第十三章　反義顯像

20世紀70年代，約翰·霍普金斯醫學院和哈佛醫學院首先研究發現反義寡核苷酸（antisense oligonucleotides，ASON）能夠阻斷特異基因的表達。從此，出現了一門全新的基因工程技術-反義技術。它根據堿基配對原則，利用ASON與細胞內的基因或mRNA特異結合，封閉基因的轉錄或mRNA的翻譯，達到調節基因表達的目的。近年來，反義技術發展很快，已人工合成不同化學修飾的ASON作為核酸藥物，用于腫瘤、病毒感染、炎癥性疾病、遺傳性疾病和高血壓等的治療研究。將放射性核素標記人工合成的ASON，引入體內后通過堿基互補配對原則，與細胞內靶基因或mRNA特異性結合，利用顯像儀器顯示目的基因或基因過度表達的組織，形成了一種新的診斷方法-放射性核素反義顯像。

顯像技術的進步在反義顯像的發展過程中起重要作用。在眾多影像技術中，核素顯像由于其高敏感性、高選擇性和可行性被認為是最優選的技術。放射性核素的多樣選擇和放射性標記的反義寡核苷酸化學結合的多樣性是核素反義顯像的另一重要優勢。而且，隨著SPECT/CT和PET/CT的應用，使反義顯像在顯示基因表達的同時，獲得高分辨率的解剖信息。近年來臨床前小動物顯像技術（如micro-SPECT和micro-PET）的應用，也有助于反義顯像向臨床轉化的推進。本章主要介紹核素反義顯像的原理、核素標記反義探針的設計、反義顯像的現狀、面臨的主要問題以及發展前景。

第一節　反義靶向與核素反義顯像原理

1954年，Watson-Crick和Hoogsteen提出了DNA的雙螺旋結構模型和堿基互補原理。他們指出，DNA通常是雙股的，并以糖-磷酸酯骨架反平行走向。堿基按照腺嘌呤與胸腺嘧啶、鳥嘌呤與胞嘧啶的方式配對。這一核酸配對模型的提出對生物醫學的發展產生了跨時代的重要意義，其中一個創新理念就是于1967年Belikova提出的反義治療，即應用較短的寡核苷酸序列能與引發疾病基因的某些基因的DNA或mRNA序列特異性結合，從而使其得到抑制。

寡核苷酸（oligonucleotides，SON）是一類只有20個以下堿基的短鏈核苷酸的總稱，它是核酸（DNA或RNA）的基本組成部件，分子量為4 000～10 000D。ASON是未修飾或經化學修飾過的單股低聚物，他們設計為包含有與靶向核酸互補的序列。反義靶向的思想基于核酸的特異性互補配對，通過ASON與靶RNA進行堿基配對結合的方式參與對相關基因表達的調控。其作用方式可能有：

（1）反義DNA與mRNA結合形成互補雙鏈阻斷核糖核蛋白體同mRNA的結合，從而抑制了mRNA翻譯成蛋白質的過程。

（2）反義DNA能與靶細胞形成一種三鏈核酸，它通過作用于控制基因轉錄的轉錄子、增強子和啟動子區，對基因的轉錄進行調控。

（3）反義核酸與mRNA的結合可阻擋mRNA向細胞質的運輸。

（4）反義核酸與mRNA結合后使得mRNA更加易被核酸酶識別而降解，從而大大縮短mRNA的半衰期。

上述四種作用途徑都可表現為對基因表達的抑制或調節，且這種調節是特異的。

根據反義靶向的機制，將放射性核素標記在ASON上并作為示蹤劑引入人體，通過堿基互補配對原則在體內與目的基因特異性結合，通過合適的核素顯像設備，即可以在整體水平實現對病變組織進行基因表達的實時動態監測（圖13-1）。反義顯像顯示生物體內分子水平的變化，而許多疾病發生首先環節就是基因的改變，因此，反義顯像能夠達到更早期、更準確診斷疾病的目的。

第二節　核素反義顯像分子探針

自1994年Dewanjee等在荷瘤小鼠上首次進行完整意義上的核素反義顯像以來，經過多年的努力，反義顯像已經有了長足的進展。成功的核素反義顯像及探針的設計需要考慮以下一些要素：①制備能與目標基因發生特異性結合的反義寡核苷酸片段；②選擇適宜顯像的放射性核素及簡便有效的標記方法；③反義顯像需要ASON的穩定傳輸，要能抵擋酶（如核酸酶）的降解，還要在循環中保持對基質蛋白較低的結合率；④放射性標記的反義探針需要逃避機體免疫系統，在感興趣細胞中定位，并與靶向mRNA雜交；⑤反義顯像探針必須能在靶向位置停留較長時間，同時又能在非靶向器官和組織中快速清除，從而能在SPECT或PET顯像中獲得良好的對比度。盡管在顯像探針上進行了廣泛的探索，一些體外結果也顯示出積極的意義，但是實現體內顯像仍面臨很多挑戰。

