermined significance，VUS）和家庭意外發現的披露，數據的所有權，以及數據的存儲和共享等。醫療機構應對新生兒家長進行檢測前知情告知。

關鍵問題是如何改進對基因組數據的解釋，以便能夠有效識別篩查的每個致病基因和良性變異，如何處理與成人發病相關的攜帶者狀態變異，NGS存在無法檢出結構變異和三核苷酸重復，以及檢出臨床意義不明等情況，對于臨床意義未明突變，結果解釋的不確定性對實驗室和臨床醫生均存在一定的法律風險，檢測前和檢測后對醫生的遺傳咨詢能力和報告解讀能力有很高的要求。在篩查陽性患兒中，由于遺傳咨詢的關聯性，使具有血緣關系的相關人的隱私也牽連其中，需對親屬信息嚴格保密，避免隱私權相關的倫理問題；基因組范圍測序產生大量個人信息，需避免數據存儲及隱私性相關問題的泄露。另外，在基因篩查過程中對攜帶者的發現如何報告還存在爭議。在實驗技術層面，需提前明確基因測序應用在疾病篩查中的局限性，做好風險預估，制訂相應的解決措施。

總之，新生兒疾病基因篩查的探索還在路上，且面臨著很多挑戰，但已為兒童疾病的預防、診斷、治療、康復展現了良好前景。

（趙正言）