第五節　卵母細胞成熟與調控

哺乳動物的卵母細胞成熟包括核成熟和細胞質成熟，核成熟的標志是生發泡破裂（germinal vesicle break down，GVBD）、同源染色體分離、第一極體排出到卵周間隙。細胞質成熟是指卵細胞質發生的一系列變化，包括蛋白質合成、細胞器重排、微絲微管合成等，細胞質成熟對卵母細胞的受精和早期胚胎發育至關重要。體內成熟的卵母細胞核與質成熟大多是同步的，而體外成熟卵母細胞的最大缺陷是細胞質成熟落后于核成熟。細胞質不成熟會導致卵母細胞受精，胚胎發育及產生健康嬰兒的能力下降，具體的分子機制和生理生化過程知之甚少。

相關研究提示：卵母細胞成熟的調控不是一個單純的級鏈式作用，而是一個非常復雜的多因子調節過程。既往的研究關注的主要是下丘腦-垂體-卵巢軸對卵母細胞的內分泌調節，最近的研究發現卵巢內部的旁分泌（paracrine）和細胞間通訊調節（cell to cell communication）對于卵母細胞的成熟有非常重要的作用。

一、卵母細胞核成熟

從始基卵泡形成時，卵母細胞的細胞核就停滯在減數第一次分裂的雙線期，直至發育到成熟前才恢復，但從始基卵泡激活啟動發育開始，卵母細胞本身的生長就一直在進行著，體積不斷增大，胞內物質不斷積累，為最終的成熟做準備。研究發現，當優勢卵泡發育到大的有腔卵泡，并且其中的卵母細胞體積達到成熟時的80%時，才具有獲得減數分裂的能力。在成熟前，卵母細胞合成大量減數分裂有關的分子，并長期以無活性的形式存在。

（一）核成熟的過程

卵母細胞核的成熟在形態學上主要表現為GVBD和第一極體的排出。發育早期，停留在雙線期的卵母細胞中就已經形成了生殖泡，其以體積大和缺乏異染色質為特征。隨著卵母細胞的發育，生殖泡的直徑逐漸增大，其中的核仁大而明顯。在LH峰之前先到來的FSH峰會促使生殖泡中的染色質開始在核仁周圍凝集，并靠近核膜。核膜呈波浪形，表面有許多核孔，用以細胞核與細胞質之間物質和信息的交流。卵母細胞發育過程中核膜上的褶皺逐漸增多。隨著LH峰的到來，核仁消失，核膜解體并融入內質網系統，生殖泡在細胞骨架系統的牽引下向卵母細胞皮質區遷移。在染色質凝集完成20~24小時之后，GVBD發生，形成二價染色體，減數第一次分裂（MⅠ）恢復并從前中期開始。需要強調的是，GVBD的發生雖然依賴于卵母細胞的生長發育，但發生GVBD的卵母細胞并不一定都可以完成減數分裂而成熟。故GVBD只是標志著卵母細胞具有成熟的能力以及減數分裂的開始。

卵母細胞中沒有中心粒，在GVBD發生后，凝集的染色體上的著絲粒與微管蛋白相連，后者牽引染色體排列在赤道板上，并共同形成紡錘體（spindle）。隨后，紡錘體在肌動蛋白、微絲的共同作用下，遷移至卵母細胞表面動物極質膜下，此階段為MⅠ的中期，可維持數小時。之后同源染色體分離，分別進入兩部分細胞質，在LH峰或外源性補充HCG后約36小時，排出第一極體并形成次級卵母細胞。次級卵母細胞不經過DNA復制，直接進入減數第二次分裂（MⅡ），最終停滯在MⅡ中期等待受精。至此，卵母細胞核已經成熟，第一極體的排出為核成熟的標志。這個過程中，卵母細胞的細胞質分裂極不均等，使次級卵母細胞與第一極體在體積上有顯著差別，但兩者帶有等量的染色體。此外，第一極體還含有較多的細胞器，包括線粒體、核糖體等。

（二）核成熟的調節

卵母細胞的成熟過程涉及包括促性腺激素在內的多種因子的調控。當增長到一定程度時，可在LH或HCG的刺激下啟動成熟。前已述及，卵母細胞核成熟的重要事件為減數分裂的恢復，因而對減數分裂停滯與恢復的調控成為核成熟的關鍵。