一、反義寡核苷酸的選擇及設計

核素反義顯像是以堿基互補配對原則與目的基因特異性結合。從理論上講，只要靶組織中存在某種DNA或mRNA的過度表達，便可人工合成相應的寡核苷酸，制成核素標記的分子探針。但是，實際上，選擇合理的反義序列是一件耗時、耗資的工作。因為反義DNA對雙鏈區域的親和力較單鏈而言要弱得多，而為了增加穩定性和被翻譯調節蛋白識別，mRNA會在許多區域形成鏈內堿基對，形成諸如發卡、圓環、角形等復雜的二級結構，從而使反義機制更難發揮作用。反義序列通常都是針對mRNA中的單鍵區域來選擇，如啟動子及其鄰近序列、5′端或3′端非翻譯區域等，以減少二級結構的干擾。即便如此，這種選擇也不一定合適，因為蛋白質很可能結合這些區域以增加其穩定性，從而妨礙其與反義DNA的結合。ASON的設計還需要注意以下幾個方面：①應該避免含4個或4個以上的連續鳥嘌呤堿基，因為他們可通過Hoog-steen堿基配對形成G-四聚體，導致非反義效應。為了克服此問題，可對鳥苷酸進行修飾；②在設計體內實驗時，應避免含鳥嘌呤核苷酸（Cytosine-phospho-guanine，CpG）序列的ASON，因為堿基序列大多遵循5′端為2個嘌呤、3′端為2個嘧啶的原則，而CpG序列可激活多種免疫活性，引起非反義效應；③避免與靶基因外的mRNA雜交，可在網上進行BLAST匹配；④設計嚴格對照的ASON，常采用隨機序列對照（與ASON堿基組成相同、但隨機排列）、正義對照、顛倒序列對照、錯配對照（與ASON在個別點上堿基不同）等。

此外，反義抑制作用的特異性還取決于ASON的長度。這是由于ASON的長度直接影響到與靶基因結合的特異性、可接近性和穩定性、能否被內核酸酶識別、以及對細胞膜的滲透性等。ASON長度過短必將影響其結合的特異性，過長則易扭曲或形成二級結構，影響其與靶mRNA的結合。另外，ASON的長短還與反義探針制備成本高低呈正相關。眾所周知，細胞中每條核苷酸均含有4種不同的堿基，單倍體人基因組約含3 × 10⁹個堿基。從統計學計算，17～18個堿基序列長度將有一次出現的機會，并能較好地接近基因靶位，故當ASON的長度少于15個堿基對時則不顯示反義活性。因而，設計ASON時一般控制長度為15～20個堿基對。

二、反義寡核苷酸的修飾

作為顯像用途的反義寡核苷酸，除了序列特異性外，動物體內的穩定性也是其基本的要求。天然型反義寡核苷酸在體內及體外對核酸外切酶和核酸內切酶活性的降解極為敏感，一旦反義寡核苷酸被注射到動物體內，機體中的RNA酶就會使反義RNA的有效量迅速減少，同時剩下的沒有被降解的反義RNA也無法集中到病灶處，而是分散到動物全身。為了增加反義寡核苷酸的體內穩定性，人們對反義寡核苷酸骨架進行了多種化學修飾。

針對核酸的結構，修飾工作可從其骨架、核糖和堿基入手，也可在核酸片段的末端進行偶聯修飾。由于核酸酶的作用位點主要是核苷酸中的磷酸二酯鍵，因此主要對核苷酸的骨架進行修飾。包括對P-O鍵的修飾、C取代P、S取代P、將含N衍生物引入核苷酸骨架等。其中，以甲基化和硫代化的研究比較成熟。甲基化即用甲基（CH₃-P）取代羥基，硫代化即用P-S鍵代替P-O鍵。

硫代寡核苷酸（phosphorothioate oligonucleotides）是比較成熟、應用最廣泛的寡核苷酸。該結構中磷酸二酯鍵未結合的氧原子被硫原子取代，可以提高對核酸酶的抗性。研究表明天然結構的寡核苷酸在小鼠血清中8小時即有微弱降解，24～48小時內基本完全降解，而硫代寡核苷酸24小時內基本未降解，48小時后僅有微弱降解。體內注射天然結構寡核苷酸的血漿半衰期為幾分鐘，而硫代寡核苷酸為30分鐘至1小時。與天然結構寡核苷酸相比，硫代寡核苷酸與DNA或mRNA的親和力略有下降，但仍能有效干擾mRNA的加工和翻譯。硫代寡核苷酸多分布于高血流灌注的器官，在腎、肝、骨髓、脾中濃度高于其他組織，主要從尿中排出，少量經腸道排出。硫代寡核苷酸帶大量的負電荷或是因為硫原子的親脂性，使它可與血漿蛋白和細胞表面受體結合，導致非特異效應與免疫反應等副作用，在反義顯像中導致靶與非靶比值下降，降低圖像病灶與正常組織對比度，影響圖像質量。

