1.2　生物光子學簡介

生物光子學（Biophotonics）是由光學（特別是激光科學）和生命科學交叉形成的新興前沿學科。對于這個交叉學科，很難精確地界定其研究范圍。在內涵上，生物光子學包括生物中和光相關的研究，以及光學中和生物相關的研究。例如，光學已經在細胞生物學、分子生物學、組織生物學、神經科學、基因工程、干細胞研究、癌癥科學、蛋白質組學，乃至大量的病理科學、重大疾病研究與治療、臨床診斷、再生科學以及特殊醫療器械等領域中快速發展和廣泛應用。因此，人們也習慣把生物光子學稱為生物醫學光子學。而在外延上，由于生物光子學在大量研究中已經達到了單分子和單光子水平，它已經廣泛地與納米科學、材料科學、量子信息科學等相關領域緊密結合，出現了進一步的學科交叉。一個較為有趣的現象充分說明了生物光子學的交叉性和多樣性，那就是世界上的生物光子學實驗室會設立在高校的各類院系中，如物理（物理光學與生命科學交叉）、生命科學（生物學與光學交叉）、生物醫學工程（生物學與光學工程交叉）、電子工程（光電子科學與技術）、材料、化學、物理化學等院系。同樣，與生物光子學相關的科學論文也廣泛分布于以上各領域的學術期刊中。

正如很難界定生物光子學的研究范圍，我們也同樣無法精確地以某個標志性事件作為其發展的起點。如前所述，不少科學家以顯微鏡的出現作為生物光子學誕生的象征，主要因為顯微成像是第一種與生命科學結合非常深入的技術。然而，在激光技術出現之前，顯微鏡作為一種生物研究的基本工具，一直沒有實質上的技術進步。此時的“生物光子學”僅僅是生物領域的一個附屬技術方面或光學研究的技術應用，遠未達到獨立學科的程度。類似地，將采用光合作用的研究作為生物光子學發展的起點同樣不合適。光合作用更多的是一種光化學過程，參與其中的光子除了提供能量，并不具備光學的其他特性。

隨著分子特異性熒光標記概念的提出和應用，相關生物學領域得到了前所未有的發展，并從根本上促進了整個生命科學的進步。在此之前，透射型顯微鏡基本上只能獲得生物樣本的結構信息。即使通過對照明和傳導部分的改進，人們研究出了相襯（Phase Contrast）成像、微分干涉對比（Differential Interference Contrast）成像、暗場（Dark Field）顯微鏡成像等成像方法（其中相襯成像和偏光顯微鏡成像如圖1.11所示），也僅僅只能提高成像的反襯度等參數，而不能給顯微成像提供更多的信息。因此，對于折射率幾乎均勻、非常透明的細胞而言，這些成像方法很難帶來實質性的進展。與之相對的，特異性分子熒光標記，使人們可以直接在活體條件下觀測亞細胞的精細結構以及細胞內的特異性分子等，這為相關的生物學發展提供了前所未有的重要工具。

生物熒光激發和觀測在客觀上要求有更好的激發光和檢測手段，也使得激光的眾多可控特性獲得了充分應用。激光技術的出現將熒光顯微領域推向了巔峰，激光共聚焦掃描顯微鏡就是其中的代表，它使人們首次在三維空間尺度上直接觀測到分辨率達到光學衍射極限的特異性標記的熒光圖像，由此進一步衍生出了各種熒光激發、轉換和測量技術，使得細胞和分子生物學緊密地與激光技術聯系起來，大大促進了這些領域的研究。其中，全內反射熒光（Total Internal Reflection Fluorescence，TIRF）成像、熒光壽命成像（Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy，FLIM）、熒光共振能量轉移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）成像、熒光自相關光譜（Fluorescence Correlation Spectroscopy，FCS）測量等，都在特異性分子之外提供了更多的分子的時間、空間信息，人類對于生命現象、結構和過程的理解首次達到了亞細胞和分子級別。TIRF成像和FRET成像如圖1.12所示。值得注意的是，熒光成像檢測方法也大量地進入了基因組學和蛋白組學中，為分子生物學和生物醫學分子檢測的發展提供了極其重要的關鍵技術。這些發展也使得人們逐步對激光與生物學的交叉問題重視起來，并有一批科學家從各個領域轉入到這個交叉領域進行更加專門和深入的研究。顯微成像技術在近30年內，一直是生物光子學領域最核心、最前沿、最主流的方向，也是取得進展最多、在生命科學中影響最大的方向。

光子的粒子性為激光在生物中的應用提供了新的方向。光鑷技術的出現，使得生物光子學進入了爆炸式的發展階段，是生物光子學成為一門獨立學科的里程碑。不同于過去依附于生物研究的工具，光鑷更多的是一種不同于以往的全新的研究思路和研究切入點，從而使得生物光子學發展為一門真正的獨立學科成為可能。光鑷技術充分體現了激光的粒子性和空間精度的特性。由于光鑷的強度與聚焦程度相關，人們由此轉而研究光束的緊致聚焦特性，而這正是大部分生物光子學研究的實驗基礎。由于長時間的關注，人們大大加深了對細胞光損傷的理解，并開始重視一系列生命細胞對光的應激反應，從而更加深入地探討光子在生命系統中的傳播、吸收、熒光轉換等基礎問題，這為今后生物光子學的全面發展打下了理論和實驗基礎。