1.MⅠ停滯

生理現象表明，發育到一定程度的卵母細胞最終是在LH或HCG的刺激下啟動成熟，恢復減數分裂。而實驗發現，當卵母細胞脫離卵泡環境之后，沒有LH的刺激也可以自發恢復減數分裂。但在體外培養整個卵泡或者利用卵泡液培養裸卵，卵母細胞的減數分裂不能自發恢復，另外，體外環境下共培養裸卵和顆粒細胞也不能自發成熟。這些研究表明，卵母細胞本身具有自發成熟的能力，而卵泡中的體細胞可通過與卵母細胞的相互作用或向卵泡液中分泌某些物質而抑制其減數分裂的恢復。目前認為相關的抑制因子包括卵母細胞成熟抑制因子（oocyte maturation inhibitor，OMI）、環磷酸腺苷（cAMP）、環磷酸鳥苷（cGMP）、次黃嘌呤，以及其他可以提高卵母細胞中cAMP的物質。

2.cAMP

目前研究較清楚的是cAMP，實驗發現，向培養液中加入cAMP類似物、cAMP激活劑、磷酸二酯酶抑制劑等增強cAMP含量或效應的物質，均可阻止體外培養的裸卵的減數分裂的恢復。卵母細胞中的cAMP一部分由卵泡中體細胞產生通過縫隙連接運輸到卵母細胞中，此外，顆粒細胞的代謝產物可以影響卵母細胞自身合成cAMP。有研究認為，cAMP對卵母細胞的成熟具有抑制和促進的雙重作用，即cAMP的持續升高及維持在高濃度可以抑制減數分裂的恢復，促使細胞停滯在MⅠ期，而cAMP短暫升高可促進其減數分裂的開始，然而后一種說法并沒有得到更多的實驗證實。卵母細胞中，高濃度的cAMP主要是通過抑制卵母細胞中的成熟促進因子（maturation promoting factor，MPF）的活性來阻止減數分裂的恢復。MPF已被證明是由細胞周期依賴性激酶1（cyclin-dependent kinase 1，CDK1）和周期蛋白B（cyclin B，CYB）組成的蛋白復合物，其中CDK1為催化亞基，CYB為調節亞基。在LH峰之前，卵母細胞內高濃度的cAMP可以激活磷酸激酶A（PKA）信號通路，后者可以間接使CDK1上的第14位蘇氨酸（Thr14）及第15位酪氨酸（Tyr15）殘基磷酸化而導致MPF失活。除了維持減數分裂停滯之外，也有文獻報道，在成熟之前，卵母細胞中適量的cAMP可以調節卵母細胞中成熟相關蛋白的轉錄，以及防止染色質過快過度地凝集。

cAMP的含量主要由腺苷酸環化酶（adenylate cyclase，AC）及磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE）調控，AC以ATP為底物催化生成cAMP，而PDE則可將其降解。研究認為成熟前卵母細胞中高濃度cAMP的維持主要是通過卵母細胞與周圍卵丘細胞等的相互作用，從而改變AC和PDE的活性而實現的。卵母細胞表面存在3型或12型G蛋白偶聯受體（G protein coupled receptor，GPR），可以接受來自顆粒細胞的信息，激活下游的Gs蛋白（激活型G蛋白），后者活化細胞中AC生成大量cAMP，這是卵母細胞中高濃度cAMP的主要來源。而卵丘細胞中的AC也可以在FSH的作用下活化，生成cAMP，后者也可通過細胞間的縫隙連接被轉運至卵母細胞中，稱為卵母細胞cAMP的另一個來源。細胞內的磷酸二酯酶（PDE）是一種可由cGMP抑制的cAMP水解酶。PDE有多種亞型，研究證明PDE3A是卵母細胞中所特有的，其在促性腺激素誘導的減數分裂恢復過程中有重要作用，卵泡體細胞中含有PDE4，被認為是促性腺激素刺激后反饋調節cAMP水平的分子，FSH和LH均可以誘導卵丘細胞中PDE4的mRNA的表達，提高其含量。在LH峰到來之前，卵丘細胞中的cGMP通過縫隙連接被轉運至卵母細胞，可抑制PDE3A的活性，幫助維持成熟前細胞內的高濃度cAMP環境。此外，近年的研究還發現利鈉肽（natriuretic peptides）具有促使卵母細胞停滯在MⅠ階段的作用。利鈉肽家族主要有三種形式，分別是心鈉肽、腦鈉肽及C型鈉尿肽（C-type natriuretic peptide，CNP）。卵泡中的顆粒細胞可以分泌CNP，并且卵丘細胞表面表達2型利鈉肽受體 （natriuretic peptides receptor 2，NPR2）。動物實驗表明CNP與其受體結合后，激活其所偶聯的鳥苷酸環化酶，可以增加卵丘細胞內cGMP的含量，研究者認為這是卵泡中cGMP的主要來源，后者通過縫隙連接進入卵母細胞，抑制PDE活性，維持cAMP的高水平，最終抑制卵母細胞減數分裂的恢復。值得一提的是，CNP的合成也受到多種因子的調控。實驗發現，顆粒細胞合成CNP的一個必要條件是細胞內環境中一定要有雌二醇的存在，否則不能合成。而FSH可以影響顆粒細胞產生雌激素，因此可以間接增強CNP的生成，且這個過程還受GDF-9及BMP-15的協同促進作用。