混合骨架寡核苷酸（mixed-backbone oligonucleotides）是繼硫代寡核苷酸后的第二代寡核苷酸。它在不同的位置上包含不同的修飾，通常由天然DNA、含硫代磷酸酯的DNA、2′-O-甲基RNA和2′-O-烯丙基RNA中的兩種或兩種以上組合而成。2′-O-甲基RNA在混合骨架寡核苷酸中的位置與它的性質密切相關，將它置于3′或5′端的修飾穩定性顯著優于硫代寡核苷酸。混合骨架寡核苷酸減少了硫代磷酸二酯的數量，降低了由硫代引起的副效應，2′-O-甲基RNA/mRNA的雙鏈親和力增強，保留的硫代磷酸二酯鍵仍起到了抗核酸酶的作用。混合骨架寡核苷酸在大鼠血漿中保持至少6小時，體內組織分布及清除與硫代寡核苷酸相似，靜脈給藥后平均清除時間較長。

肽核酸（peptide nucleic acids，PNA）是第三代反義寡核苷酸。大部分寡核苷酸的修飾只在磷酸二酯鍵或糖環上進行，這是因為考慮到較大范圍的修飾會影響雜交特性。PNA用N-（2-氨基乙基）甘氨酸骨架代替整個糖-磷酸骨架，并保留了與DNA、RNA及肽核酸之間形成Watson-Crick配對的特性。PNA生物學性質穩定，不被普通的蛋白酶、肽酶和核酸酶降解，并可與DNA、RNA或肽核酸雜交形成非常穩定的復合體，具有更強的親和力和更好的特異性。肽核酸可大量人工合成。但肽核酸水溶性差，不易穿過細胞膜，是肽核酸應用的主要障礙。如果能夠通過受體介導等方式解決轉運問題，它將成為反義顯像領域很有前景的修飾結構。有關PNA體內應用與顯像的研究已有報道。

鑒于PNA水溶性差的特性，近期又研制另外一種ASON，被稱為鎖核酸（locked nucleic acid，LNA），它是一種特殊的雙環狀核苷酸衍生物，結構中含有一個或多個2′-O及4′-C-亞甲基-β-D-呋喃核糖核酸單體，核糖的2′-O及4′-C通過不同的縮水作用形成氧亞甲基橋、硫亞甲基橋或胺亞甲基橋，并連接成環形，這個環形橋鎖定了呋喃糖C3′-內型的N構型，不但降低了核糖結構的柔韌性，還增加了磷酸鹽骨架局部結構的穩定性。由于LNA與DNA/RNA在結構上具有相同的磷酸鹽骨架，故對DNA、RNA有很好的識別能力和強大的親和力。LNA有很多優點：①LNA與DNA、RNA互補的雙鏈有很強的熱穩定性；②具有抗3′脫氧核苷酸酶降解的穩定性；③水溶性好，能自由穿入細胞膜，易被機體吸收；④體內無毒性作用；⑤具有高效的自動寡聚化作用，合成方法相對簡單。

總之，在寡核苷酸中加入磷酸基、糖基或嘌呤、嘧啶修飾可顯著增強其抵抗核酸酶的能力，但與此同時，探針的穿膜能力和與靶序列的親和力也受到了影響。目前為止，在為數眾多的修飾結構中，沒有一種結構是非常完美的，每種都有其自身的優缺點。

三、放射性核素標記

單鏈和雙鏈的DNA、RNA以及反義寡核苷酸可標記上多種放射性核素用于體外評估。在早期的反義雜交技術中，大部分放射性標記是將³H、¹⁴C和³⁵S標記的核苷酸摻入到DNA或RNA分子上。盡管發射β射線的³²P或³⁵P已被用于體外雜交試驗，但是這些并不適用于在體顯像。

以SPECT或PET在體顯像為目的時，放射性核素標記SON或ASON的策略是十分有限的，因為寡核苷酸上只有C、H、O、N和P作為其主體元素。寡核苷酸主體中沒有金屬原子，不能直接被發射γ射線的核素所取代，造成SPECT顯像劑制備困難。以正電子發射核素標記時，¹¹C、¹⁵O和¹³N半衰期很短，難以在所需的時間內進行成功的標記和顯像。由于這些既已存在的特性，需要將ASON在3′或5′端進行化學修飾以適用于放射性標記，從而達到高產量、高比活度和高穩定的特性。選擇合適的放射性核素和適宜的標記方法是反義顯像必須考慮的一個重要問題。

（一）用于SPECT反義顯像探針的標記

用于SPECT反義顯像探針的核素一個重要條件是γ射線的能量和半衰期應適合進行放射性標記和顯像。¹¹¹In、^99mTc和¹²³I都是合適的放射性核素，也均已經用于反義探針的標記和反義顯像。相比之下，^99mTc由于具有理想的物理半衰期（約6小時），適于顯像的γ能峰（140keV），以及容易獲取、價廉易得等優點，而被廣泛應用于顯像研究中。

