第三節(jié)　神經(jīng)遺傳病的基因診斷

神經(jīng)系統(tǒng)正常功能的發(fā)揮依賴于細(xì)胞內(nèi)成千上萬(wàn)種基因及其產(chǎn)物的精確表達(dá)與調(diào)控。基因水平變異、基因組水平變異、染色體水平變異等均能導(dǎo)致不同類(lèi)型的神經(jīng)遺傳病。神經(jīng)遺傳病的臨床表現(xiàn)多樣且十分復(fù)雜，最終確診往往依賴于基因診斷。

根據(jù)神經(jīng)遺傳病致病基因或致病突變是否明確可將基因診斷分為間接基因診斷和直接基因診斷。

間接基因診斷：在致病基因未知或致病基因已知但其突變未知時(shí)，通過(guò)對(duì)患者及其家系成員進(jìn)行連鎖分析（linkage analysis）或單倍型分析（haplotype analysis），推斷受檢者是否帶有致病基因或突變的診斷方法。

直接基因診斷：對(duì)受檢者直接進(jìn)行染色體、已知致病基因或候選基因的序列及結(jié)構(gòu)進(jìn)行突變檢測(cè)的診斷方法。

基因診斷可分為細(xì)胞水平診斷和分子水平診斷。細(xì)胞水平診斷指基于細(xì)胞遺傳學(xué)的染色體核型分析（chromosome karyo-type analysis）和熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）等技術(shù)，主要用于神經(jīng)系統(tǒng)染色體病或基因組病的基因診斷。分子水平診斷指基于分子遺傳學(xué)的連鎖分析、單倍型分析、分子雜交、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）及其衍生技術(shù)、基因芯片及新一代測(cè)序技術(shù)等，主要用于神經(jīng)系統(tǒng)單基因病、基因組病或染色體病的基因診斷。

（一）神經(jīng)系統(tǒng)染色體病或基因組病的基因診斷

染色體病是由染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)異常所致的疾病，往往涉及基因組較大范圍片段，可影響多個(gè)基因的表達(dá)，其臨床表現(xiàn)復(fù)雜；神經(jīng)系統(tǒng)染色體病則往往表現(xiàn)為發(fā)育異常、智力發(fā)育障礙及癲癇等。傳統(tǒng)的染色體病診斷方法主要基于細(xì)胞遺傳學(xué)，包括染色體核型分析、熒光原位雜交（FISH）等。染色體核型分析需結(jié)合特殊染色、光學(xué)顯微鏡識(shí)別和檢測(cè)大于5Mb的染色體片段結(jié)構(gòu)異常，主要用于檢測(cè)親代染色體平衡異位導(dǎo)致子代大范圍CNV產(chǎn)生的情況，是臨床上進(jìn)行產(chǎn)前診斷染色體異常的金標(biāo)準(zhǔn)，且具有準(zhǔn)確性高、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠等優(yōu)點(diǎn)。

染色體核型分析現(xiàn)在基本已經(jīng)被染色體微陣列分析（chromosomal microarray analysis，CMA）替代，如染色體陣列比較基因組雜交（array-based comparative genomic hybridization，array-CGH）技術(shù)和基于高密度單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）微陣列（SNP-array）芯片技術(shù)，這兩種方法被廣泛用于全基因組水平的CNV分析。相較于染色體核型分析，CMA具有更高的分辨率，不僅可以有效檢測(cè)常規(guī)核型分析的染色體不平衡變異，還可以檢測(cè)整個(gè)基因組的微缺失/微重復(fù)，適用于基因組病的基因診斷。

FISH方法是用熒光標(biāo)記的核酸探針與染色體進(jìn)行原位分子雜交，以鑒別待檢核酸片段在染色體上的相對(duì)位置或數(shù)目是否發(fā)生異常改變，優(yōu)點(diǎn)是可直接檢測(cè)未經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)本，可避免污染并縮短檢測(cè)時(shí)間，其衍生的多色熒光原位雜交技術(shù)不僅增加了可檢測(cè)染色體的范圍，并可識(shí)別染色體微小易位和多條染色體間復(fù)雜易位，同時(shí)可以確定標(biāo)記染色體的來(lái)源，主要用于產(chǎn)前診斷和發(fā)現(xiàn)染色體異常后的進(jìn)一步驗(yàn)證。