卵泡液的其他抑制成分：體外實驗發現，卵母細胞培養液中加入50%的卵泡液，可在大約48小時后阻斷25%的卵母細胞核成熟，但阻斷的時間不超過30分鐘。說明卵泡液中具有抑制細胞核成熟的物質，但其作用有限，不如cAMP那么強。研究認為，卵泡液中的抑制物包括次黃嘌呤和多種類固醇等，主要來源于顆粒細胞。次黃嘌呤可以抑制PDE的活性而間接提高cAMP的水平；類固醇中的雌二醇和睪酮均可對減數分裂起到抑制作用，黃體酮可能有促進作用。

MⅠ恢復：卵母細胞中高水平的cAMP在細胞核維持減數分裂停滯的過程中具有重要作用，cAMP可以通過PKA實現對MPF的磷酸化而導致后者的失活。而隨著LH或HCG峰的到來，一方面，卵母細胞中的cAMP在促性腺激素作用下水平下降，解除了對MPF的抑制作用，觸發MⅠ的恢復；另一方面，在LH的影響下卵母細胞中鈣離子濃度快速升高，也可以激活減數分裂的重新啟動。

成熟促進因子（MPF）：MPF是由催化亞基——細胞周期依賴性激酶1（cyclin-dependent kinase 1，CDK1）和調節亞基——周期蛋白B（cyclin B，CYB）組成的蛋白復合物，其作用底物為核纖層蛋白與DNA組蛋白H1。CDK1也稱細胞周期依賴蛋白激酶2（cell division cycle 2，cdc2），具有激酶活性，當其第161位蘇氨酸（Thr161）被磷酸化時MPF被激活，可與細胞骨架相互作用，通過磷酸化微管蛋白來調控紡錘體的活動。動物實驗發現，在卵母細胞成熟之前，高水平的cAMP使cdc2上第14位蘇氨酸（Thr14）及第15位酪氨酸（Tyr15）殘基磷酸化而導致MPF失活，稱為MPF前體（pre-MPF）。LH峰到來以后，cAMP水平降低，并且此時pre-MPF數目也已積累到一定的閾值，可在促性腺激素的協同作用下激活卵母細胞中的一種雙特異性磷酸酶cdc25，后者使cdc2亞基上Thr14及Tyr15發生去磷酸化，pre-MPF被轉化為有生物活性的MPF。MPF的含量在GVBD前達到峰值，通過對微管蛋白的磷酸化作用，促使GVBD發生，卵母細胞迅速由雙線期轉化為分裂中期Ⅰ，減數分裂恢復。隨著第一極體的排出，MPF被大量水解達到低谷，直至減數第二次分裂的恢復，再重新積累到高峰。

促性腺激素對核成熟的調控：在哺乳動物中，卵母細胞MⅠ的恢復是在促性腺激素（包括內源性的FSH、LH及外源性的HCG）的作用下啟動的。在排卵前，循環中的FSH及LH在排卵前有一個峰值，5小時左右之后該峰值出現在卵泡中，并且FSH略早于LH峰值，認為FSH峰可能對卵母細胞成熟前生殖泡中染色質的凝集具有促進作用，為成熟做準備。然而FSH受體表達在卵泡顆粒細胞表面，LH受體主要表達在大的竇卵泡的壁顆粒細胞上，卵丘細胞沒有，并且這兩種受體均未在卵母細胞上被檢測到。這種現象表明，促性腺激素并不直接作用卵母細胞本身，而是通過與卵泡中的體細胞相互作用，后者通過旁分泌或縫隙連接而實現對卵母細胞成熟過程的調控。