1.^99mTc標記

^99mTc標記ASON常用間接標記法。間接標記法是通過雙功能螯合劑將放射性核素與標記物偶聯起來。雙功能螯合劑猶如一座橋梁，一端連接要標記的目標化合物，另一端絡合放射性核素，在普通的條件下即可完成標記。通過雙功能螯合劑的應用，不改變標記物的特性，鍵合牢固，并且可以避免對標記物的損傷，達到核素顯像的要求。雙功能螯合物有環狀復合結構，可有一個放射性金屬離子與多齒配體螯合，因而生成的放射性核素螯合物可以與反義寡核苷酸穩定結合。目前有幾個^99mTc螯合物可以與反義寡核苷酸結合用于標記。包括二乙三胺五乙酸（DTPA）、巰基乙酰三甘氨酰-N-羥基丁二酰亞胺酯（NHS-MAG3）和肼基尼古酰胺（HYNIC）。DTPA及其衍生物用于對蛋白質（如抗體）的¹¹¹In及其他幾種核素的標記時效果很好，但用于^99mTc時則標記物不穩定。在標記寡核苷酸上已不常用，現在常用的是HYNIC和NHS-MAG3。

Hnatowich等的課題組開發了^99mTc標記ASON的螯合物HYNIC，經過偶聯螯合后，標記率約為60%。同一小組通過修飾的MAG3螯合物成功地將^99mTc標記PNA，且標記率達到70%，比活度可高達0.4Ci/μmol。Hnatowich用三種不同螯合物（DTPA、HYNIC和MAG3）用于ASON的^99mTc標記。三種方法的標記率不同，最高的是 HYNIC-ASON（60% ± 7.5%），其次為 MAG3-ASON（40% ± 5%），而DTPA-ASON的標記率小于10%。HYNIC和MAG3-ASON的比活度都高達2.3Ci/μmol，而 DTPA-ASON 則小于 0.14Ci/μmol。Hjelstuen等用MAG3-TFTP酯形成與ASON 3′己胺的結合，從而有助于^99mTc標記，此復合物比活度約2.8Ci/μmol，放化純高于97%。Liu M等在近期的研究中將靶向hTERT mRNA的ASON用雙功能螯合劑S-acetyl NHS-MAG3偶聯后標記^99mTc，室溫下反應15～30分鐘，標記率可＞ 70%，比活度達0.25Ci/μmol，純化后放化純＞ 96%。這些研究都意味著在反義顯像的^99mTc標記過程中螯合物及其修飾的重要性。

2.¹¹¹In標記

¹¹¹In也是反義寡核苷酸探針開發的重要核素，因為其具有較長的物理半衰期（2.8天），有助于研究ASON在體內的生物分布和轉歸。¹¹¹In以電子俘獲方式衰變并放射171keV和245keV的光子，可用于SPECT顯像。

Dewanjee等對¹¹¹In標記的寡核苷酸做了詳細研究，他們首選合成了與c-myc mRNA互補的15-mer ASON序列并連接了氨基，從而形成AHON，然后應用DTPA偶聯，將¹¹¹InCl₃與DTPA-AHON一起孵育30分鐘后，得到產率為45%～60%。Lewis M等用¹¹¹In標記PNA，他們用DOTA的一種新的衍生物Fmoc-K（DOTA）與PNA偶聯，證實這種螯合物能與PNA共軛的任何序列位點結合，標記探針放化純接近100%，比活度大于1Ci/μmol，這比Dewanjee MK等早先所報道的高很多，結論是對于¹¹¹In標記來說Fmoc-K（DOTA）比DTPA更好。然而，在另一研究中He Y等開發了將¹¹¹In與PNA標記的方法，為便于DTPA偶聯，他們將PNA加上賴氨酸標簽，HPLC純化后大約80%的PNA-DTPA標上了¹¹¹In。需指出的是DTPA偶聯ASON的標記簡便，而且不需要隨后的純化。

3.放射性碘標記

放射性碘也被用于SPECT反義顯像。¹²⁵I物理半衰期約60天，發射γ射線，最大能量為35keV；¹²³I具有相對短的半衰期（13.22小時），衰變的主要γ射線能量為159keV和27keV。兩者均已用于ASON標記及顯像。

Dewanjee M等優化了碘標記的條件，他們將ASON的5′末端用氨基己基團修飾，并用PMPITC與之結合，從而利于¹²⁵I標記。隨著孵育時間的延長，標記率隨之提升，產量可達50%～60%。而且，這種標記方法得到的比活度（80mCi/μmol）是應用碘直接標記法得到比活度（8mCi/μmol）的10倍。Dougan H等成功地用¹²³I標記了經錫烷基修飾的ASON，標記產量97%，比活度達15Ci/μmol。在另一項研究中，Kuhnast B等開發了鹵素標記反義寡核苷酸用于顯像研究的一個更廣泛和多功能的方法。這個方法基于硫代磷酸酯寡核苷酸的3′末端與鹵素苯乙酰胺化合物偶聯。這一偶聯方法成功應用于不同長度寡核苷酸的標記和包括¹²⁵I在內的多種放射性鹵素。

