第十四章　報(bào)告基因顯像

分子影像學(xué)是通過(guò)無(wú)創(chuàng)性的手段在細(xì)胞和/或分子水平檢測(cè)活體分子過(guò)程，了解體內(nèi)特異性基因或蛋白質(zhì)表達(dá)的部位、水平、分布及持續(xù)時(shí)間。報(bào)告基因顯像（reporter gene imaging，RGI）技術(shù)將報(bào)告基因與報(bào)告探針結(jié)合在一起，通過(guò)探針聚集顯像報(bào)告基因產(chǎn)物的活性水平，從而間接提供報(bào)告基因表達(dá)水平及驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因表達(dá)的內(nèi)源性信號(hào)或轉(zhuǎn)錄因子水平的信息，屬于間接顯像策略。由于一種報(bào)告基因的特異性表達(dá)探針可用于與該報(bào)告基因偶聯(lián)的各種感興趣靶基因的測(cè)定，能對(duì)多種不同的生物學(xué)和分子遺傳學(xué)過(guò)程進(jìn)行顯像，不需要針對(duì)不同的報(bào)告基因報(bào)告探針系統(tǒng)研制不同的特異性分子探針；加之研究報(bào)告基因構(gòu)建體遠(yuǎn)較研制新的分子探針簡(jiǎn)便，且能更快地應(yīng)用于臨床，較直接顯像策略省時(shí)省力，且耗資少。由于這些優(yōu)勢(shì)，報(bào)告基因顯像技術(shù)現(xiàn)已廣泛地應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中。本文對(duì)分子影像學(xué)中報(bào)告基因顯像的一般原則、分類、相關(guān)影像學(xué)技術(shù)及潛在的臨床應(yīng)用作一簡(jiǎn)述。

報(bào)告基因是一種編碼可被檢測(cè)的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說(shuō)，是一個(gè)其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達(dá)調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因，或與其他目的基因相融合，在調(diào)控序列控制下進(jìn)行表達(dá)，從而利用它的表達(dá)產(chǎn)物來(lái)標(biāo)定目的基因的表達(dá)調(diào)控。作為報(bào)告基因，在遺傳選擇和篩選檢測(cè)方面必須具有以下幾個(gè)條件：①已被克隆和全序列已測(cè)定；②其表達(dá)產(chǎn)物能進(jìn)行定量測(cè)定；③表達(dá)產(chǎn)物在受體細(xì)胞中本不存在，即無(wú)背景，在被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中無(wú)相似的內(nèi)源性表達(dá)產(chǎn)物。報(bào)告基因顯像則是將報(bào)告基因轉(zhuǎn)染給靶細(xì)胞后，通過(guò)標(biāo)記的報(bào)告探針與報(bào)告基因的特異性結(jié)合而顯影。通過(guò)探針的聚集顯示報(bào)告基因產(chǎn)物的活性水平，從而間接提供報(bào)告基因表達(dá)水平及驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因表達(dá)的內(nèi)源性信號(hào)或轉(zhuǎn)錄因子水平的信息，了解體內(nèi)特異性基因或蛋白質(zhì)表達(dá)的部位、水平、遷徙及持續(xù)時(shí)間。

第一節(jié)　報(bào)告基因顯像的基本概念

一、報(bào)告基因顯像的一般原則

報(bào)告基因表達(dá)顯像必須將報(bào)告基因引入生物體內(nèi)靶組織，這需借助于載體作為中介物質(zhì)。目前可應(yīng)用的傳送載體均可用于報(bào)告基因顯像中。報(bào)告基因整合入載體的方法有基因融合法、雙順反子法、雙啟動(dòng)子法以及共載體法。報(bào)告基因顯像利用上游啟動(dòng)子或增強(qiáng)子元件控制下的報(bào)告基因，共同特征是含有感興趣報(bào)告轉(zhuǎn)基因的cDNA表達(dá)盒，這些表達(dá)盒的設(shè)計(jì)和排列可以不同。比如，其可由所選擇的任意啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列驅(qū)動(dòng)。啟動(dòng)子可以是組成性的（導(dǎo)致連續(xù)轉(zhuǎn)錄），也可以是誘導(dǎo)性的（導(dǎo)致有控制的表達(dá)）；啟動(dòng)子也可具有細(xì)胞特異性，使轉(zhuǎn)基因表達(dá)僅限于某些細(xì)胞或器官。報(bào)告基因就在這些特異啟動(dòng)子或增強(qiáng)子元件控制下啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄、隨后翻譯成基因產(chǎn)物，其編碼產(chǎn)物可以是酶、受體或轉(zhuǎn)運(yùn)子。報(bào)告基因顯像的一個(gè)原則是如果報(bào)告基因在體內(nèi)不轉(zhuǎn)錄，就不會(huì)導(dǎo)致報(bào)告探針的聚集；相反，如果啟動(dòng)子導(dǎo)致報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄，報(bào)告基因mRNA的翻譯將引起報(bào)告基因編碼產(chǎn)物與報(bào)告探針發(fā)生作用從而產(chǎn)生可檢測(cè)到的影像學(xué)信號(hào)。

理想的報(bào)告基因應(yīng)符合以下條件：①為預(yù)防免疫反應(yīng)，報(bào)告基因在正常宿主細(xì)胞內(nèi)不表達(dá)；②特異的報(bào)告探針應(yīng)僅在報(bào)告基因表達(dá)的部位聚集；③在報(bào)告基因不表達(dá)時(shí)不應(yīng)有報(bào)告探針聚集；④報(bào)告基因的產(chǎn)物應(yīng)無(wú)免疫反應(yīng)；⑤報(bào)告探針在體內(nèi)穩(wěn)定，在達(dá)到靶目標(biāo)前不被代謝；⑥報(bào)告探針應(yīng)能迅速?gòu)难h(huán)中清除，不干擾特殊信號(hào)的檢出；⑦報(bào)告探針或其代謝物無(wú)細(xì)胞毒性；⑧除了轉(zhuǎn)基因應(yīng)用外，報(bào)告基因及其啟動(dòng)子應(yīng)足夠小以適合傳送載體（質(zhì)粒、病毒）；⑨自然的生物學(xué)屏障不會(huì)阻止報(bào)告探針達(dá)到靶部位；⑩影像信號(hào)應(yīng)與體內(nèi)報(bào)告基因mRNA和蛋白的水平有很好的相關(guān)性。但目前還沒有一個(gè)報(bào)告基因或報(bào)告探針符合上述這些標(biāo)準(zhǔn)。因此可基于不同的目的開發(fā)多系統(tǒng)的報(bào)告基因，利用不同的成像系統(tǒng)同時(shí)活體監(jiān)控多種報(bào)告基因的表達(dá)。已經(jīng)合成了數(shù)種融合報(bào)告基因用于多模式成像，這些報(bào)告基因的產(chǎn)物可同時(shí)利用兩種或三種影像學(xué)技術(shù)顯像，在小動(dòng)物研究和臨床應(yīng)用中具有廣闊前景。

二、報(bào)告基因顯像分類

RGI技術(shù)目前已有很大發(fā)展，根據(jù)報(bào)告基因的編碼產(chǎn)物不同，可分為酶為基礎(chǔ)的報(bào)告基因和受體或轉(zhuǎn)運(yùn)子為基礎(chǔ)的報(bào)告基因，已經(jīng)形成了包括放射性核素成像、MRI和光學(xué)成像的完整體系（表14-1）。

第二節(jié)　常用的報(bào)告基因顯像技術(shù)

根據(jù)不同報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物，影像學(xué)活體示蹤移植干細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化的方法主要包括放射性核素成像、MRI及光學(xué)成像，這三類技術(shù)各有優(yōu)勢(shì)和不足，其中最具發(fā)展前途的是放射性核素RGI系統(tǒng)。

一、核醫(yī)學(xué)技術(shù)

放射性核素成像主要包括SPECT和PET。基于核醫(yī)學(xué)技術(shù)監(jiān)測(cè)體內(nèi)移植干細(xì)胞的RGI主要包括四類：①基于Ⅰ型單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因（herpes simplex virus type Ⅰ thymidine kinase，HSV1-tk）和突變型單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因（mutant herpes simplex virus type 1 thymidine kinase，HSV1-sr39tk）作為報(bào)告基因；②以跨膜受體的基因作報(bào)告基因，如多巴胺2型受體、雌激素受體和生長(zhǎng)抑素Ⅱ型受體；③轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白/底物報(bào)告基因系統(tǒng)，主要包括去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和鈉碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體系統(tǒng)等；④其他報(bào)告基因系統(tǒng)，包括抗原或抗體基因片段、轉(zhuǎn)螯合GGC肽融合基因、酪氨酸酶基因等（圖14-1）。

1.HSV1-tk報(bào)告基因系統(tǒng)

TK基因（thymidine kinase gene）編碼脫氧胸苷激酶，在病毒、細(xì)菌和真核細(xì)胞中都存在，但不同來(lái)源tk基因的結(jié)構(gòu)不同，編碼的蛋白產(chǎn)物在相對(duì)分子質(zhì)量、理化性質(zhì)和生化功能上也有很大差異；應(yīng)用最廣泛的HSVl-tk基因序列長(zhǎng)約3.4kb，包括5′端調(diào)控區(qū)和3′端非編碼區(qū)，編碼區(qū)基因全長(zhǎng)1.3kb，有1 128個(gè)核苷酸，編碼376個(gè)氨基酸，基因中無(wú)內(nèi)含子，其mRNA的5′端有107個(gè)核苷酸的非編譯區(qū)，其5′端側(cè)翼序列與HSVl-tk表達(dá)水平密切相關(guān)。放射性核素（¹⁸F、¹¹C、¹²³I、¹²⁴I和 ¹³¹I）標(biāo)記的核苷類似物，經(jīng)主動(dòng)運(yùn)輸通過(guò)HSVl-tk轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，被該基因的編碼產(chǎn)物胸苷激酶磷酸化成5′-磷酸核苷，5′-磷酸核苷不能再次穿過(guò)細(xì)胞膜而“陷入”在被轉(zhuǎn)染細(xì)胞中。因而，細(xì)胞內(nèi)放射性活度反映了tk基因的表達(dá)。利用該系統(tǒng)進(jìn)行的RIG可以通過(guò)以下途徑實(shí)現(xiàn)：①直接反映tk基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)；②利用雙順反子載體，將tk基因與其他治療基因克隆在同一啟動(dòng)子下游，從而監(jiān)測(cè)治療基因的表達(dá)。