盡管FSH與LH在卵母細胞成熟中有著不同的作用，且相較之下LH更為關鍵，但兩者相互協同，是減數分裂恢復的最重要的啟動因素。充分發育的卵泡中FSH峰的出現先于LH峰，可以通過間接作用促進GV內染色質的凝集，以及向核膜方向的聚集，并且FSH可以直接作用于壁顆粒細胞和卵丘細胞表面的受體，提高卵泡顆粒細胞中第二信使cAMP的水平，后者可以激活細胞內PKA及PKC，PKA可以繼續向下激活促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK），使卵丘細胞包裹卵母細胞（cumulus-enclosed oocyte，CEO）恢復減數分裂。FSH誘發的減數分裂恢復會導致卵丘-卵母細胞復合物（cumulus-oocyte complex，COC）中卵丘細胞分泌透明質酸而發生卵丘細胞的擴展，并減少卵母細胞與卵丘細胞之間的縫隙連接，從而阻止抑制減數分裂的物質（如cGMP）向卵母細胞中的運輸，這對于減數分裂的順利進行與排卵的發生具有重要意義。FSH所誘導激活的PKC下游通路還存在爭議，但實驗表明其對卵母細胞的核成熟具有促進作用，利用PKC的激活劑PMA可以在體外缺乏促激素的情況下誘導減數分裂的恢復，而多種PKA的抑制劑卻可以阻斷卵丘細胞中FSH對MAPK的作用。另有研究認為可以協同PKA促進表皮生長因子類物質的合成。

LH峰被認為是體內卵母細胞核成熟最關鍵的使動因素，可以通過多種途徑降低卵母細胞中cAMP的水平，增強MPF的活性而重啟減數分裂。CNP可由卵泡壁顆粒細胞合成，作用于卵丘細胞上的受體NPR2從而促進卵丘細胞內cGMP的合成，后者可以抑制PDE3A的生物活性而導致卵母細胞中cAMP的積累。當LH作用于壁顆粒細胞表面的受體時，另一方面也可抑制CNP蛋白的轉錄，導致NPR2下游的靶蛋白——鳥苷酸環化酶活性受抑制，cGMP水平下降，解除了其對PDE3A的抑制，后者水解cAMP，進一步可觸發減數分裂的恢復。卵泡中細胞之間的縫隙連接作為物質及信息傳遞通道，在卵泡發育以及維持MⅠ停滯狀態中起著十分重要的作用，可以將包括cGMP在內的多種物質傳送進卵母細胞。在GVBD發生前，LH可以通過激活MAPK依賴性信號通路使細胞表面連接蛋白Cx-43上過個位點磷酸化而失活，減少體細胞對卵母細胞減數分裂的抑制作用，降低卵母細胞中的cGMP含量，促進MⅠ的恢復，以及核的成熟。

實驗發現，在LH峰之后與GVBD之前，卵泡壁顆粒細胞中的cAMP含量會出現一個一過性的增多，隨后在GVBD前后又迅速下降。研究認為，LH峰作用于顆粒細胞表面的LH受體，后者為G蛋白偶聯受體，受LH激活，可增加下游第二信使cAMP的水平，造成其含量大幅增高，可以達到原先的80~200倍。而關于這部分急劇增多的cAMP是否會被傳送入卵母細胞，還存在爭議。體外實驗中，成熟前卵泡體細胞中cAMP含量的快速增加有助于COC中卵母細胞與卵丘細胞的分離，在卵母細胞體外成熟（in vitro maturation，IVM）過程中有促進作用，認為在體內cAMP的這種變化有助于排卵的發生。

LH峰引起的卵泡內生長因子的合成及其在核成熟和細胞質成熟中的作用：哺乳動物的卵母細胞本身不表達LH受體，對直接的LH和HCG的刺激也不敏感。長期以來，一直有推測是卵泡中的一些體細胞，如顆粒細胞、卵泡膜細胞等受LH刺激后分泌某些生長因子，以旁分泌形式作用于卵丘/卵母細胞，促進了卵母細胞的核成熟和細胞質成熟（圖2-2）。近年來，一系列動物研究結果支持這一推測，在LH作用下，卵泡中的幾種體細胞可以合成多種生長因子，包括表皮生長因子、胰島素樣生長因子、內皮素-1、膠質細胞來源神經營養因子及腦源性神經營養因子等，這些生長因子可以通過旁分泌作用，間接促進GVBD的發生和/或第一極體的釋放以及細胞質成熟。我們的研究發現一些生長因子，如內皮素-1、膠質細胞來源神經營養因子能以旁分泌形式對人卵母細胞的核成熟和細胞質成熟起調節作用。臨床研究也證實，在培養液中添加表皮生長因子、膠質細胞來源神經營養因子及腦源性神經營養因子能促進人卵母細胞的成熟，為以后改進體外成熟培養液，更有效地進行人卵母細胞體外成熟培養打下了基礎。