（二）用于PET反義顯像探針的標記

相對于SPECT來講，PET擁有更高的敏感性和空間分辨率，而且正電子發射核素可代替天然存在的原子，對放射性標記分子的行為改變更少。但是如前所說，PET核素半衰期短，要求更快的化學反應并進行隨后的PET顯像，而作為反義顯像分子探針，這又限制了其應用。采用快速標記和顯像克服或至少部分克服了這一限制，正電子反義顯像的應用仍然有可行性。

1.¹⁸F標記反義探針

¹⁸F是反義顯像中有前景的正電子核素，因為它有適度的半衰期（110分鐘）。上述¹²⁵I標記寡核苷酸的方法，最初由Kuhnast B等應用于¹⁸F標記ASON。他們用N-（4-［¹⁸F］-氟代）-2-溴乙酰胺的前體標記硫代磷酸酯寡核苷酸的3′端，用于¹⁸F探針的制備。類似的方法還包括應用 4-（［¹⁸F］-氟代）苯甲酸苯酯或 4-（［¹⁸F］-氟代）異硫氰酸苯酯標記5′己胺修飾的寡核苷酸。Pan D等報道了用5′-去氧-5′-［¹⁸F］-氟-O₄-甲基胸苷修飾寡核苷酸的5′結合處，從而得到放射性探針。這個方法的優勢是整個反應和后處理可在4小時內完成，這是應用¹⁸F等短半衰期核素的必要標準。Tavitian B團隊研發了PNA的¹⁸F標記的可靠方法，比活度高達1Ci/mmol。

2.¹¹C標記反義探針

¹¹C并不常用于反義寡核苷酸顯像，主要是因為20分鐘的短半衰期給化學合成、純化和顯像帶來時間上的限制。但是一些研究者開發了新型策略來克服時間上的限制。Kobori N等利用相比-NH和-OH來說¹¹C-乙基酮更易攻擊-NH₂基團的特點，將硫代磷酸酯寡核苷酸的5′己胺衍生物標記上¹¹C-乙基酮，比活度達到5Ci/μmol，得以實時觀察mRNA表達。在另一項研究中，Visser G等成功地用¹¹C-胸苷標記寡核苷酸。這些均表明¹¹C作為反義顯像的PET核素是可行的。

3.⁶⁸Ge/⁶⁸Ga標記反義探針

⁶⁸Ge/⁶⁸Ga發生器的設計和其商業化的最新進展使研究者恢復了對⁶⁸Ga標記PET顯像劑的興趣。⁶⁸Ga是¹⁸F有價值的替代核素，因為它不需要回旋加速器，使用更為方便。Roivaienen A等用應用大環螯合劑DOTA偶聯ASON后進行⁶⁸GaCl₃標記，標記反應在100℃下10min內完成，30分鐘時的放化純約99%，比活度約68mCi/μmol，標記探針室溫下4小時以上仍可保持穩定。隨后一些研究也應用同樣的螯合劑DOTA進行了成功的標記。

第三節　核素反義顯像現狀

自反義顯像概念提出后，國內外學者進行了一系列腫瘤反義顯像研究。Dewanjee MK在1994年首次進行完整意義上的反義顯像研究。他們以DTPA為螯合劑，用¹¹¹In標記與c-myc mRNA序列互補的15聚體硫代寡核苷酸為實驗組，以正義寡核苷酸作對照研究。結果表明，腫瘤細胞對ASON的攝取是對照組的10倍，攝取快、靶/非靶比值高。在體顯像時，注射后標記探針后0.5小時，8%～10%的硫代寡核苷酸聚集在瘤體內，而對照組不到1%。標記探針腫瘤/血和腫瘤/肌肉比值分別高達 3.55 ± 0.23 和 24.48 ± 3.27。這樣理想的結果至今沒有被重復獲得。

在此基礎上，隨著分子生物學的發展及反義顯像技術的改進，越來越多的學者投入到反義顯像研究中。1996年，Cammilleri S等通過在荷人NS2T2A1乳腺癌瘤體內注射¹²⁵I標記的與TGF mRNA互補的ASON，顯像發現注射標記物后1小時有15%注射容量（ID）在瘤體內，但是90%的放射活性在4小時內從腫瘤部位轉移至腸道和腎臟，24小時瘤體內僅殘留1%。雖然得到顯像，但是這次試驗沒有設置陰性對照組。Kobayashi H的研究團隊通過腹腔內注射¹¹¹In標記的c-erbB-2 ASON與胺樹枝狀聚合物或與生物素偶聯，在24小時能夠清晰顯示接種至裸鼠腹腔內的人SHIN3卵巢腫瘤，但這項研究同樣沒有設置陰性對照。Hantowich DJ團隊長期致力于反義顯像，他們的其中一項肽核酸（PNA）顯像的研究顯示，^99mTc-PNA體內穩定性更高，代謝動力學更適合于體內顯像。在小鼠左側腿部肌肉注射含靶PNA的聚苯乙烯磁珠，右側腿部注射不含PNA的磁珠作對照。尾靜脈注射^99mTc-PNA后2.5小時和24小時體內分布研究結果顯示，PNA在體內清除非常快，半衰期約2小時，注射后2.5小時，腎的最大攝取只有1.5%ID/g，24小時所有取樣組織的總放射性不到0.07%ID/g。經腹膜注射^99mTc-PNA，23小時全身顯像只有腎、膀胱顯影，左側腿部模型組織/右腿部放射性比值達6∶1。通過這一實驗巧妙地證實反義雜交理論在體內仍是可行的。