（二）神經(jīng)系統(tǒng)單基因病基因診斷

神經(jīng)系統(tǒng)單基因病通常由某個(gè)基因發(fā)生某種突變而致病，并在家族中以一定的方式遺傳。神經(jīng)系統(tǒng)疾病中有多種類(lèi)型單基因病，如遺傳性周?chē)窠?jīng)病、遺傳性肌病、遺傳性共濟(jì)失調(diào)、遺傳性癲癇及遺傳性運(yùn)動(dòng)障礙疾病等。這些疾病的基因突變方式多種多樣，包括SNV、indel、復(fù)雜重排突變（complex rearrangement）、CNV、STR等形式。根據(jù)疾病特點(diǎn)及基因突變形式選擇合理的基因診斷方法是神經(jīng)遺傳病專(zhuān)家需要考慮的問(wèn)題。

1.基于連鎖分析定位克隆致病基因

通過(guò)家系調(diào)查和系譜分析確定為神經(jīng)遺傳病，且致病基因未明或排除已知致病基因等前提下，應(yīng)用遺傳標(biāo)記進(jìn)行基因分型、連鎖分析或單倍型分析，以定位單基因病的致病基因，最后通過(guò)候選基因法鑒定致病基因及致病變異。第一代遺傳標(biāo)記為限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP），第二代遺傳標(biāo)記為微衛(wèi)星標(biāo)記，第三代遺傳標(biāo)記為單核苷酸多態(tài)性（SNP），以后兩種常用。目前已知的大部分單基因病的致病基因及部分多基因病的易感基因均通過(guò)這一策略獲得克隆。盡管這種方法耗時(shí)費(fèi)力，但它在過(guò)去的20余年中發(fā)揮了重要作用；隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，近年來(lái)基于SNP分型芯片的連鎖分析，結(jié)合NGS等技術(shù)，大大加快了神經(jīng)遺傳病致病基因的鑒定與克隆。

2.基于分子雜交技術(shù)進(jìn)行基因診斷

互補(bǔ)DNA單鏈能夠在一定條件下結(jié)合成雙鏈，即所謂的分子雜交。早期的基因診斷主要采用分子雜交技術(shù)，包括用于DNA變異分析的Southern印跡雜交（Southern blotting）技術(shù)，用于已知基因、已知突變檢測(cè)的等位基因特異的寡核苷酸雜交（allele-specific oligonucleotide，ASO）技術(shù)等。上文所述的FISH、array-CGH等技術(shù)也屬于分子雜交技術(shù)。

3.基于PCR相關(guān)技術(shù)進(jìn)行基因診斷

PCR技術(shù)是一種靈敏的分子診斷技術(shù)，主要用于基因已知序列的檢測(cè)。早期的PCR相關(guān)基因診斷方法包括PCR結(jié)合限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法、PCR結(jié)合單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析法等，主要用于檢測(cè)點(diǎn)突變，這些檢測(cè)方法在早期神經(jīng)遺傳病的基因診斷中發(fā)揮了重要的作用，但這些方法只能篩查有無(wú)突變，不能準(zhǔn)確獲知突變的具體堿基改變，且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，目前較少使用。

近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的PCR結(jié)合變性高效液相色譜（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）分析法及PCR結(jié)合毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）分析方法，雖然也不能準(zhǔn)確獲知突變的具體堿基改變，但其具有通量高、自動(dòng)化、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，適合大樣本的已知突變的篩查，使用更廣。而實(shí)時(shí)熒光定量PCR（realtime quantitative PCR，RT-PCR）、多重PCR（multiplex PCR）及多重連接探針擴(kuò)增（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）等是近些年發(fā)展起來(lái)的PCR衍生技術(shù)，是目前基于PCR相關(guān)技術(shù)的主流基因診斷方法。