Kit Ligand：KitL在哺乳動物卵泡內主要由顆粒細胞分泌，可與卵母細胞表面的c-kit受體結合，影響卵母細胞的生長和發育。近年小鼠實驗還發現，在LH/HCG的作用下，排卵前卵泡中以及HCG注射后4小時的小竇卵泡中KitL的表達量顯著上升。向小鼠卵丘-卵母細胞復合體中加入KitL發現，KitL會通過劑量依賴性的模式，上調卵泡中cyclin B1的水平來促進卵母細胞核的成熟，加速第一極體排出。近幾年還發現哺乳動物卵泡中C型鈉尿肽的水平，降低后者促進cGMP生成的過程，促使減數分裂的恢復。

表皮生長因子類：早期體外實驗就已證實，表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）在有次黃嘌呤存在的抑制環境下也可以促使減數分裂的恢復。近年來還發現在人體和動物體內，成熟前的卵泡中存在EGF樣多肽（EGF-like peptides，EGF-p），可以在LH峰及cAMP的刺激下促進減數分裂的恢復以及排卵的發生，主要包括雙調蛋白（amphiregulin，AREG）、外調蛋白（epiregulin，EREG）及BTC（β-cellulin）。研究證實，這三類表皮生長因子樣生長因子（EGF-like growth factors）均可與位于顆粒細胞、卵丘細胞表面的表皮生長因子受體（EGF receptor，EGFR）結合，通過不同的機制誘導卵母細胞中減數分裂的恢復，促進卵母細胞的核成熟。如在小鼠卵泡中，AREG和EREG可以抑制顆粒細胞及卵丘細胞中C型鈉尿肽mRNA的表達，從而抑制C型鈉尿肽誘導生成cGMP的作用，促進減數分裂的恢復。另有研究發現，EGF樣生長因子可以上調包括Has2、Ptx3、Ptgs2在內的多種可促進卵丘細胞外基質合成的蛋白的mRNA的表達，從而促進卵丘的擴展，加速核成熟，為排卵做準備。近年來還發現，內皮素-1（endothelin-1，ET-1）作為EGF樣生長因子家族的一員，可在LH/HCG的刺激下，由成熟前卵泡的顆粒細胞合成，并且ET-1可與卵丘細胞表面的受體（ETRA和ETRB）結合，下調卵丘細胞與卵母細胞之間的連接蛋白Cx-26等途徑來促進卵母細胞的核成熟。

胰島素樣生長因子：胰島素樣生長因子3（insulin-like 3，INSL-3）最早被發現在雄性動物睪丸Leydig細胞中，在生精過程中具有重要意義。隨后，研究人員又在卵巢的膜細胞和黃體中檢測到了INSL-3的表達，且INSL-3基因敲除鼠表現為不孕。體內和體外實驗均證實，卵泡膜細胞可以在LH峰或HCG的作用下合成INSL-3，后者與位于卵母細胞表面的抑制性G蛋白偶聯受體LGR8結合，抑制G蛋白下游通路的激活，減少卵母細胞中cAMP的生成，解除cAMP對減數分裂的抑制作用，促進卵母細胞核成熟。

神經營養因子類：研究已經證實，多種神經營養因子，包括腦源性神經營養因子（BDNF）、膠質細胞系源性神經營養因子（GDNF）、神經營養素3（NT-3）等，不僅可在神經系統中起作用，還可以在哺乳動物卵巢中發揮功效，如促進卵母細胞的生長、發育、成熟，以及成熟后的早期胚胎發育的一系列準備活動等。目前研究較為清楚的是BDNF、GDNF。較早研究發現，在LH或HCG的作用下，鼠卵泡中顆粒細胞與卵丘細胞中BDNF的表達量顯著上升，后者與位于卵母細胞表面的TrkB受體結合，與卵母細胞直接相互作用，促進第一極體的釋放，并可以加速細胞質的成熟，為受精與早期胚胎發育做準備；類似的GDNF也在LH或HCG的刺激下表達上升，與卵母細胞上的受體（GFRA1、RET蛋白）結合，上調卵母細胞中CYB蛋白，促進第一極體釋放。最新研究還發現GDNF可以下調卵泡中小RNA（如miR-145-5p），進一步強化卵丘細胞的作用，促進卵母細胞核成熟等。