HSV-tk的探針主要有兩類：①阿昔洛韋類衍生物，如¹⁸F標(biāo)記的8-氟-9-2-羥基-1-羥甲基乙氧基甲基鳥嘌呤（FGCV）、9-3-氟-1-羥基-2-丙氧甲基鳥嘌呤（FHPG）、9-4-氟-3-羥甲基丁基鳥嘌呤（FHBG）和8-氟-9-2-羥基-1-羥甲基乙氧基甲基腺嘌呤（FACV）；②嘧啶核苷衍生物，如¹³¹I、¹²⁴I和 ¹¹C 標(biāo)記的 2′-氟 -2′-脫氧 -1-β-D-阿拉伯呋喃糖-5-尿嘧啶（FIAU）。FHPG、FIAU具有本底信號(hào)低、從血液中清除快、穩(wěn)定性好、安全等特性，是目前最成熟的HSV-tk報(bào)告基因顯像的分子探針，可分別用于SPECT和PET顯像。放射性核素顯像具有較高的靈敏性，特別是PET的敏感性可達(dá)10^-12mol濃度，但SPECT、PET的空間分辨率和解剖定位能力仍然相對(duì)較差，而PET/CT（MR）和SPECT/CT的應(yīng)用有效地彌補(bǔ)了這些不足，實(shí)現(xiàn)了高敏感性和高分辨率的結(jié)合。Lan 等應(yīng)用 ¹³¹I-2′-fluoro-2′-deoxy-1-beta-Darabinofuranosyl-5-iodouracil（¹³¹I-FIAU）報(bào)告探針在轉(zhuǎn)染HSV1-tk基因的兔模型進(jìn)行SPECT心肌報(bào)告基因顯像，并證實(shí)在轉(zhuǎn)染HSV1-tk后1～2天心肌局部可見明顯的放射性濃聚，提示該基因在局部的高表達(dá)，為缺血性心肌疾病基因治療的監(jiān)測(cè)提供了基礎(chǔ)（圖14-2）。

在隨后的研究中為了提高HSV1-tk基因表達(dá)顯像敏感性，Gambhir等首次使用一種HSV1-tk（mutant）型即HSV1-sr39tk，分析發(fā)現(xiàn)HSV1-sr39tk具有對(duì)標(biāo)記探針更高的Vmax/Km，它來(lái)自于HSV1-tk基因的隨機(jī)序列變異。實(shí)驗(yàn)表明使用HSV1-sr39tk為報(bào)告基因和阿昔洛韋類衍生物為標(biāo)記探針的PET顯像，比HSV1-tk的基因表達(dá)顯像更佳。Zhang等的研究結(jié)果表明，將轉(zhuǎn)染HSV1-sr39tk基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）注射到動(dòng)物體內(nèi)后，應(yīng)用¹⁸F-FHBG PET/CT報(bào)告基因顯像可以清晰顯示報(bào)告基因的表達(dá)，有效的監(jiān)測(cè)移植的干細(xì)胞（圖14-3）。

2.受體報(bào)告基因系統(tǒng)

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的進(jìn)步，受體顯像在受體表達(dá)陰性腫瘤中的顯像、基因治療監(jiān)測(cè)方面開辟了新的研究領(lǐng)域。受體基因經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，利用標(biāo)記核素的配基與之結(jié)合進(jìn)行顯像（標(biāo)記顯像核素）和靶向治療（標(biāo)記治療性核素）。在此基礎(chǔ)上，針對(duì)基因治療中遇到的難于定位治療轉(zhuǎn)基因和監(jiān)控療效等問(wèn)題，發(fā)展了受體介導(dǎo)的報(bào)告基因/報(bào)告探針。受體報(bào)告基因（receptor-based reporter gene）其基本原理是：將某些受體蛋白基因與治療基因克隆在同一啟動(dòng)子下，然后利用放射性核素標(biāo)記的相應(yīng)的配體進(jìn)行顯像，觀察受體基因的表達(dá)情況，從而定量間接評(píng)價(jià)治療基因的導(dǎo)入部位、表達(dá)水平和持續(xù)時(shí)間。這種基因表達(dá)的非侵入性、可重復(fù)性、定量性顯像將有助于人類基因治療試驗(yàn)以及分子、細(xì)胞治療動(dòng)物模型的研究。

（1）多巴胺2受體（D2R）基因：

其機(jī)制為通過(guò)放射性核素標(biāo)記的配體與D2R結(jié)合而在表達(dá)D2R報(bào)告基因的組織中蓄積顯像。分子探針包括3-2′-¹⁸F-氟乙基螺旋哌啶酮（¹⁸F-fluoroethylspiperone，¹⁸F-FESP）、¹²³I-碘苯酰胺和 ¹¹C-raclopride等。D2R系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)為它是相對(duì)高比活度（185～379GBq/μmol）的報(bào)告探針，但缺點(diǎn)是受體配體結(jié)合數(shù)量有限。應(yīng)用編碼多巴胺2型受體D2R的基因轉(zhuǎn)染小動(dòng)物模型，然后利用¹⁸F-FESP可以進(jìn)行報(bào)告基因顯像。Kummer等采用的HSV1-sr39tk和D2R雙報(bào)告基因的單純皰疹病毒擴(kuò)增子載體用于人腦膠質(zhì)瘤模型，通過(guò)PET進(jìn)行定量分析證實(shí)了兩種基因表達(dá)的共存。

（2）雌激素受體：

雌激素受體（estrogen receptor，ER）可位于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核。經(jīng)典的核受體位于細(xì)胞核，其蛋白質(zhì)在翻譯后短暫位于胞質(zhì)，故可在細(xì)胞質(zhì)檢測(cè)到。擴(kuò)散到細(xì)胞核的雌激素與其核受體結(jié)合后引發(fā)基因調(diào)控機(jī)制，調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄。近年研究就發(fā)現(xiàn)經(jīng)典雌激素受體也可位于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)，雌激素與其結(jié)合后啟動(dòng)第二信使系統(tǒng)。雌激素在人體介導(dǎo)了很多生物學(xué)效應(yīng)，而最初人們認(rèn)為它的功能只受核受體的調(diào)控，即雌激素以自由擴(kuò)散形式通過(guò)質(zhì)膜，并與核受體緊密結(jié)合，通過(guò)結(jié)合靶基因上的雌激素應(yīng)答元件（estrogen response element，ERE）調(diào)節(jié)基因表達(dá)或與其他核蛋白相互作用以改變基因的轉(zhuǎn)錄活性。

雌激素受體近年來(lái)也被用作一個(gè)PET的基因。Furukawa等設(shè)計(jì)一種新型的報(bào)告基因，采用¹⁸F-標(biāo)記的雌二醇和人類雌激素受體配體（hERL）結(jié)合形成基因成像系統(tǒng)。¹⁸F-標(biāo)記的雌二醇用于人體研究，而且適用的組織比較廣泛，hERL和DNA結(jié)構(gòu)域結(jié)合也可以用作一種轉(zhuǎn)錄因子，因此也可以用于基因治療監(jiān)測(cè)。Qin等應(yīng)用¹⁸F-FES為報(bào)告探針在鼠模型進(jìn)行PET/CT報(bào)告基因顯像監(jiān)測(cè)細(xì)胞和基因治療。將轉(zhuǎn)染載有報(bào)告基因hERL和治療基因VEGF165腺病毒Ad5-hERLIRES-VEGF（Ad-EIV）的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞注射到鼠上肢后，應(yīng)用¹⁸F-FES PET/CT顯像可以監(jiān)測(cè)基因的表達(dá)（圖14-4）。而將攜帶該融合基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到急性心肌梗死模型后，應(yīng)用¹⁸F-FES PET/CT顯像可以使得梗死區(qū)移植的干細(xì)胞顯影，從而應(yīng)用于缺血性心肌疾病干細(xì)胞移植治療的監(jiān)測(cè)（圖14-5）。

（3）生長(zhǎng)抑素受體：

生長(zhǎng)抑素是一種在人體中廣泛分布的激素，是一種G蛋白偶聯(lián)的7-膜通透性受體，通過(guò)靶細(xì)胞膜上的生長(zhǎng)抑素受體，介導(dǎo)和負(fù)性調(diào)節(jié)多種生理功能。生長(zhǎng)抑素受體共有5種亞型，其中2型受體被認(rèn)為與腫瘤的關(guān)系最為密切，生長(zhǎng)抑素或生長(zhǎng)抑素類似物可通過(guò)SSTR2抑制腫瘤細(xì)胞。SSTR2可作為報(bào)告基因，利用放射性核素標(biāo)記的生長(zhǎng)抑素類似物進(jìn)行顯像，通過(guò)SSTR2基因的表達(dá)情況來(lái)間接評(píng)價(jià)其基因的表達(dá)情況。生長(zhǎng)抑素及相關(guān)類似物與受體結(jié)合后能產(chǎn)生抑制信號(hào)，在癌細(xì)胞中有抗增殖效應(yīng)。配體包括¹¹¹In-奧曲肽、^99mTc-P829或^99mTc-P2045等。而且很多腫瘤組織對(duì)于SSTR處于高表達(dá)，利用不同核素標(biāo)記，不僅可以對(duì)腫瘤進(jìn)行定位診斷，還能對(duì)生長(zhǎng)抑素治療效應(yīng)預(yù)測(cè)和受體導(dǎo)向內(nèi)照射治療；反之，對(duì)于低表達(dá)或不表達(dá)SSTR的腫瘤組織，則可以通過(guò)轉(zhuǎn)染SSTR基因來(lái)介導(dǎo)SST治療和內(nèi)照射治療，此時(shí)的SSTR基因一方面作為治療基因參與腫瘤治療，另一方面還可作為報(bào)告基因通過(guò)SSTR顯像來(lái)對(duì)自身的表達(dá)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