（1）PCR結(jié)合變性高效液相色譜（PCR-DHPLC）技術(shù)：

通過(guò)在部分變性的溫度條件下，變異型和野生型PCR產(chǎn)物具有不同的分離柱保留時(shí)間識(shí)別變異，可進(jìn)行基因突變檢測(cè)及SNP分析等的研究，具有高通量、自動(dòng)化、靈敏度高、適用性廣及經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，適合大樣本已知突變的篩查；但其只能提供個(gè)體樣本有無(wú)突變信息，無(wú)法得出具體的突變類(lèi)型。

（2）PCR結(jié)合毛細(xì)管電泳（PCR-CE）技術(shù)：

PCR-CE是一類(lèi)新型液相分離技術(shù)，可簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)地鑒別不同片段PCR產(chǎn)物，是微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記、多核苷酸重復(fù)擴(kuò)展突變的檢測(cè)方法，在SCA相關(guān)亞型等的基因檢測(cè)中廣泛應(yīng)用。

（3）實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）技術(shù)：

利用熒光信號(hào)累積，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程并對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析的方法，具有特異性好、靈敏度高、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)。在神經(jīng)遺傳病基因診斷方面，既能在基因組水平鑒定或驗(yàn)證CNV，也能在RNA水平進(jìn)行基因表達(dá)差異分析。

（4）多重PCR技術(shù)：

在普通PCR的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，可擴(kuò)增多個(gè)目的片段的PCR技術(shù)，具有節(jié)省時(shí)間、降低成本、節(jié)省樣本及提高效率的優(yōu)點(diǎn)。多重PCR技術(shù)在脊髓性肌萎縮（spinal muscular atrophy，SMA）的SMN1基因突變、DMD/BMD的DMD基因突變等檢測(cè)中廣泛應(yīng)用。

（5）多重連接探針擴(kuò)增（MLPA）技術(shù)：

是近年發(fā)展起來(lái)的DNA相對(duì)定量技術(shù)，可同時(shí)檢測(cè)多種DNA或RNA拷貝數(shù)變化，具有操作簡(jiǎn)便、成本低廉、應(yīng)用領(lǐng)域廣等特點(diǎn)，在神經(jīng)遺傳病基因診斷中發(fā)揮重要作用。MLPA對(duì)CNV的檢測(cè)比多重PCR更可靠、快捷。

（6）重復(fù)引物PCR技術(shù)（repeat-primed PCR，RPPCR）：

也稱(chēng)為三引物PCR法，應(yīng)用三種特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)合熒光毛細(xì)管電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，適用于特殊、超大片段多核苷酸重復(fù)擴(kuò)展突變的檢測(cè)，如強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良（myotonic dystrophy，DM）、弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)（Friedreich ataxia，F(xiàn)RDA）等。

（7）富含GC片段PCR（GC-rich PCR）技術(shù)：

通過(guò)對(duì)傳統(tǒng)PCR的改進(jìn)，使富含GC的DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)效率提高。該技術(shù)在富含GC的多核苷酸重復(fù)片段擴(kuò)增中得到廣泛運(yùn)用，如神經(jīng)元核內(nèi)包涵體病（neuronal intranuclear inclusion disease，NIID）的NOTCH2NLC基因，額顳葉癡呆（frontotemporal dementia，F(xiàn)TD）或肌萎縮側(cè)索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）的C9orf72基因等。

（8）長(zhǎng)片段PCR（long range PCR，LR-PCR）技術(shù)：

是一種擴(kuò)增長(zhǎng)度能夠達(dá)到5kb以上的DNA片段的PCR，可用于大片段CNV的檢測(cè)等，在五核苷酸重復(fù)擴(kuò)增突變檢測(cè)中得到廣泛運(yùn)用，如家族性皮質(zhì)肌陣攣性震顫伴癲癇（familial cortical myoclonic tremor with epilepsy，F(xiàn)CMTE）的SAMD12基因等。