鈣離子的作用：多種體內外實驗表明，鈣離子（Ca2+）在卵細胞核的成熟中發揮著關鍵作用。卵母細胞內Ca2+的高頻釋放被認為是減數分裂啟動的最早標志之一，Ca2+與鈣調蛋白可以共同調節卵母細胞中PDE的活性，后者可顯著降低cAMP的水平。卵泡生長過程中，卵母細胞中的Ca2+持續低頻釋放，直至促性腺激素誘導核成熟啟動時，Ca2+的釋放出現一個高峰，并且在這個階段卵母細胞中Ca2+總量也大幅增加，因此在IVM的培養液中Ca2+是必不可少的成分。卵丘細胞中，在FSH和LH的作用下，水解磷脂酰肌醇（phosphatidylinosital biphosphate，PIP2）為二酰甘油（diacylglycerol，DAG）和三磷酸肌醇（inositol triphosp，IP3），其中DAG可在Ca2+參與下激活PKC，參與核成熟的調控，而IP3則可與受體結合使顆粒細胞內儲存的Ca2+大量釋放，通過縫隙連接進入卵母細胞，IP3本身也可穿過縫隙連接，促進卵母細胞自身鈣離子向胞質內的大量釋放，達到一定濃度后激活卵細胞。

醇類與甾體類物質：研究顯示，卵泡中在促性腺激素作用下生成的甾醇與甾體類物質也在核成熟過程中發揮作用，主要包括減數分裂激活甾醇（meiosis activating sterol，MAS）及性腺甾體類激素。MAS是膽固醇合成過程中的中間產物，在雌性哺乳動物的卵泡液中及雄性動物的睪丸中都有發現。體外實驗中，用MAS處理與卵泡環境分離的裸卵，發現其可以促使減數分裂的恢復。在體內，促性腺激素峰作用之后，卵泡液中的MAS水平上升。在FSH的作用下，卵丘細胞中PKA2-CREB信號被激活，CREB可以幫助啟動細胞色素P51（CYP51）的轉錄，后者被證明是MAS合成的關鍵酶，可促進MAS的生成。此外，CYP51還可以促進甾體類激素的合成，并可能參與由EGF誘導的MAPK磷酸化過程而協同促進核的成熟。而LH在促進MAS合成的過程中是否起作用，還有待研究。除本身作用之外，MAS還可以在受精后促進第二次減數分裂的完成并有助于提高卵子的質量，也可以被代謝為孕激素發揮作用。實驗發現MAS抑制劑同樣可減少卵泡內孕激素的合成。已在包括人類在內的多種動物中證實，卵丘細胞在促性腺激素作用下通過多種路徑合成孕激素，包括EGFR下游通路、CYP51的作用等。孕激素生成后，可與卵丘細胞中的受體結合，下調cAMP水平，以及通過減少Cx-43而關閉縫隙連接，達到誘導減數分裂恢復的目的。目前，關于雌二醇和睪酮對卵母細胞成熟的作用還存在爭議，有研究認為雌二醇和睪酮抑制減數分裂恢復，也有學者認為無作用。也有研究認為雌二醇、睪酮與受體結合可以通過MAPK信號，促使幼鼠裸卵減數分裂的恢復。目前認為這些爭議性結論可能是由于裸卵具有自發恢復減數分裂的能力，以及將卵母細胞從COC分離出來可能已經破壞了其甾體類激素的微環境，故雌二醇與睪酮對卵母細胞核成熟的作用還需進一步探究。

二、卵母細胞胞質與卵膜的成熟

卵母細胞從形成后不斷生長發育到成熟，細胞質的成分經歷了一系列復雜的變化，尤其是卵母細胞在促性腺激素作用下成熟的過程，即從GVBD到MⅡ中期，細胞質中的細胞器與其他分子的生理生化改變最為明顯，這種變化就是卵母細胞質的成熟過程?？傮w而言，始基卵泡中卵母細胞胞質的細胞器較少，聚集在核周圍。在卵母細胞被激活生長的過程中，細胞器的數量增多，并在細胞骨架的作用下向不同位置遷移，與此同時，隨著卵母細胞體積的不斷增大，胞質中的蛋白合成活躍，多種與卵子成熟及受精和早期胚胎發育相關的物質逐漸積累，便于卵子的成熟、受精及胚胎發育的支持。因此，卵子的成熟不僅僅是前文所述的核成熟與減數分裂的完成，胞質的成熟也具有重要意義。