3.鈉碘轉(zhuǎn)運(yùn)體報(bào)告基因系統(tǒng)

鈉碘轉(zhuǎn)運(yùn)體（sodium iodide symporter，NIS）是1996年首次從大鼠甲狀腺組織中克隆出來(lái)的基因，同年研究者克隆出人的NIS。NIS位于甲狀腺濾泡細(xì)胞膜上，是一種跨膜糖蛋白，是甲狀腺激素生物合成中碘進(jìn)入細(xì)胞的途徑。其促進(jìn)碘的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，使碘順著電化學(xué)梯度從間質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。NIS轉(zhuǎn)運(yùn)碘的能量來(lái)自于細(xì)胞膜內(nèi)向性Na⁺濃度梯度，后者是由Na⁺-K⁺-ATP酶提供的，其協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)2個(gè)Na⁺（順化學(xué)梯度）及1個(gè)I^-（逆化學(xué)梯度）。NIS除了能轉(zhuǎn)運(yùn)碘，還能轉(zhuǎn)運(yùn)包括^99mTc高锝酸鹽在內(nèi)的其他多種陰離子，而NIS的這種作用能被高氯酸鉀抑制。

NIS性質(zhì)獨(dú)特，探針簡(jiǎn)便易得，有望成為最有前景的核素報(bào)告基因之一。NIS作為報(bào)告基因的優(yōu)點(diǎn)是不需要用放射性核素標(biāo)記底物制作特殊的核素探針，直接靜脈注射¹³¹I或^99mTc高锝酸鹽即可進(jìn)行顯像，¹³¹I或^99mTc高锝酸鹽都是臨床常用的核素，來(lái)源方便、價(jià)格低廉。由于^99mTc的能量較¹³¹I低，半衰期更短，其物理特性優(yōu)于¹³¹I，是臨床上最常用的顯像劑，因而選^99mTc高锝酸鹽作為NIS的探針更具臨床推廣價(jià)值。與其他報(bào)告基因相比，NIS還具有許多潛在的優(yōu)勢(shì)：①與來(lái)源于單純皰疹病毒的胸苷激酶不同，NIS是一種生理性表達(dá)蛋白，理論上無(wú)免疫原性，很少會(huì)導(dǎo)致抗體的形成；②與NIS結(jié)合的示蹤劑（^99mTcO^-、碘的放射性同位素）較¹⁸F等短半衰期正電子核素價(jià)格便宜，易于獲取；③與昂貴的PET設(shè)備相比、SPECT應(yīng)用更為廣泛；④放射性碘和锝已經(jīng)獲準(zhǔn)在臨床上使用多年，更易于直接投入臨床應(yīng)用。

胡碩等應(yīng)用NIS作為報(bào)告基因監(jiān)測(cè)心肌梗死干細(xì)胞移植治療，探討了人鈉碘轉(zhuǎn)運(yùn)體（hNIS）或鼠鈉碘轉(zhuǎn)運(yùn)體（rNIS）作為報(bào)告基因監(jiān)測(cè)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（rBMSCs）移植治療心肌梗死的可行性。將構(gòu)建的含有NIS和綠色熒光蛋白（eGFP）基因的腺病毒（Ad）質(zhì)粒（Ad-eGFP-rNIS）轉(zhuǎn)染到大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并將轉(zhuǎn)染基因的rBMSCs注射到急性心肌梗死鼠模型的心肌內(nèi)，然后以^99mTc-過(guò)锝酸鹽（^99mTc-pertechnetate）或者¹³¹I為顯像劑進(jìn)行SPECT報(bào)告基因顯像，并與熒光顯像比較，監(jiān)測(cè)移植干細(xì)胞的活性。結(jié)果表明，該法不需要特殊制備的報(bào)告探針即可顯示表達(dá)NIS的移植干細(xì)胞（圖14-6）。

NIS報(bào)告基因顯像也能被用來(lái)監(jiān)視腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞及神經(jīng)干細(xì)胞的活動(dòng)。hNIS基因已經(jīng)被廣泛地轉(zhuǎn)染到腫瘤細(xì)胞，如乳腺癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、黑色素瘤、宮頸癌、肝癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、骨髓瘤等。在動(dòng)物模型中，這種抗腫瘤治療的療效可以通過(guò)核醫(yī)學(xué)儀器輕易地觀測(cè)到。而帶有報(bào)告基因的免疫細(xì)胞則可以被用來(lái)監(jiān)視和預(yù)測(cè)抗腫瘤治療的療效，評(píng)估移植物抗宿主反應(yīng)及檢測(cè)自身免疫疾病的發(fā)病機(jī)制。此外，研究表明使用神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行修復(fù)時(shí)，使用NIS基因作為報(bào)告基因，可以觀測(cè)到神經(jīng)干細(xì)胞或永生化前體細(xì)胞，移行到中樞神經(jīng)系統(tǒng)并且進(jìn)入缺損的組織。

雖然轉(zhuǎn)染NIS基因到其他腫瘤的方法在顯像和治療方面顯示了巨大的價(jià)值，但是這種方法在實(shí)際臨床應(yīng)用中仍然面臨許多困難，許多必須解決的問(wèn)題仍然沒有得到解決。其中一條就是，在腫瘤細(xì)胞中，特別是在那些甲狀腺外組織來(lái)源的腫瘤中碘的攝取、外流和相應(yīng)動(dòng)力學(xué)是與正常的甲狀腺組織有區(qū)別的，甲狀腺外組織往往不能像甲狀腺一樣有效地聚集和有機(jī)化碘，所以在這些組織中碘的半衰期一般都較短。對(duì)于放射性治療來(lái)說(shuō)，這就導(dǎo)致在腫瘤細(xì)胞中不能形成有效劑量的活性碘的聚集。

4.其他

隨著報(bào)告基因的不斷發(fā)展，也有其他領(lǐng)域的報(bào)告基因顯像的涉入。如：利用某些C-末端融合肽與^99mTcO₄^-有很高的親和力。這一系列的肽（有時(shí)稱為金屬結(jié)合肽）在結(jié)構(gòu)上都具有連續(xù)的GGC，其中半胱氨酸的巰基可以穩(wěn)定地結(jié)合^99mTc。因此導(dǎo)入編碼這些金屬結(jié)合肽基因，用^99mTc-GH顯像可以間接反映其表達(dá)情況。酪氨酸酶基因也可以用來(lái)進(jìn)行RGI。在該基因編碼的酪氨酸酶作用下，酪氨酸被轉(zhuǎn)化成黑色素，后者與金屬（如¹¹¹In）具有高親和力，被轉(zhuǎn)染了該基因的細(xì)胞能夠濃聚¹¹¹In。此外PBC（peptide-based celae）肽，它具有同時(shí)與金屬螯合和與雙鏈DNA結(jié)合的性質(zhì)。因此可以將PBC與^99mTc螯合并與雙鏈DNA結(jié)合，被組裝在非病毒載體中，非病毒載體進(jìn)入細(xì)胞后與DNA分離，利用這種方法可以比較客觀的反映非病毒載體攜帶治療基因的能力。

二、光學(xué)技術(shù)

活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像（optical in vivo imaging）主要采用熒光（fluorescence）與生物發(fā)光（bioluminescence）兩種技術(shù)。常用的報(bào)告基因是螢火蟲熒光素酶基因和綠色熒光蛋白基因。光學(xué)成像的主要優(yōu)點(diǎn)是無(wú)輻射，可進(jìn)行實(shí)時(shí)、連續(xù)監(jiān)測(cè)，敏感性較高，且花費(fèi)相對(duì)較低，但由于光的穿透能力有限，僅為數(shù)毫米到數(shù)厘米，此外，由于散射的原因，光學(xué)成像的空間分辨能力有限，解剖定位能力較差，因此該技術(shù)目前多用于體表病變的觀察和小動(dòng)物成像研究。

1.熒光成像

最早出現(xiàn)的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是由下村修等人在1962年在一種學(xué)名Aequorea victoria的水母中發(fā)現(xiàn)，之后又在海洋珊瑚蟲中分離得到了第二種GFP。其中水母GFP是由238個(gè)氨基酸組成的單體蛋白質(zhì)，分子量約27kD，GFP熒光的產(chǎn)生主要是在氧氣存在下，分子內(nèi)第67位的甘氨酸的酰胺對(duì)第65位絲氨酸的羧基的親核攻擊形成第5位碳原子咪唑基，第66位酪氨酸的α-2β鍵脫氫反應(yīng)之后，導(dǎo)致芳香團(tuán)與咪唑基結(jié)合，這樣GFP分子中就形成對(duì)羧基苯甲酸唑環(huán)酮生色團(tuán)發(fā)出熒光。其基因所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，在藍(lán)色波長(zhǎng)（480nm）范圍的光線激發(fā)下，會(huì)發(fā)出綠色熒光。

作為一種新型的報(bào)告基因，GFP已在生物學(xué)的許多研究領(lǐng)域得到應(yīng)用。利用綠色熒光蛋白獨(dú)特的發(fā)光機(jī)制，可將GFP作為蛋白質(zhì)標(biāo)簽（protein tagging），即利用DNA重組技術(shù)，將目的基因與GFP基因構(gòu)成融合基因，轉(zhuǎn)染合適的細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，然后借助熒光顯微鏡便可對(duì)標(biāo)記的蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)活體觀察。由于GFP相對(duì)較小，將其與其他蛋白融合后不影響自身的發(fā)光功能，利用GFP的這一特性已經(jīng)加深了我們對(duì)細(xì)胞內(nèi)一些過(guò)程的了解，如細(xì)胞分裂、染色體復(fù)制和分裂、發(fā)育和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。許多新發(fā)展的光學(xué)分析方法已經(jīng)開始利用活體細(xì)胞來(lái)進(jìn)行藥物篩選，這一技術(shù)能從數(shù)量眾多的化合物中快速篩選出我們所感興趣的藥物。基于細(xì)胞的熒光分析可分為三類：即根據(jù)熒光的密度變化、能量轉(zhuǎn)移或熒光探針的分布來(lái)研究目標(biāo)蛋白如受體、離子通道或酶的狀態(tài)的變化。GFP是一個(gè)分子量較小的蛋白，易與其他一些目的基因形成融合蛋白且不影響自身的目的基因產(chǎn)物的空間構(gòu)象和功能。GFP與目的基因融合，將目的基因標(biāo)記為綠色，即可定量分析目的基因的表達(dá)水平，顯示其在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)位置和數(shù)量的變化，為探討該基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用及其分子機(jī)制提供便利條件。GFP融合蛋白的熒光敏感性遠(yuǎn)比熒光素標(biāo)記的熒光抗體高，抗光漂白能力強(qiáng)，因此更適用于定量測(cè)定與分析。但因?yàn)镚FP不是酶，熒光信號(hào)沒有酶學(xué)放大效果，因此GFP敏感性可能低于某些酶類報(bào)告蛋白。由于GFP熒光是生物細(xì)胞的自主功能，熒光的產(chǎn)生不需要任何外源反應(yīng)底物，因此GFP作為一種廣泛應(yīng)用的活體報(bào)告蛋白，其作用是任何其他酶類報(bào)告蛋白無(wú)法比擬的。