4.基于基因芯片技術(shù)進(jìn)行基因診斷

生物芯片是基于高密度的、固定在固相支持介質(zhì)上的生物信息分子（如寡核苷酸、gDNA片段、cDNA片段或多肽片段、蛋白質(zhì)）微陣列。基因芯片是生物芯片的一種，具有高通量、多樣化、自動(dòng)化、反應(yīng)微型化等特點(diǎn)，在基因突變檢測(cè)方面有廣闊的應(yīng)用前景。通過(guò)設(shè)計(jì)不同的探針陣列可以使該技術(shù)具有不同的應(yīng)用價(jià)值，如用于突變檢測(cè)的array-CGH、SNP-array和各種神經(jīng)遺傳病特異性基因芯片（基因panel）等，用于基因多態(tài)分析的SNP-array等，用于基因表達(dá)譜測(cè)定的表達(dá)譜芯片等。

5.基于測(cè)序技術(shù)的方法或策略進(jìn)行基因診斷

測(cè)序技術(shù)發(fā)展歷經(jīng)數(shù)代，最經(jīng)典的Sanger測(cè)序技術(shù)也稱(chēng)第一代測(cè)序技術(shù)，其準(zhǔn)確率最高，適合單個(gè)基因的檢測(cè)，而進(jìn)行多個(gè)基因甚至全基因組檢測(cè)時(shí)顯得費(fèi)時(shí)費(fèi)力且不經(jīng)濟(jì)。NGS采用大規(guī)模平行測(cè)序方法，具有通量高、速度快及單堿基測(cè)序成本低的優(yōu)勢(shì)，普遍用于臨床及研究領(lǐng)域，但也存在測(cè)序盲區(qū)及測(cè)序錯(cuò)誤等缺陷。TGS進(jìn)一步彌補(bǔ)了NGS的缺陷，已開(kāi)始用于神經(jīng)遺傳病的基因診斷。

（1）NGS：

基于NGS的方法主要有WES、TRS及WGS技術(shù)，它們各有特點(diǎn)，運(yùn)用時(shí)要有所選擇。

1）WES：

是通過(guò)對(duì)個(gè)體基因組的全部編碼基因外顯子進(jìn)行序列測(cè)定，尋找影響編碼蛋白功能變異位點(diǎn)的高通量測(cè)序技術(shù)。WES具有高效、高通量等優(yōu)點(diǎn)，適用于單基因病致病變異鑒定的第一步篩查，如SNV或indel。

2）TRS：

在深度測(cè)序基礎(chǔ)上，準(zhǔn)確篩查目標(biāo)基因組區(qū)間的SNV及indel等變異形式，根據(jù)測(cè)序覆蓋深度等差異來(lái)判斷外顯子重排變異（exon rearrangement variant，ERV）。通過(guò)定制捕獲芯片，對(duì)目標(biāo)基因組區(qū)間進(jìn)行超高深度測(cè)序，可以對(duì)某一致病基因定位區(qū)間內(nèi)編碼基因、某一高度遺傳異質(zhì)性疾病已知致病基因或某一表型相關(guān)致病基因，形成基因panel進(jìn)行大范圍檢測(cè)。

3）WGS：

WGS不僅包含基因組編碼序列，還補(bǔ)充了UTR區(qū)、內(nèi)含子區(qū)及基因間區(qū)的非編碼序列，可更全面地對(duì)遺傳變異進(jìn)行檢測(cè)。WGS不僅可以檢出SNV及indel等變異形式，還能檢出ERV、CNV變異形式。因此，WGS對(duì)變異的檢出率高于WES，可以檢測(cè)出WES遺漏的致病變異，提高了基因診斷率。

（2）TGS：

TGS彌補(bǔ)了二代測(cè)序的主要缺陷，即存在DNA重復(fù)元件（repetitive element）、SV等測(cè)序盲區(qū)及文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程因PCR引入的潛在測(cè)序錯(cuò)誤等。TGS對(duì)檢測(cè)重復(fù)序列或復(fù)雜SV具有明顯優(yōu)勢(shì)。TGS用于臨床基因診斷還需要精準(zhǔn)質(zhì)量、降低成本。

（唐北沙　曾　勝）