1.線粒體（mitochondria）

線粒體是細胞中最重要的細胞器之一，由雙層線粒體膜、嵴、基質組成，通過氧化磷酸化的作用為細胞中的多種代謝活動提供能量。卵母細胞成熟、受精嵴早期胚胎發育過程中均需要大量的能量，因此線粒體的作用至關重要，其分布和代謝活性也是細胞質成熟和減數分裂恢復的重要特征。在卵子的早期發育過程中，線粒體的形態、數目與代謝活性經歷一系列的變化，以適應卵子多種代謝活動的能量需求。早期卵泡中卵母細胞的線粒體主要沿核周分布，形態呈圓形，內無嵴或很少。次級卵泡之后，線粒體數目大幅增長并逐漸向皮質區移動，為卵母細胞的成熟做準備。許多研究證實，在卵母細胞成熟過程中（這里主要指GVBD到MⅡ中期），線粒體發生了多種改變，包括線粒體數目及DNA（mtDNA）的含量變化、在皮質區分布的改變、膜電位與氧化磷酸化的改變等。

成熟前，卵母細胞體積最大的時候，線粒體的數目也達到頂峰，而在成熟過程中，研究者認為線粒體的數目下降大約2/3，但數量上的改變并不能十分確切地反映線粒體功能的變化，因為此階段的線粒體之間存在大量的融合與裂變，形成大小不一的團狀線粒體組織。值得一提的是，從始基卵泡起，線粒體中的mtDNA就開始大量的復制，其拷貝數可由最初的數千增長到數十萬，以抵消線粒體在卵子成熟時融合與裂解所造成的數量上的損失，達到一定的平衡。并且有學者認為，mtDNA的數量最終需要達到一定的閾值，才能保證后續的成熟、受精、早期胚胎發育的順利進行。此外，從GVBD到MⅡ中期，線粒體在微管的作用下，在卵母細胞皮質區域遷移與聚集，這也是胞質成熟的特征之一。小鼠實驗發現，在GVBD之前，線粒體在皮質區分散排列。隨著GVBD的發生，超過40%的線粒體在即將形成的MⅠ紡錘體的附近聚集，并與周圍大量的內質網相鄰，在紡錘體的形成與染色體分離，第一極體的排出過程中提供能量。而到了MⅡ中期停滯時，紡錘體附近則不再有大量的線粒體，取而代之的是該區域大量的致密顆粒，直至MⅡ恢復時線粒體才在紡錘體周圍重新聚集。鑒于線粒體的這種聚集現象是在微管蛋白的牽引下完成的，因此也受到微管蛋白調控因子的調節，如動力蛋白抑制劑可以阻斷此過程的發生。卵泡成熟過程中，卵母細胞中的線粒體產生ATP的能力也會隨著其內外膜電位差的改變而受到調控，以適應卵子不同區域的代謝需求。盡管在所有線粒體在形態與微觀結構上十分相似，但內外膜電位差的大小直接決定著線粒體進行氧化磷酸化的能力強弱，即產生ATP的能力?，F已證明這種電位差的上調在卵子耗能高的區域和時段最為聚集，如在MⅠ紡錘體的附近以及隨后受精過程中卵子皮質區域等，并且發現電位差的上調可以被由放射冠細胞所產生的NO分子所抑制。卵母細胞成熟過程中，胞質內有三次ATP合成高峰，分別是GVBD發生時、紡錘體向皮質遷移時，以及第一極體釋放時。與之相對應，GVBD時核周出現線粒體的聚集與膜電位的上調，紡錘體遷移時這種現象出現在紡錘體附近，第一極體釋放時出現在卵子邊緣并處于紡錘體的中間。

2.內質網（endoplasmic reticulum，ER）

ER是蛋白質合成的主要場所，發育早期的卵母細胞中就有大量的ER存在，并且以含有核糖體的粗面內質網（rough ER，RER）為主。隨著卵母細胞的生長，ER的含量不斷增多，到卵母細胞達到最大體積時，RER最為發達，隨后開始減少，到卵母細胞成熟時RER消失，滑面內質網（smooth ER，SER）增多。SER是細胞內的鈣離子庫，核成熟以及受精過程中所需的鈣離子主要從SER中釋放。此過程是通過IP3與ER表面的受體結合而介導完成的。在成熟過程中的卵母細胞中，ER逐漸向卵母細胞皮質，由GVBD之前不規則的囊泡逐漸轉化為直徑1~2μm的團簇狀囊泡，在卵母細胞皮質的紡錘體附近排列。在小鼠以及包括人類在內的哺乳動物中都已證明，從GV到MⅡ中期，SER的數目翻倍且對IP3的敏感性提高，聚集位點及功能與線粒體緊密相連，均在紡錘體附近，協助紡錘體向卵母細胞一極遷移，與線粒體協同作用而推進MⅠ的進行。