GFP基因是熒光成像技術(shù)常用的報(bào)告基因，由于其光譜范圍位于可見光能量較低的綠光部分，組織穿透深度有限；其發(fā)射熒光需要外在光源激勵(lì)；所獲影像信噪比低等不足促使了許多變體（如紅色熒光蛋白）及近紅外線（near infrared，NIR）熒光素的開發(fā)研制，目前最長(zhǎng)的波長(zhǎng)已達(dá)到700～900nm。特別后者是目前研究的熱點(diǎn)，這是因?yàn)椋孩龠h(yuǎn)超過(guò)GFP穿透1～2mm的深度；②NIR波長(zhǎng)區(qū)域血紅蛋白、水及脂質(zhì)對(duì)光子的吸收率最低，組織的自發(fā)熒光最小，所獲影像信噪比最高；③NIR探針，由一段蛋白酶特異性肽序列將NIR熒光素與傳送載體連接構(gòu)成，因熒光共振能量轉(zhuǎn)移機(jī)制在原始狀態(tài)不發(fā)出熒光信號(hào)，當(dāng)出現(xiàn)靶向蛋白溶解酶將其特異性肽底物劈裂時(shí)，熒光素與傳送載體分離，因而可釋放出高達(dá)幾百倍的熒光。這些探針能活體無(wú)創(chuàng)性檢測(cè)多種蛋白酶的活性、檢出疾病早期的病理現(xiàn)象并評(píng)價(jià)治療效果。

2.生物發(fā)光成像

生物發(fā)光成像也是廣泛應(yīng)用于小動(dòng)物全身成像的光學(xué)技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)是無(wú)自發(fā)熒光，所得影像的信噪比高，因此檢測(cè)的敏感性與特異性均較高。生物發(fā)光成像的機(jī)制是酶促反應(yīng)。報(bào)告基因主要有兩類：蟲熒光素酶基因Fluc和Renilla蟲熒光素酶基因Rluc。前者編碼550個(gè)氨基酸、61kD的單體蛋白，發(fā)光波長(zhǎng)為490～620nm；后者編碼36kD的單體蛋白。兩者的底物分別為D-蟲熒光素和coelenterazine。但是兩者作用機(jī)制不同，前者的酶促反應(yīng)需要ATP、Mg²⁺及O₂；后者則不需要共因子及ATP氧化底物。1995年，Contag首次在活體哺乳動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)到含Lux操縱子（由熒光素酶基因和其底物合成酶基因組成）的病原菌，在不需要外源性底物的情況下，發(fā)出持續(xù)的可見光。1997年，他又觀察到表達(dá)Fluc基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，注入底物熒光素（luciferin）后，熒光素酶蛋白與熒光素在O₂、Mg²⁺存在的條件下消耗ATP發(fā)生氧化反應(yīng)，將部分化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢姽饽茚尫牛捎谶@種生物發(fā)光現(xiàn)象只有在活細(xì)胞內(nèi)才會(huì)發(fā)生，而且發(fā)光強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目成正比，因此已被廣泛應(yīng)用于在體生物光學(xué)成像的研究中。

熒光素酶的每個(gè)催化反應(yīng)只產(chǎn)生一個(gè)光子，通常肉眼無(wú)法直接觀察到，而且光子在強(qiáng)散射性的生物組織中傳輸時(shí)，將會(huì)發(fā)生吸收、散射、反射、透射等大量光學(xué)行為。因此必須采用高敏感性的光學(xué)檢測(cè)儀器（如CCD照相機(jī)采集并定量檢測(cè)生物體內(nèi)所發(fā)射的光子數(shù)量，然后將其轉(zhuǎn)換成圖像。在體生物發(fā)光成像中的發(fā)光光譜范圍通常為可見光到近紅外光波段，哺乳動(dòng)物體內(nèi)血紅蛋白主要吸收可見光，水和脂質(zhì)主要吸收紅外線，但對(duì)波長(zhǎng)為590～1 500nm的紅光至近紅外線吸收能力則較差。因此，大部分波長(zhǎng)超過(guò)600nm的紅光，經(jīng)過(guò)散射、吸收后能夠穿透哺乳動(dòng)物組織，被生物體外的高靈敏光學(xué)檢測(cè)儀器探測(cè)到，這是在體生物發(fā)光成像的理論基礎(chǔ)。

在體生物發(fā)光成像中，采用熒光素酶光學(xué)信號(hào)標(biāo)記細(xì)胞，其顯著特點(diǎn)為：①體內(nèi)檢測(cè)的高敏感性；②極低的背景噪聲，極高的信噪比；③由于熒光素酶和底物的特異作用而發(fā)光，特異性極強(qiáng)；④單位細(xì)胞的發(fā)光數(shù)量很穩(wěn)定，分子標(biāo)記物隨目標(biāo)細(xì)胞的繁衍而增多，因此外部信號(hào)與動(dòng)物體內(nèi)的目標(biāo)細(xì)胞數(shù)成正比，不會(huì)隨細(xì)胞群體數(shù)目的增多而降低信號(hào)，可用于精確定量。因此，在體生物發(fā)光成像已經(jīng)成為研究活體動(dòng)物體內(nèi)成像的最為有效的方法；熒光素酶比綠色熒光蛋白更靈敏，但由于在體生物發(fā)光成像前，需對(duì)小動(dòng)物注射熒光素酶底物，導(dǎo)致很難反復(fù)長(zhǎng)時(shí)間成像，而且成像時(shí)間長(zhǎng)，因此在不追求高敏感性的情況下，可以選用在體熒光成像。

與熒光素酶等報(bào)告基因相比，綠色熒光蛋白作為活體組織中的報(bào)告基因具有明顯優(yōu)勢(shì)：①細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白的檢測(cè)僅需要激發(fā)光的激發(fā)，不需要加入底物進(jìn)行酶-底物反應(yīng)；②綠色熒光蛋白的表達(dá)與種屬無(wú)關(guān)，無(wú)論細(xì)胞的種類和位置如何，都能在細(xì)胞內(nèi)自主表達(dá)，無(wú)需其他外源的輔助因子；③綠色熒光蛋白對(duì)細(xì)胞和組織是無(wú)毒的，不會(huì)擾亂細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和功能；④綠色熒光蛋白能夠克服穿透、毒素、光漂白等不利因素。因此，在活體細(xì)胞中基因表達(dá)、蛋白質(zhì)定位和發(fā)育生物學(xué)研究中是極其有用的工具。但當(dāng)受到激發(fā)光激發(fā)時(shí)，生物體的皮膚、毛發(fā)和各種組織等會(huì)產(chǎn)生非特異性熒光，因此在體熒光成像具有較強(qiáng)的背景噪聲，其信噪比遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于生物發(fā)光。而且，激發(fā)光需要穿過(guò)生物組織到達(dá)靶點(diǎn)，發(fā)射光再經(jīng)過(guò)吸收、散射等大量光學(xué)行為從生物體內(nèi)透射出來(lái)，被體外探測(cè)器接收，路徑較長(zhǎng)，因此CCD探測(cè)到的信號(hào)水平取決于激發(fā)光的強(qiáng)度、發(fā)光細(xì)胞的數(shù)量、靶點(diǎn)的深度、生物組織的光學(xué)特性參數(shù)（如吸收系數(shù)、散射系數(shù)）等多方面因素，使得熒光強(qiáng)度很難精確定量，并獲得發(fā)光光源的精確位置信息。

三、MRI技術(shù)

與核素成像、光學(xué)成像技術(shù)相比，磁共振有著很高的空間分辨率和組織分辨率，可在清楚顯示組織解剖結(jié)構(gòu)的同時(shí)對(duì)深部組織的分子影像學(xué)特征進(jìn)行精細(xì)、準(zhǔn)確的定位、定量分析，MRI在分子影像學(xué)中的應(yīng)用主要包括基因表達(dá)與基因治療成像、分子水平定量評(píng)價(jià)腫瘤血管生成、顯微成像、活體細(xì)胞及分子水平評(píng)價(jià)功能性改變等方面，具有其他影像學(xué)技術(shù)不可比擬的優(yōu)越性。但是它具有敏感性低的缺點(diǎn)，需借助一個(gè)強(qiáng)大的擴(kuò)增系統(tǒng)來(lái)獲得滿意的圖像。分子成像需要解決幾個(gè)關(guān)鍵的問(wèn)題，即有效的高親和力成像探針，探針除具有合適的藥效學(xué)，還具有克服生物傳遞屏障（血管、組織間隙、細(xì)胞膜）的能力；合適的擴(kuò)增方法（包括化學(xué)或生物學(xué)方法）；敏感、快速而高分辨力的成像系統(tǒng)，其中制備特異性高親和力的靶向探針是活體分子顯像的關(guān)鍵因素。