國內也開展了一系列腫瘤反義顯像研究。謝娟等應用^99mTc標記c-erbB2 ASON并與表皮生長因子連接，進行裸鼠乳腺癌顯像。結果顯示瘤體部位攝取核素明顯高于對照組，該反義探針是利用表皮生長因子的配體/受體的特異性識別作用，增加反義寡核苷酸的靶向型和特異性，使反義探針更多地分布到腫瘤組織中，以實現對c-erbB2基因高表達的乳腺腫瘤的顯像。高再榮等應用NHS-MAG3作為螯合劑標記survivin反義寡核苷酸進行肝細胞癌顯像也獲得了成功。研究顯示注射顯像劑^99mTc-MAG3-survivin ASON后0.5小時腫瘤組織已開始顯影，顯像劑在腫瘤組織內的聚集程度隨時間延長而逐漸增加，于4小時達到最大，腫瘤/對側肢體肌肉比值分別為2.48 ± 0.44（體外顯像）和3.35 ± 0.57（生物學分布）（圖13-2）。王榮福等報道用DNA合成儀將酪胺連接在免疫球蛋白重鏈V1家族框架（IgHV1FR）mRNA反義寡核苷酸（FR-ASON）的5′端，氯胺-T法進行¹²⁵I標記，標記率為80.7%，放化純度為98.7%。標記的FR-ASON對淋巴瘤具有更好的識別特異性，體外穩定性好，為下一步淋巴瘤反義顯像或反義治療奠定了實驗基礎。付鵬等應用^99mTc標記p53基因的最直接調節基因MDM2 mRNA的反義寡核苷酸及錯義寡核苷酸，荷乳腺癌裸鼠SPECT顯像結果示，脂質體包裹的反義探針1小時即能在腫瘤病灶內清晰顯示，隨時間延長，腫瘤/骨骼肌放射性比值逐漸增加，病灶顯示更清晰。增殖細胞核抗原（PCNA）是一種細胞增殖性基因，能促進細胞的增殖分化。張艷榮等應用NHS-MAG3作為螯合劑標記PCNA反義寡核苷酸在卵巢癌細胞中發現，反義探針能被增殖旺盛的腫瘤細胞選擇性攝取，并能抑制細胞增殖以及顯著抑制PCNA mRNA的表達，說明反義寡核苷酸在標記后能特異性結合于目的基因序列并能產生反義作用，這項研究證實了反義顯像的理論依據。

除將反義顯像應用于腫瘤早期診斷外，張永學課題組還觀察到PCNA反義探針能特異性地聚集于增殖旺盛的血管平滑肌細胞中，這一體外實驗為進一步將反義探針應用于動脈粥樣硬化斑塊的顯像診斷奠定了充分的研究基礎。他們先后應用^99mTc標記c-myc ASON及PCNA ASON證實在動脈粥樣硬化斑塊中的顯影（圖13-3），從而為易損動脈粥樣硬化斑塊的早期無創診斷開創了一種新的方法。這些研究說明反義顯像不只局限于腫瘤診斷方面，在其他疾病的診斷中仍有廣闊的空間。

第四節　核素反義顯像存在的主要問題

隨著核素標記技術的多樣化以及分子生物學技術的進步，反義顯像的概念已在體外細胞實驗中闡明，并初步成功地在體內顯像中展現。但是，在體反義顯像仍存在諸多困難，包括ASON的體內穩定性、標記探針向靶細胞的傳遞和轉運、與靶向mRNA的特異性結合以及靶向mRNA的濃度影響等，其中最為重要的因素之一是核素標記ASON內化進入細胞后與靶向mRNA雜交能力不足。

一、體內反義寡核苷酸的穩定性

盡管天然的寡核苷酸有較好的雜交潛力，但在體內血漿中穩定性卻有變化，半衰期從低聚核糖核酸的數秒，到寡二核苷酸的數分鐘。為了解決這一問題，需要在盡可能保留其原始序列與它們同類物質相近的基礎上，對寡核苷酸的骨架進行化學修飾。這些修飾方法已經在前面反義寡核苷酸修飾中作了詳細介紹，在此不再贅述。可以得出的結論是，這些新型化學修飾方法的應用，對體內ASON的穩定性確實有深入的影響，并會引起ASON體內藥代動力學和生物分布的改進。