3.高爾基復合體（Golgi apparatus，GA）

GA是細胞中蛋白質合成后修飾與轉運的重要場所。在卵泡生長過程中，顆粒細胞里的GA在S期可聚集于中心體附近與其協同作用完成顆粒細胞的增殖。初級卵母細胞中，GA分布于細胞核的周圍，隨后逐漸遷移至皮質區數量增加。以前有觀點認為，到了卵母細胞成熟時，GA會消失。近年有研究認為，在GVBD之前，GA呈微小的囊泡狀（mini-Golgis）分散于胞質中，并且此狀態會一直持續到MⅡ期，而并非完全消失。在小鼠與牛中發現，相比卵母細胞皮質區，小的GA囊泡似乎更多地聚集在胞質的內部，其活動受到微管蛋白與細胞質動力蛋白的調控。動物實驗中，利用藥物抑制ER向GA的質膜流動，會抑制甚至逆轉卵母細胞的成熟，推測GA的活動可主動參與并調控成熟的過程。近期在小鼠成熟的卵母細胞中發現一種存在于順面GA囊泡中的蛋白——GM130，可參與調控ER到GA的膜流、糖基化及維持GA的穩定性。GVBD之后，帶有GM130蛋白的GA小囊泡會聚集在卵母細胞的中央，GM130蛋白可以募集微管成核因子（microtubule nucleating factor），在紡錘體形成的過程中發揮協同作用，最終參與細胞極化以及分裂的過程，隨后在MⅡ停滯期GA分散，直到MⅡ再次啟動才重新聚集在紡錘體的附近。據此，至少可以認為在小鼠中，一部分GA小囊泡可以通過其內所包含的GM130分子參與微管成核與紡錘體形成而促進減數分裂的進行。需要注意的是，小鼠卵母細胞中GA的這一作用需要多個微管形成中心 （multiple microtubule organizing center，MTOC）參與完成，但在包括人在內的其他多種生物的卵母細胞中不存在這一結構。因此，對于GA在哺乳動物卵子成熟中的作用與機制還有待探究。

4.皮質顆粒（cortical granules）

皮質顆粒是一種位于卵母細胞皮質下方的獨立的膜細胞器，為卵母細胞中所特有。其內含有蛋白酶、過氧化物酶等多種水解類物質，主要作用是調控透明帶反應以保證單精子受精及早期胚胎發育。從卵泡的早期發育，皮質顆粒就開始形成，并聚集在細胞核附近，關于其來源，有研究認為與卵母細胞中高爾基復合體的活性調節有關。不同動物中皮質顆粒生成的時間不同，如嚙齒類動物的初級卵泡中就有皮質顆粒，而猴子、人類等靈長類動物到次級卵泡才生成。卵母細胞成熟時數量最多，是其成熟的標志之一，此時的皮質顆粒成單層分布于卵膜下方，精卵融合后，皮質顆粒在內源性鈣離子的作用下向外繼續遷移并與卵膜融合，將其內物質釋放入卵周隙以完成透明帶反應。

5.卵母細胞核質成熟的協調

卵母細胞的成熟主要包括細胞核與細胞質的成熟，最先開始的是減數分裂的恢復，隨后才逐漸獲得受精與發育的潛能，因此在核與質的成熟上有明顯的不同步性。只有當細胞核與細胞質都完全成熟后，卵母細胞才可以完成受精與早期胚胎發育的過程。并且，核的成熟調控著胞質的活動，胞質的成熟保證減數分裂的準備與恢復的順利進行，兩者相互促進相互影響。在卵母細胞體外成熟的過程中，胞質的不完全成熟往往是導致受精率下降的主要原因。如實驗發現，從小的竇卵泡中可以提取出即將核成熟的卵母細胞，在體外培養下可順利發育至MⅡ中期，并可以完成受精。但再受精后卻很難繼續發育，提示胞質與胞核成熟協調的重要性。但目前對于胞質與胞核成熟的確切時間還存在爭議，多數人認為胞質較胞核的成熟稍晚一些。