目前MRI的報(bào)告基因主要有酪氨酸酶、β₂半乳糖苷酶與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因，但這些報(bào)告基因的MR成像都需要加入外源性的造影劑，這些物質(zhì)克服生物屏障，從血液、非特異組織中的清除是當(dāng)前報(bào)告基因成像所面臨的巨大挑戰(zhàn)。鐵蛋白基報(bào)告基因不依賴外源性的造影劑，擁有很大的優(yōu)勢(shì)和廣闊的發(fā)展前景，特別是由于MRI具有很高的空間和時(shí)間分辨率，因此MRI活體示蹤細(xì)胞方面也是一種非常有前景的技術(shù)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者做了不少這方面研究。但MRI的缺點(diǎn)主要是敏感性較差，其造影劑信號(hào)很難檢測(cè)，造影劑不能隨著細(xì)胞的分裂而自我復(fù)制，因此僅能示蹤細(xì)胞的早期過(guò)程，對(duì)示蹤后續(xù)的增殖和分化存在著一定的局限。

（1）轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TFR）及結(jié)合轉(zhuǎn)鐵蛋白（TF）：

利用轉(zhuǎn)鐵蛋白受體作為報(bào)告基因的研究用超氧化物微粒與轉(zhuǎn)鐵蛋白的復(fù)合物作為MRI分子探針。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體是鐵調(diào)節(jié)系統(tǒng)的一部分，該受體與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合（一種攜帶鐵的蛋白），并將其轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)。該受體的正常表達(dá)受負(fù)反饋調(diào)節(jié)以阻止細(xì)胞內(nèi)鐵的過(guò)多攝入。由于基因加工的細(xì)胞能過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白，因此能在胞內(nèi)聚集超氧化物微粒。鐵含量的增加在梯度回波T2WI產(chǎn)生明顯的信號(hào)改變。利用上述探針證實(shí)了可顯像轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達(dá)的假設(shè)，并成功獲得了轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達(dá)的MRI影像。

鐵蛋白在體內(nèi)的表達(dá)可以攝取組織中過(guò)多的鐵，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鐵離子的濃度下降，引起細(xì)胞代償性的增加對(duì)細(xì)胞外鐵的攝取量。鐵蛋白將攝取的鐵儲(chǔ)存在脫鐵蛋白中心的空腔中，形成一種超順磁性的氧化鐵顆粒，即水合氧化鐵，此結(jié)構(gòu)導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)、外場(chǎng)強(qiáng)的不均性，使T₂弛豫時(shí)間縮短。各種因素導(dǎo)致的MRI表達(dá)量的變化均可引起MRI信號(hào)改變，但鐵蛋白在不同的組織中結(jié)合鐵的能力是不同的，而且這種差異依賴于其結(jié)合鐵離子的形式是在正常條件下還是在鐵負(fù)荷條件下。有作者通過(guò)研究?jī)?nèi)源性鐵蛋白在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)與磁共振弛豫率的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)鐵蛋白表達(dá)水平與磁共振細(xì)胞顯像信號(hào)強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)。大量體內(nèi)、外研究表明，鐵蛋白的表達(dá)可以縮短MRI的T₂時(shí)間弛豫，但不同組織內(nèi)鐵蛋白表達(dá)量的差異和不同場(chǎng)強(qiáng)以及鐵的負(fù)荷條件等都會(huì)影響鐵蛋白所導(dǎo)致的MRI信號(hào)強(qiáng)度。

鐵蛋白作為報(bào)告基因也存在著其本身的缺陷，如MRI要求短時(shí)間內(nèi)要有足夠的鐵聚集才能引起MRI信號(hào)的改變，而隨著細(xì)胞的分裂，鐵蛋白攝取的鐵會(huì)逐漸被稀釋，但在短時(shí)間內(nèi)鐵蛋白攝取的鐵量不可能達(dá)到細(xì)胞分裂前的水平，這樣會(huì)影響成像的效果。另外，鐵蛋白所引起的對(duì)比成像還依賴于鐵的負(fù)荷指數(shù)，最初脫鐵蛋白結(jié)合鐵時(shí)引起R2升高，但當(dāng)鐵負(fù)荷達(dá)到一定程度時(shí)R2會(huì)下降，只有在較高鐵負(fù)荷的狀態(tài)下，其引起的弛豫率的增加才會(huì)保持穩(wěn)定不變。

（2）β-半乳糖苷酶：

以 β-半乳糖苷酶作為報(bào)告基因的研究應(yīng)用了1種叫“EgadMa”的分子探針，它由釓的不配對(duì)電子組成，周圍由1個(gè)化學(xué)箍環(huán)封閉以阻止其與水分子反應(yīng)，使得β₂半乳糖苷酶有活性的區(qū)域MRI信號(hào)明顯增加。MRI造影劑釓螯合物可影響磁場(chǎng)環(huán)境，改變氫質(zhì)子弛豫時(shí)間，增加弛豫率，而實(shí)驗(yàn)觀察表明，由于β-半乳糖可以阻斷釓螯合物內(nèi)部水的結(jié)合位點(diǎn)（阻斷約40%），它與釓螯合物形成的結(jié)合物會(huì)使弛豫率降低。當(dāng)應(yīng)用β-半乳糖苷酶水解此結(jié)合物后，釓螯合物被重新釋放出來(lái)，使弛豫率恢復(fù)。這樣，根據(jù)β-半乳糖苷酶水解反應(yīng)前后弛豫率的變化，用MRI可以監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)β-半乳糖苷酶的活性。Luoie等采用這種探針對(duì)蟾蜍胚胎干細(xì)胞編碼β₂半乳糖苷酶的LacZ基因的表達(dá)進(jìn)行MR成像，結(jié)果獲得了LacZ基因在蟾蜍胚胎干細(xì)胞表達(dá)的MRI影像。應(yīng)用β-半乳糖苷酶作為MRI的報(bào)告基因，使用釓螯合物由半乳糖，采用Gd31造影劑為對(duì)照劑。然而，在半乳糖苷酶的存在下，裂解的半乳糖單元的造影劑被釋放，導(dǎo)致對(duì)比度增加，作為報(bào)告基因，β-半乳糖苷酶具有低背景水平的優(yōu)點(diǎn)。

（3）酪氨酸酶：

酪氨酸酶在黑色素合成代謝中催化兩個(gè)主要反應(yīng)，是黑色素合成的限速酶，黑色素有較高結(jié)合鐵的能力。酪氨酸酶基因的過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致黑色素合成代謝增加，其結(jié)合鐵的能力相應(yīng)增加，從而導(dǎo)致MRI信號(hào)強(qiáng)度增加。在酪氨酸酶-黑色素系統(tǒng)中，酪氨酸酶是催化合成黑色素的關(guān)鍵酶，黑色素能與鐵高效結(jié)合，使MRI的T₁弛豫時(shí)間縮短，T₁WI信號(hào)提高。MRI信號(hào)的改變可反映酪氨酸酶基因的轉(zhuǎn)移與表達(dá)情況，據(jù)此可將酪氨酸酶基因作為標(biāo)記基因應(yīng)用于基因治療中。另外，利用黑色素及其前體的細(xì)胞毒作用，可將酪氨酸酶基因直接作為治療基因應(yīng)用于基因治療。

四、多模態(tài)報(bào)告基因顯像

醫(yī)學(xué)影像學(xué)技術(shù)發(fā)展的目標(biāo)是無(wú)創(chuàng)性獲得人體解剖、生理、分子、基因等多方面信息，以期準(zhǔn)確診斷疾病、早期評(píng)估療效。現(xiàn)有的各種影像技術(shù)各具特點(diǎn)，在臨床和基礎(chǔ)研究上都發(fā)揮著重要作用，眾所周知，不同的影像學(xué)方法均有優(yōu)缺點(diǎn)。核素顯像靈敏，但空間分辨率低；MR顯像軟組織對(duì)比度最佳，但是敏感性低；生物發(fā)光及熒光顯像有較好的敏感性和空間分辨率，但是穿透性差，臨床應(yīng)用仍需不斷探索。為了解決上面的問(wèn)題，近年來(lái)多模態(tài)分子影像發(fā)展方興未艾！應(yīng)用核素/MRI，核素/光學(xué)顯像等不同顯像模式進(jìn)行疾病聯(lián)合診斷，將各種影像模式的優(yōu)勢(shì)和特色融合兼?zhèn)洌瑢?shí)現(xiàn)多模式影像技術(shù)，正在成為影像領(lǐng)域發(fā)展的方向之一。目前，PET/CT和SPECT/CT已經(jīng)較為廣泛地應(yīng)用于臨床，核醫(yī)學(xué)所提供的功能影像加上CT的解剖結(jié)構(gòu)影像，能提供更加精確的定性與定量信息，提高診斷效率。此外，PET/MR、PET/超聲、PET/光學(xué)成像、SPECT/MRI、SPECT/超聲、SPECT/光學(xué)成像、PET/SPECT/CT等多模式影像的融合技術(shù)也逐步從研究階段向商業(yè)實(shí)用化方向穩(wěn)步發(fā)展，有可能成為臨床和基礎(chǔ)研究的重要方法和工具。

因此基于多模態(tài)影像方法的多模式報(bào)告基因系統(tǒng)也相繼出現(xiàn)。Ponomarev等用HSV1-tk/GFP雙報(bào)告基因成功監(jiān)測(cè)了T細(xì)胞在體內(nèi)的活性。Zinn，Chaudhuri等采用腺病毒載體將HSV-tk和hSSTR2、GFP和hSSTR2基因轉(zhuǎn)染后，進(jìn)行雙RGI像用于監(jiān)測(cè)皮下腫瘤。Ponomarev小組和Gambhir研究室將HSV-tk、eGFP、Fluc三種報(bào)告基因融合分別用于腫瘤的檢測(cè)和干細(xì)胞的檢測(cè)中。近年來(lái)國(guó)外還有一些學(xué)者采用復(fù)合模式的RGI在小動(dòng)物研究中獲得成功，多模式報(bào)告基因成像技術(shù)同樣可用于細(xì)胞治療的監(jiān)測(cè)。

作者課題組應(yīng)用三模態(tài)融合報(bào)告基因監(jiān)測(cè)急性心肌梗死模型骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療，在研究中構(gòu)建了多功能分子探針TGF（包含HSV1-tk、增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因eGFP和熒光素酶基因Fluc），將轉(zhuǎn)染該多功能融合基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到心肌梗死組織后可以分別應(yīng)用¹⁸F-FHBG行PET/CT顯像（圖14-7），同時(shí)還可進(jìn)行熒光成像和生物發(fā)光成像多模態(tài)報(bào)告基因顯像監(jiān)測(cè)（圖14-8）。