緊致聚焦的激光帶來了超高的光子密度，讓聚焦的局域空間的電場強度達到了非常高的量級，這會使焦點內物質的分子結構被破壞。因此，人們嘗試用激光取代傳統的物理手術刀，讓它成為一種潔凈、精密、無接觸無侵入的對細胞進行操控的“手”。隨著激光輸出波長向紫外波段的拓展以及調Q脈沖激光器的出現，人們開始嘗試用激光對細胞做精密的手術。例如，對兩個細胞做融合，在細胞膜上鉆孔，甚至直接在細胞內部切斷一個染色體。在傳統的機械手術刀時代，這種精度的手術是無法想象的。調Q形成的納秒級的脈沖也讓生物樣本中的非線性過程成為可能。盡管當時這些嘗試都不太成功，大量生物樣本往往由于受到過多的激光損傷而死亡或失活，但這些早期技術探索也為后續的研究奠定了重要的前期基礎。

光鑷概念的引入很快就在技術上發展到了極限。隨著飛秒激光技術的出現和成熟，超高的飛秒脈沖的峰值功率帶來了高效的非線性，使得生物光子學出現了又一次突破。在20世紀90年代初，人們已經開始將飛秒激光的非線性過程用于細胞成像的熒光激發。一系列的非線性成像技術很快在細胞和組織中得到了廣泛的應用。由于飛秒脈沖優異的時域特性，它在組織中具備了比連續光或長脈沖好得多的傳播優勢。所以，組織中的熒光非線性成像隨著飛秒激光技術的發展而取得了很多重要的成果，特別是表征生物樣本內部分子信息的譜線探測技術，在生物分子信息、癌癥以及重大疾病的檢測上得到了非常好的發展和應用。

進入21世紀，越來越多的物理概念和思想被引入到生物研究中。例如，傳統的流式細胞儀結合散射和熒光譜線探測等技術，可以同時檢測多種生物信息。通過激光在電介質表面形成的等離子體對光相位的影響，可以測量到生物分子對介質折射率的微小改變。這些研究又進一步與納米科學和材料科學相結合，促進了生物傳感的飛速發展。而在相關生物醫學應用方面，基于激光激發的光動力治療技術，逐漸在臨床上做出了相應的嘗試，并在某些疾病的治療上取得了不錯的結果。在人的組織水平上，利用激光相干性探測組織結構的光學相干斷層掃描（Optical Coherent Tomography，OCT）技術也迅速地在臨床應用方面發展。角膜的OCT成像如圖1.13所示。

近年來生物光子學領域最重大、最引人矚目的成果，則是一系列超分辨率成像技術，包括隨機光學重建顯微（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，STORM）技術、光激活定位顯微（Photoactivated Localization Microscopy，PALM）技術、受激發射損耗（Stimulated Emission Depletion，STED）顯微技術。通過特殊的熒光轉換蛋白或熒光分子，巧妙地把空間問題轉換為時間問題，遠場熒光顯微鏡的分辨率已突破衍射極限，達到并突破了10 nm的量級。此外，利用激光受激輻射的概念和飛秒激光精密的時域特性，科學家們用純光學的手段也獲得了10 nm量級的成像分辨率。這一系列成像技術的突破，給細胞分子生物學和神經科學的研究帶來了許多重要的結果。圖1.14所示為整個動物細胞中線粒體的3D STORM成像。

與成像對應，利用飛秒激光對細胞的精確手術和離子調控也在近年取得了很多重大的突破。飛秒激光的長脈沖間隔和波長對于生物樣本較為安全，可以對生物樣本進行較長時間的照射，因此具有衍射極限精度的精密細胞手術在轉基因、細胞生理過程和骨架的研究，以及細胞融合、神經組織再生、分子信號調控等眾多領域都取得了很好的進展。

目前，生物光子學處于史無前例的高速發展時期。美國、歐盟、日本正在進行的腦計劃，其中生物光子學（特別是光學顯微成像技術）都是關鍵部分。此外，美國在熒光蛋白的熒光轉換、激光誘導神經再生、激光控制基因表達等領域取得了NSF和軍方的5~10年期的重點資助。德國、英國、俄羅斯等國家也紛紛加大了對生物光子學領域研究的投入。我國近年來在生物光子學領域的支持也顯著增強，無論是大科學的腦計劃，還是生物光子學的關鍵技術，例如各種新型的生物光子學成像方法、面向醫學應用的多模態成像等，都獲得了國家一系列的重大支持。可以想象，在現在以及不久的將來，生物光子學將會進一步高速發展，取得更多、更重要的成果，為探索生命科學的奧秘做出重要的貢獻。