另外，標記過程中應用雙功能螯合劑以及放射性核素的選擇都可能會對體內穩定性產生影響。Goodchild J和同事應用³²P標記一種ASON靜脈注射到兔子時，其被完全降解，而這一標記探針在體外與新鮮抽取的家兔和人血液孵育時卻十分穩定。一些在體外穩定、或者根據化學性質預測體內穩定而進行化學修飾的標記探針，體內穩定性結果可能不盡相同。因此，對于雙功能螯合劑的選擇及標記的過程中包括pH值、反應時間、溫度等可能仍需要更多的實驗研究。

二、核素標記ASON的體內靶向特征

到目前為止，研究人員已經通過一系列體外細胞實驗及在體顯像等各種方法證實反義顯像發生的機制是反義技術。但是需要注意的是，一些在體外得到陽性結果的核素標記ASON探針，在體內并不能得到同樣的結果。標記探針在體內的藥代動力學和組織生物分布、反義寡合甘酸的骨架、長度及溶解度、ASON與血漿的結合能力、靶組織/細胞中mRNA的濃度等都是影響核素標記ASON體內靶向性的重要因素。

標記探針在體內的藥代動力學和組織生物分布是靶向功能的重要影響因素之一。由于ASON體內穩定性差，就需要更為嚴格的藥代動力學參數以滿足反義靶向作用的需要。評估標記反義探針在生物體內的藥代動力學時，必須要考慮這一探針在所有組織器官中的穩定性、特異性/靶向能力、細胞內化功能以及溶解特性等。另外，標記探針衍生物在體內的清除也很重要。有研究表明，磷酸二酯ASON在幾分鐘之內從血液中快速清除，其主要的放射性聚集在腎臟和肝臟。硫代ASON具有雙向血漿清除率，在1小時內的短期清除，隨后是長達1～2天的二次清除。PNA衍生物在血漿循環穩定性好，經腎臟快速清除。此外，ASON的長度也與其在體內的生物分布密切相關。

為了更好地了解各種不同核素標記反義探針的特性，Tavitian B等在猴子體內應用3′-末端-¹⁸F標記的寡核苷酸，研究重點是評估磷酸二酯、硫代和2′-O甲基RNA類似物之間的差異。他們的數據證實反義寡核苷酸的靶向雜交能力與放射性核素標記的方法無關，但ASON的骨架改變確實引起藥代動力學和組織分布的改變。

反義寡核苷酸的溶解度影響核素反義探針在細胞間的運輸。通常，因為放射性標記的寡核苷酸脂溶性差，他們無法有效地穿過細胞膜。而且，莖環或發夾結構的RNA形成復雜三維結構，這些結構會明顯限制體內ASON與互補鏈的雜交。在Stein C報告中指出，只有6%～12%靶向的RNA序列可以達到“反義效應”。

一些ASON（如硫代ASON）可以與血漿蛋白結合，對標記探針的靶向作用產生明顯的影響。研究發現，光活化磷酸二酯ASON與細胞培養時，90% ASON與高分子量（75～79kD）的細胞膜蛋白結合。de Vries等人證實，¹⁸F標記誘導型一氧化氮合酶（iNOS）的ASON在細胞中有較高的非特異性結合，從而阻礙其與iNOS mRNA特異性靶向雜交而影響顯像。

靶組織/細胞中mRNA的濃度不夠高，以致難以通過反義雜交成像顯示出來，這是很多研究者關注的問題。盡管在感染細胞中病毒-RNA的數量充沛，但一般來說，編碼特定蛋白的信使RNA（mRNA）數量往往并不充足。一個典型的哺乳動物細胞只包含皮克水平的RNA，經過計算這差不多相當于每個細胞內有30萬～50萬個RNA，而其中mRNA只占很小部分，而且根據細胞功能不同mRNA可能多達11 000種。有研究表明，反義顯像中靶向mRNA的數量應占細胞內總mRNA含量的3%，而細胞內其他種類的mRNA需小于0.01%。