第三節(jié)　報(bào)告基因顯像的應(yīng)用

報(bào)告基因在基因表達(dá)調(diào)控和基因工程研究中處于非常重要的地位，它是作為外源目的基因能否轉(zhuǎn)化植物體的探路先鋒而首先被研究的，在研究植物的基因表達(dá)調(diào)控方面起著重要的作用，隨后逐步發(fā)展到真核生物的基因調(diào)控領(lǐng)域中。隨著基因工程技術(shù)日新月異的發(fā)展，報(bào)告基因已被廣泛用于研究細(xì)胞生物學(xué)，隨著報(bào)告基因顯像技術(shù)的逐步發(fā)展，現(xiàn)在可以直觀的用于基于表達(dá)和調(diào)控的可視化及分析。目前利用報(bào)告基因影像學(xué)技術(shù)可以無(wú)創(chuàng)性評(píng)價(jià)內(nèi)源性分子事件、無(wú)創(chuàng)性顯像轉(zhuǎn)基因表達(dá)的部位、幅度及持續(xù)時(shí)間從而定量監(jiān)控基因治療的轉(zhuǎn)導(dǎo)效能；評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)之間的相互作用；監(jiān)控以細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療中植入細(xì)胞的遷移、定位及存活等。

一、基因治療的監(jiān)測(cè)

遺傳病的基因治療（gene therapy）是指應(yīng)用基因工程技術(shù)將正常基因引入患者細(xì)胞內(nèi)，以糾正致病基因的缺陷而根治遺傳病。糾正的途徑既可以是原位修復(fù)有缺陷的基因，也可以是用有功能的正常基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞基因組的某一部位，以替代缺陷基因來(lái)發(fā)揮作用。基因是攜帶生物遺傳信息的基本功能單位，是位于染色體上的一段特定序列。基因治療目前主要是治療那些對(duì)人類健康威脅嚴(yán)重的疾病，包括：遺傳病（如血友病、囊性纖維病、家庭性高膽固醇血癥等）、惡性腫瘤、心血管疾病、感染性疾病（如艾滋病、類風(fēng)濕等）。基因治療是將人的正常基因或有治療作用的基因通過(guò)一定方式導(dǎo)入人體靶細(xì)胞以糾正基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用，從而達(dá)到治療疾病目的的生物醫(yī)學(xué)高技術(shù)。

基因治療研究雖然已經(jīng)非常廣泛，但目前臨床基因治療中仍有許多問(wèn)題沒有解決，如：①基因轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染是否成功；②轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染的基因是否分布到靶器官或靶組織，其分布是否最佳；③靶器官或靶組織內(nèi)轉(zhuǎn)基因表達(dá)是否可以產(chǎn)生足夠的治療效應(yīng)；④轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染的基因是否以足夠高的水平定位于其他器官或組織以誘導(dǎo)產(chǎn)生未預(yù)料的毒性反應(yīng)；⑤在與前體藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，轉(zhuǎn)基因表達(dá)的最佳時(shí)機(jī)以及啟動(dòng)前體藥物治療的最佳時(shí)機(jī)如何；⑥轉(zhuǎn)基因表達(dá)在靶組織或器官內(nèi)可持續(xù)多長(zhǎng)時(shí)間。靶組織采樣的基因表達(dá)分析可以獲得上述信息，但屬于有創(chuàng)性手段，為了評(píng)價(jià)基因隨時(shí)間的表達(dá)情況，需要進(jìn)行連續(xù)的多次活檢。由于能夠無(wú)創(chuàng)性進(jìn)行報(bào)告基因顯像，將報(bào)告基因與治療基因偶聯(lián)在一起后，通過(guò)評(píng)價(jià)報(bào)告基因的表達(dá)可間接評(píng)價(jià)治療性基因表達(dá)的位置、幅度及持續(xù)時(shí)間等信息，無(wú)疑在人類基因治療效果的監(jiān)控及評(píng)價(jià)有明顯優(yōu)勢(shì)。

報(bào)告基因本身可以是治療性基因，也可以與治療性基因偶聯(lián)在一起間接反映治療性基因表達(dá)的情況，前者如利用HSV1-tk的自殺基因治療就是一個(gè)實(shí)例；后者需要報(bào)告基因與治療基因在轉(zhuǎn)基因表達(dá)的水平上能成比例且恒定的表達(dá)。有以下策略可取得治療性基因與報(bào)告基因表達(dá)的聯(lián)系：①在兩個(gè)基因之間插入內(nèi)核糖體插入位點(diǎn)（internal ribosomal entry site，IRES）序列使其為同一啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)而轉(zhuǎn)錄為單個(gè)mRNA，但翻譯為兩種不同的蛋白質(zhì)。IRES元件能在雙順反子mRNA內(nèi)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過(guò)程，通過(guò)第一個(gè)順反子的帽依賴性翻譯和第二個(gè)順反子的非帽依賴性IRES介導(dǎo)的翻譯可使兩個(gè)基因共表達(dá)，但第一個(gè)順反子的帽依賴性翻譯較第二個(gè)順反子的非帽依賴性IRES介導(dǎo)的翻譯效率高數(shù)倍；②融合法，該方法將兩個(gè)或更多的基因結(jié)合在一起，其編碼序列被放置在同一個(gè)閱讀框架內(nèi)，因此可產(chǎn)生具有兩個(gè)原蛋白特征的單個(gè)蛋白，諸如HSV1-TK/GFP及DHRF/GFP；③利用同一載體內(nèi)不同的啟動(dòng)子連接不同的基因；④同時(shí)輸入在兩個(gè)載體內(nèi)克隆但由同一啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的兩個(gè)基因。如前述，目前融合報(bào)告基因顯像的研究受到了更多的關(guān)注，已經(jīng)有多種融合報(bào)告基因進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究并取得了令人滿意的結(jié)果。

基因治療將外源基因通過(guò)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將其插入患者的適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中，使外源基因制造的產(chǎn)物能治療某種疾病，其基于的引入方式于報(bào)告基因顯像一樣。分子影像和基因治療相結(jié)合，實(shí)際就是治療基因本身表達(dá)的可視化的成像技術(shù)。如單純皰疹病毒TK可將阿昔洛韋前體藥物向具有殺傷腫瘤細(xì)胞能力的化合物轉(zhuǎn)化，例如阿昔洛韋，更昔洛韋，噴昔洛韋。因此，單純皰疹病毒TK殺死目標(biāo)細(xì)胞時(shí)，這些前體藥物給藥的藥物濃度可以通過(guò)HSV1-tk基因表達(dá)的位置和多少由PET反復(fù)進(jìn)行監(jiān)控，顯像劑可以采用¹⁸F-FHBG或者¹²⁴I-FIAU。此外，放射性核素標(biāo)記的生長(zhǎng)抑素類似物如⁹⁰Y-奧曲肽已用于治療過(guò)度表達(dá)SSTR2基因的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，其位置和大小可以通過(guò)¹¹¹In-奧曲肽監(jiān)測(cè)。此外，NIS表達(dá)的報(bào)告基因顯像已經(jīng)用于甲狀腺癌及其監(jiān)測(cè)¹³¹I的治療中。NIS作為外源性治療基因也在進(jìn)一步的研究中，β射線殺傷靶細(xì)胞同時(shí)，也可用報(bào)告基因顯像來(lái)監(jiān)測(cè)。

利用雙順反子IRES法也在腺病毒載體介導(dǎo)的基因傳送鼠中成功進(jìn)行了心臟治療性基因表達(dá)的PET顯像。HSV1-tk基因表達(dá)PET顯像目前已應(yīng)用于臨床試驗(yàn)中。Jacobs等提出了第一個(gè)人類的PET圖像的HSV1-tk基因的表達(dá)，利用PET對(duì)5例腦膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行了活體HSV-tk基因表達(dá)顯像的臨床試驗(yàn)。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者，他們進(jìn)行HSV1-TK自殺基因治療，證實(shí)該基因在人腦膠質(zhì)瘤組織功能活躍。他們分別于治療前后運(yùn)用¹²⁴I-FIAU進(jìn)行了PET顯像，結(jié)果證實(shí)HSV1-tk基因成功轉(zhuǎn)染到人腫瘤體內(nèi)。利用PET可監(jiān)控體內(nèi)外源性基因的表達(dá)及隨時(shí)間的變化，并會(huì)對(duì)人體基因治療標(biāo)準(zhǔn)化參數(shù)的開發(fā)以及有效安全的載體應(yīng)用產(chǎn)生影響。近來(lái)，HSV1-TK/¹⁸F-FHBG PET用于可視化系統(tǒng)外源性的TK活動(dòng)后的HSV1-TK基因的腺病毒瘤內(nèi)注射到患者的肝細(xì)胞肝癌。在激活基因的啟動(dòng)子中，特定的DNA序列可以有針對(duì)性的轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶開始轉(zhuǎn)錄。特別在某些組織或細(xì)胞類型（組織/細(xì)胞特異性啟動(dòng)子）被激活的啟動(dòng)子用于基因治療。Honigman等采用在熒光素酶報(bào)告基因的生物發(fā)光成像監(jiān)測(cè)肝臟特異性（C/EBPb）的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型中的成骨細(xì)胞。使用人工PSA增強(qiáng)子/啟動(dòng)子控制表達(dá)的報(bào)告基因監(jiān)測(cè)前列腺特異核抗原（PSA）在前列腺癌細(xì)胞的組織特異性表達(dá)。此外，構(gòu)建治療和報(bào)告基因成像一體化的表達(dá)系統(tǒng)，可同時(shí)受外源化學(xué)物質(zhì)的定向誘導(dǎo)，如抗生素或激素治療，并在體內(nèi)以及體外細(xì)胞系統(tǒng)中可以通過(guò)HSV1-sr39tk基因和熒光素酶基因的監(jiān)測(cè)。

二、細(xì)胞標(biāo)記顯像

以細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療近年來(lái)得到廣泛關(guān)注，如利用干細(xì)胞治療不同疾病，如心肌梗死等顯示了較為滿意的效果，植入T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)以殺傷腫瘤細(xì)胞等，但植入后這些細(xì)胞是否定位于靶部位、是否存活并誘導(dǎo)了治療反應(yīng)等問(wèn)題都迫切需要尋找合適的方法解決。雖然組織采樣獲得標(biāo)本是評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)，但其有創(chuàng)性不適合多次連續(xù)的隨訪觀察。利用報(bào)告基因顯像技術(shù)可以無(wú)創(chuàng)性研究這些細(xì)胞的遷移、分布、定位及其時(shí)間動(dòng)力學(xué)過(guò)程。如Koehne等利用TK基因轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞后，監(jiān)控這些細(xì)胞在供體或HLA匹配的受體內(nèi)的靶向聚集及增殖。如免疫細(xì)胞和干細(xì)胞中有針對(duì)性的T-細(xì)胞的運(yùn)輸，使用熒光素酶的生物發(fā)光成像已被證明在幾種自身免疫模型，包括膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎，使用報(bào)告基因的分子成像也可以監(jiān)測(cè)目標(biāo)或治療細(xì)胞在體內(nèi)的分布。如用轉(zhuǎn)鐵蛋白對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記后用MRI可高分辨示蹤單個(gè)細(xì)胞，對(duì)其定位位置提供更直接的解剖印證，有望在造血干細(xì)胞移植、骨髓移植等細(xì)胞示蹤顯像中發(fā)揮更大作用。此外，通過(guò)報(bào)告基因顯像可以對(duì)免疫反應(yīng)的免疫應(yīng)答激活狀態(tài)無(wú)創(chuàng)性監(jiān)測(cè)。Ponomarev等轉(zhuǎn)染HSV1-tk/GFP融合基因進(jìn)入活化T細(xì)胞的核因子（NFAT）響應(yīng)的T-細(xì)胞系，裸鼠腫瘤中NFAT介導(dǎo)活化的T細(xì)胞可以通過(guò)¹²⁴I-FIAU PET顯像監(jiān)測(cè)。

干細(xì)胞可以分化成各種組織細(xì)胞，形成各種器官，干細(xì)胞移植治療作為治療組織壞死性疾病的重要手段，已成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療的一類重要方法，并越來(lái)越受到重視。特別是在細(xì)胞和基因的雙重治療過(guò)程中，干細(xì)胞移植梗死心肌后能存活多長(zhǎng)時(shí)間，是保持在移植部位還是遷移了，治療基因在體內(nèi)是否高表達(dá)，持續(xù)多久，諸多問(wèn)題直接影響干細(xì)胞治療效果，以往對(duì)干細(xì)胞的監(jiān)測(cè)和外源基因表達(dá)的評(píng)價(jià)，多是取心肌組織進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)、RT-PCR、Western blot等有創(chuàng)技術(shù)來(lái)分析，不宜推廣應(yīng)用，因此如何實(shí)時(shí)、無(wú)創(chuàng)、在體監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞移植效果極具意義，也是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)隨著分子影像技術(shù)的快速發(fā)展，體內(nèi)無(wú)創(chuàng)傷性監(jiān)測(cè)干細(xì)胞/基因移植治療成為可能，也是臨床首選。采用報(bào)告基因顯像體外監(jiān)測(cè)干細(xì)胞分化也有相關(guān)報(bào)道。如Hwang等采用NIS、Luc基因和神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）同一啟動(dòng)子調(diào)控的方法，轉(zhuǎn)染到神經(jīng)干細(xì)胞，在體外用環(huán)狀三磷酸腺苷誘導(dǎo)神經(jīng)分化后，可以同時(shí)采用核素和生物發(fā)光的方法進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

特別在缺血性心臟疾病的移植干細(xì)胞方面，報(bào)告基因技術(shù)用于體外監(jiān)測(cè)獲得了較大成功。如首先采用PET和小動(dòng)物PET的報(bào)告基因顯像比較客觀的對(duì)移植到小動(dòng)物（小鼠和大鼠）心肌內(nèi)的干細(xì)胞進(jìn)行定位和定量分析。Willmann等在大動(dòng)物（豬）上應(yīng)用臨床PET對(duì)心肌中移植人間充質(zhì)干細(xì)胞報(bào)告基因顯像的可行性報(bào)道。后來(lái)，隨著多模態(tài)的分子影像的逐漸發(fā)展，多模態(tài)的分子影像也成功的用于移植心肌內(nèi)的干細(xì)胞監(jiān)測(cè)。Higuchi等聯(lián)合應(yīng)用PET和MRI監(jiān)測(cè)大鼠心肌中移植細(xì)胞的存活和定位。

三、內(nèi)源性基因表達(dá)的顯像

報(bào)告基因影像學(xué)可用于顯示靶基因的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)及特異的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)間的相互作用。利用無(wú)創(chuàng)性影像學(xué)技術(shù)顯示活體動(dòng)物內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，可以更清晰地理解正常及癌有關(guān)的生物學(xué)過(guò)程。一些研究者設(shè)計(jì)特定的報(bào)告基因上游的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件，具有特定的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的控制特點(diǎn)。這些啟動(dòng)子也可以由特定的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子激活，并隨后啟動(dòng)特定的內(nèi)源性基因。這種策略被稱為作為cis-promoter/enhancer報(bào)告基因系統(tǒng)。一旦被激活，因?yàn)閮?nèi)源基因產(chǎn)物的表達(dá)或活化的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件，成像報(bào)告基因的表達(dá)被誘導(dǎo)。在靶細(xì)胞或組織內(nèi)的成像信號(hào)強(qiáng)度指示一個(gè)特定的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子，以及一個(gè)特定的內(nèi)源性基因的表達(dá)水平的活動(dòng)。這有利于監(jiān)控及評(píng)價(jià)新克隆的基因及新的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、比較不同技術(shù)所獲的影像、定量評(píng)價(jià)報(bào)告基因表達(dá)及其空間分布。基因表達(dá)的水平還受轉(zhuǎn)錄后，包括mRNA翻譯過(guò)程的調(diào)節(jié)。研究顯示利用PET及原位熒光活體顯像可顯示p53依賴的基因表達(dá)。通過(guò)在p53特異反應(yīng)元件控制下放置HSV1-tk及eGEP融合基因產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（cis-p53/tkeGFP）。研究證實(shí)DNA損傷誘導(dǎo)的p53轉(zhuǎn)錄活性上調(diào)，且與p53依賴的下游基因，包括p21的表達(dá)有關(guān)。這些結(jié)果在p53+的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中觀察到，但在p53-的骨肉瘤細(xì)胞中未觀察到，提示該方法可用于評(píng)價(jià)p53依賴性通路介導(dǎo)的新藥及其他治療方案的效果。研究顯示，報(bào)告基因編碼的報(bào)告蛋白及酶（DHFR-HSV1-TK）活性水平的升高發(fā)生在翻譯水平而非轉(zhuǎn)錄水平，這些效果可通過(guò)¹²⁴I-FIAU PET顯像顯示，并在荷載HCT-8種植瘤的裸鼠上證實(shí)。可以遇到的情況是，當(dāng)弱的啟動(dòng)子啟動(dòng)基因表達(dá)時(shí)，往往因其轉(zhuǎn)錄活性弱而影響內(nèi)源性基因表達(dá)的顯像效果，利用兩步轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增方法（two-step transcriptional amplification，T-STA）及intrans系統(tǒng)法可增強(qiáng)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，從而能增強(qiáng)在弱啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下基因表達(dá)的顯像效果。Doubrovin等使用HSV1-TK基因，Kim等使用NIS基因作為報(bào)告基因監(jiān)測(cè)激活p53的轉(zhuǎn)錄。有研究表明p53RE-hNIS的報(bào)告系統(tǒng)，其中hNIS的報(bào)告基因表達(dá)的人工增強(qiáng)p53的響應(yīng)的元件（p53RE）的控制下，與人肝癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)染。阿霉素用于加強(qiáng)內(nèi)源性p53的表達(dá)，阿霉素處理的細(xì)胞比未處理細(xì)胞中積累了更多的¹²⁵I。此外，阿霉素的劑量增加細(xì)胞內(nèi)的¹²⁵I攝取增加，且與p53水平有顯著相關(guān)性，通過(guò)Western印跡法測(cè)定。腫瘤異種移植這些細(xì)胞也顯示，阿霉素治療后增加了放射性核素積累。通過(guò)報(bào)告基因方法目前也進(jìn)行了其他特定內(nèi)源基因的研究，如熱休克蛋白和NF-κB。

四、可視化特定的生物學(xué)現(xiàn)象

無(wú)創(chuàng)性影像內(nèi)源性基因表達(dá)與細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)現(xiàn)象，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、核受體激活等具有重要的意義，可以可視化。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）的作用，可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)和腫瘤進(jìn)展，在斯隆-凱特琳癌癥中心采用報(bào)告基因技術(shù)進(jìn)行了TGF-β受體的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的成像。當(dāng)這種受體由TGF-β的約束時(shí)，它激活一個(gè)特定的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的結(jié)果是生產(chǎn)幾個(gè)特定Smad蛋白。將HSV1-tk/GFP與Smad蛋白的融合在同一啟動(dòng)子控制下的逆轉(zhuǎn)錄病毒中。該DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到腫瘤細(xì)胞，并使用小鼠異種移植模型進(jìn)行體內(nèi)成像，通過(guò)¹⁸F-FEAU PET的圖像證實(shí)Smad蛋白和TGF-β腫瘤中的受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)成功。雌激素和視黃酸核受體使用也可以采用cis-promoter/enhancer成像系統(tǒng)監(jiān)測(cè)，NIS和熒光素酶基因與一個(gè)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，在2個(gè)報(bào)告基因表達(dá)同時(shí)，視黃酸響應(yīng)元件將被監(jiān)測(cè)。So和Kang等分別在人肝癌細(xì)胞中通過(guò)表達(dá)這種DNA結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示維A酸治療后，維A酸NIS和熒光素酶基因的表達(dá)增強(qiáng)。在動(dòng)物腫瘤模型中，通過(guò)核素顯像和光學(xué)生物發(fā)光成像發(fā)現(xiàn)，¹²⁵I攝取和生物發(fā)光強(qiáng)度均增加。

五、腫瘤顯像

無(wú)創(chuàng)性的報(bào)告基因成像可以在基因?qū)用媪私獍┌Y的發(fā)展、轉(zhuǎn)移和治療，用于研究腫瘤細(xì)胞活性、激活、歸巢、增殖和分化。通過(guò)建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染報(bào)告基因的腫瘤細(xì)胞，可以采用影像學(xué)的手段在體外反復(fù)、連續(xù)的進(jìn)行監(jiān)測(cè)含有該腫瘤細(xì)胞系的動(dòng)物模型。此外，還可以對(duì)該動(dòng)物模型采用不同的療法干預(yù)，采用影像學(xué)的方法活體反復(fù)監(jiān)測(cè)，熒光素酶的生物發(fā)光是最廣泛使用的方法。Shin等構(gòu)建以MCMV為啟動(dòng)子含有hNIS和Fluc的人肝癌細(xì)胞的小鼠模型，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞數(shù)與核素的活性具有良好的相關(guān)性，hNIS基因的表達(dá)直觀地反映了肝癌細(xì)胞的數(shù)量；在進(jìn)一步的研究中，抗癌治療的效果與核素的活性及生物光學(xué)信號(hào)均有密切的相關(guān)性；報(bào)告基因反映的信息比單純的腫瘤重量更準(zhǔn)確，更真實(shí)地反映了腫瘤細(xì)胞的免疫活性等情況。近年來(lái)，在腫瘤基因治療的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，腫瘤的根除率及動(dòng)物的存活率均有所提高。但是，人體腫瘤基因治療的結(jié)果并不理想。產(chǎn)生這種差異的可能原因有很多，如轉(zhuǎn)基因未能有效地整合到腫瘤細(xì)胞中、轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)水平不夠高和表達(dá)持續(xù)時(shí)間過(guò)短等。報(bào)告基因能夠通過(guò)無(wú)創(chuàng)的手段對(duì)基因表達(dá)的水平、分布及持續(xù)時(shí)間等進(jìn)行監(jiān)測(cè)，為上述問(wèn)題的解決提供了廣闊的思路。

六、藥物篩選方面

報(bào)告基因的運(yùn)用對(duì)于發(fā)現(xiàn)新藥的效率起著至關(guān)重要的作用。由于轉(zhuǎn)錄因子和基因表達(dá)是藥物開發(fā)過(guò)程中的重要靶標(biāo)，在病毒感染、腫瘤、炎癥、免疫系統(tǒng)疾病中都有變化，但經(jīng)典基因表達(dá)的檢測(cè)方法比較復(fù)雜。如果將靶基因表達(dá)的調(diào)控序列與基因相連，轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)影像學(xué)技術(shù)可以動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)調(diào)控序列對(duì)轉(zhuǎn)錄因子和基因表達(dá)作用的部位和持續(xù)時(shí)間，可構(gòu)建合理的篩選模型，并將其轉(zhuǎn)染入特異的宿主細(xì)胞中，進(jìn)行具有激活靶標(biāo)活性的藥物的篩選。而在研究藥物的藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程中，可用報(bào)告基因標(biāo)記藥物，通過(guò)成像技術(shù)對(duì)其進(jìn)行時(shí)間和空間追蹤，從而分析藥物的生物利用度、排泄途徑、靶專一性、藥物分布以及靶的占用率等。報(bào)告基因成像技術(shù)提供了一種新的手段，加快了識(shí)別藥物靶標(biāo)和臨床前測(cè)試，無(wú)疑將加快藥物開發(fā)過(guò)程和純化，以減少?gòu)募?xì)胞到動(dòng)物和人類水平所需時(shí)間。如Cohen等將攜帶鐵蛋白基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，將這種細(xì)胞移植到免疫缺陷的小鼠，形成特異性的腫瘤模型；應(yīng)用MRI可以監(jiān)測(cè)帶有報(bào)告基因動(dòng)物模型在用藥前后腫瘤大小、轉(zhuǎn)移等情況的變化，從而反映新藥的效能。

七、蛋白質(zhì)間相互作用的顯像

對(duì)蛋白質(zhì)相互作用的分析可獲得未知功能基因的生物學(xué)作用，了解已知功能蛋白質(zhì)之間的新作用及新功能，這通常利用純粹的計(jì)算模型推導(dǎo)或利用大規(guī)模的蛋白質(zhì)組學(xué)方法獲得。無(wú)創(chuàng)性報(bào)告基因顯像為實(shí)時(shí)顯示蛋白質(zhì)間的相互作用提供了新的研究手段。已經(jīng)利用酵母雙雜交技術(shù)及冷卻充電偶聯(lián)設(shè)備照相機(jī)活體檢測(cè)Fluc表達(dá)，并證實(shí)MyoD和ID兩種蛋白質(zhì)的相互作用。Paulmurugan等還利用蛋白質(zhì)互補(bǔ)及復(fù)原的方法顯像蛋白質(zhì)間的相互作用。蛋白質(zhì)互補(bǔ)利用的是劈裂蛋白質(zhì)，如其彼此接近可再度完整。這種可恢復(fù)的、但未共價(jià)再偶聯(lián)的蛋白質(zhì)可作為功能性底物或完整的酶。蛋白質(zhì)互補(bǔ)介導(dǎo)Fluc活性恢復(fù)的原則是：Fluc的N末端通過(guò)很短的肽FFAGYC被附加到蛋白X上，而其C末端則通過(guò)肽CLKS與蛋白Y相連。蛋白X和蛋白Y相互作用通過(guò)蛋白的互補(bǔ)原則可恢復(fù)Fluc的活性。蛋白質(zhì)復(fù)原的方法基于蛋白質(zhì)拼接過(guò)程。劈裂的內(nèi)含子介導(dǎo)蛋白質(zhì)拼接導(dǎo)致Fluc活性恢復(fù)的原則是：Fluc的N末端通過(guò)肽FFAGYC與DnaE的N末端相連，而DnaE的N末端與蛋白X相連。同樣，F(xiàn)luc的C末端通過(guò)肽CLKS與DnaE的C末端相連，而DnaE的C末端與蛋白Y相連。蛋白X和蛋白Y相互作用通過(guò)DnaE的N末端和C末端的拼接而介導(dǎo)了Fluc活性的恢復(fù)。

八、其他

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因小鼠遺傳性分析、監(jiān)測(cè)細(xì)菌或病毒感染等方面，報(bào)告基因顯像技術(shù)均有幫助。Maggi等人通過(guò)小動(dòng)物報(bào)告基因顯像技術(shù)快速、無(wú)創(chuàng)性的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型是否成功建立。Gossen、Sacco和Wirth等人通過(guò)報(bào)告基因技術(shù)研究轉(zhuǎn)基因小鼠的基因是否發(fā)生突變。也有采用¹⁴C-FMAU的放射自顯影監(jiān)測(cè)的在大鼠腦組織中由單純皰疹病毒感染引起的腦炎，采用報(bào)告基因的方法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)菌的感染。

九、報(bào)告基因顯像應(yīng)用中存在的問(wèn)題

報(bào)告基因顯像屬于間接顯像，而無(wú)法直接運(yùn)用，目前研究中還存在一些明顯的問(wèn)題。如：①基因的免疫源性和基因突變帶來(lái)的問(wèn)題；②轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染的基因是否分布到靶器官或靶組織，其分布是否最佳；③轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染的基因是否以足夠高的水平定位于器官或組織；④報(bào)告基因轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染是否成功；⑤在細(xì)胞中，報(bào)告基因表達(dá)的最佳時(shí)機(jī)如何；⑥報(bào)告基因表達(dá)在靶組織或器官內(nèi)可持續(xù)多長(zhǎng)時(shí)間。這一系列問(wèn)題，也需要新的方法來(lái)解決。除了報(bào)告基因本身的一些問(wèn)題外，還存在報(bào)告基因載體選擇問(wèn)題，特別是報(bào)告基因進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)必須有合適的基因載體，目前常用的載體有非病毒載體和病毒載體兩大類。非病毒載體最常用脂質(zhì)體，通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染，缺點(diǎn)是大多數(shù)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染效率極低，而且都是瞬時(shí)表達(dá)。病毒載體主要有非逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，前者的代表是腺病毒載體，其優(yōu)點(diǎn)是容納堿基較大，但也是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，只能進(jìn)行早期示蹤；后者的代表有慢病毒載體，此載體為一種理想的載體，其攜帶基因可以整合到宿主細(xì)胞中，可建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，但其容納堿基數(shù)較少，出毒量較低，也限制了其發(fā)展。

小 結(jié)

報(bào)告基因顯像技術(shù)在分子影像學(xué)中起著重要作用，這些方法可以無(wú)創(chuàng)性研究轉(zhuǎn)基因表達(dá)的部位、幅度以及持續(xù)時(shí)間，從而可以指導(dǎo)基因治療過(guò)程；在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平的顯像以及蛋白質(zhì)間相互作用的無(wú)創(chuàng)性研究將有助于活體證實(shí)內(nèi)源性基因與特異蛋白質(zhì)的表達(dá)，作為基因組學(xué)與功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)的補(bǔ)充；在活體研究植入細(xì)胞的定位及分布過(guò)程可以更好地指導(dǎo)臨床干細(xì)胞治療及骨髓移植的順利進(jìn)行。然而這些技術(shù)目前絕大多數(shù)還處于臨床前研究階段，距離臨床應(yīng)用仍有一段距離。但是該領(lǐng)域內(nèi)的研究很有可能應(yīng)用于臨床，使更多的人從中受益。未來(lái)研究的著眼點(diǎn)不僅在于加大、加深小動(dòng)物報(bào)告基因顯像研究的深度與力度，更應(yīng)積極努力地將這些技術(shù)從實(shí)驗(yàn)室方法轉(zhuǎn)變?yōu)榕R床實(shí)用的顯像手段。

（蘭曉莉　裴之俊）

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