假設在每個細胞中只有一種靶mRNA，而且只通過特異反義結合原理聚集ASON，在^99mTc標記22個堿基ASON（分子量約6 000D）且比活度約100μCi/μg時，以每克組織中有10⁸個細胞計算，那么每克靶組織中只能聚集10^-6μg或0.000 1μCi核素反義探針。在應用正電子核素標記時，假設比活度在10 000μCi/mmol（2 000μCi/μg）時，每克靶組織中的聚集量約0.002μCi。顯然與周圍本底相比，靶組織中這樣低的核素量是難以獲得顯像的。因此，反義顯像通常用于顯示的靶向mRNA是過量表達的，通常在每個細胞中超過100個拷貝。而且，隨著標記技術的提高，核素標記ASON的比活度也在不斷提高。假設在每個細胞中有100個靶向 mRNA，^99mTc標記的比活度在 100 000μCi/μg，那么每克靶組織中可以濃聚10μCi核素探針。這高于常規腫瘤顯像中^99mTc標記抗體而得到的結果，后者每克腫瘤組織中聚集探針最高達到0.01%注射劑量，大約為2μCi/g。以同樣的假設，應用正電子核素標記ASON時，在標記探針比活度為2 000μCi/μg 時，在每克靶組織中約有 0.2μCi。盡管這一數值遠低于^99mTc標記探針，但是由于PET顯像的高敏感性，理論上顯像仍可行。當然，由于不同標記探針體內藥代動力學的差異以及細胞膜轉運的各異，在低拷貝數目時，靶組織不可能聚集足夠核素標記探針，計數率也因此下降。但無論怎樣，上述數據還是證明了反義顯像是可行的。

動力學參數在反義顯像的靶向雜交能力評估中也十分重要，這主要是由于顯像成功的因素中還包括給藥途徑、清除速度以及在靶組織中的選擇性聚集。Nakamura K等人發現，當靜脈注射核素標記ASON于荷KB-G2腫瘤小鼠中時（此腫瘤過度表達MDR1 mRNA），僅有約400個ASON聚集在腫瘤中，而當將標記探針直接注入腫瘤內時，大約有60 000個ASON在腫瘤中聚集。他們認為數量的差異是由于靜脈注射和瘤內注射時，標記探針到達靶組織中的數量不同。

三、核素標記ASON的體內轉運

合適的轉運系統在反義顯像中十分重要。無修飾ASON在細胞內的攝取是由于主動轉運，然而內化作用在許多細胞中十分緩慢而且呈溫度依賴性。也有研究報告顯示，無修飾的ASON（如硫代ASON）很大一部分與細胞表面蛋白相互作用，而內化的小部分ASON在進入到溶酶體時就終止內化，這樣使得mRNA在細胞質或細胞核內的靶向雜交成為困難。ASON還可以通過吸附作用、內吞和胞飲作用進入細胞，只是進入細胞的比例依賴于ASON的濃度、細胞類型和活性狀態。ASON如何更好地定位于靶組織并穿透細胞膜進入細胞是非常重要的。

增加ASON在細胞中轉運能力的一個策略是將ASON偶聯穿膜肽或轉運肽。Pooga M等人應用細胞轉運肽與PNA偶聯轉運至大鼠細胞中，成功地抑制功能性基因的表達。Rosi N等開發了一種金納米粒子-ASON聚合物，促進細胞內基因的調控。這一納米粒子聚合物不易被核酸酶降解、對細胞無毒性，而且在多種細胞攝取實驗中，顯示比未修飾ASON結合力高得多的特性。

目前基因治療中載體優勢潛能已被證實，如使用逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒感染、陽離子脂質和脂質體載體等。據推測病毒載體較其余非病毒載體在介導DNA進入細胞時更有優勢，但其在顯像中的應用可能受到限制。主要原因是DNA不能迅速、有效地與載體偶聯，而放射性核素半衰期是有限的。另外病毒存在毒性，如腺病毒對其要整合的DNA有一定免疫源性，逆轉錄病毒則可能誘導基因突變。在健康人群中使用有潛在毒性的載體也是不能被接受的。

目前在顯像中能夠應用的載體是陽離子脂類和脂質體。兩者均可穩定連接寡聚核苷酸中的陰離子，也可保護核酶，并且簡單的混合即可達到成功的連接。目前陽離子脂質體較陽離子脂類更有優勢。脂質體是由脂質雙分子層組成的環形封閉囊泡，低毒、無免疫原性，可攜載各種反義寡核苷酸，保護其不被核酸酶降解。脂質雙分子層可以便捷的將脂類與具有陰離子活性的DNA相連接，也可以方便的與陰離子活性的動物細胞包膜相連接，從而提高細胞包膜轉運。張永學課題組的系列研究中，應用脂質體包裹^99mTc-Survivin ASON和^99mTc-PCNA ASON后，腫瘤細胞（肝癌細胞和卵巢癌細胞）對標記探針的攝取率明顯增加，大大高于未處理組。有研究表明，在脂質體介導下，血液循環中的反義寡核苷酸至少在24小時內保持完整，而單純反義寡核苷酸5分鐘后將不能被檢測到。由于反義寡核苷酸與脂質體結合后主要集中在細胞核，而單純反義寡核苷酸則主要位于細胞質中，因而脂質體改變了其在細胞內的分布，使反義寡核苷酸在細胞核內的作用時間延長。需要注意的是，脂質體自身亦有一定的毒性，當脂質體的濃度高于20μmol/L時具有細胞毒性。

受體介導的反義寡核苷酸的轉運技術也越來越受到重視。受體介導的細胞吞噬作用是20世紀70年代發現的細胞轉移特異性外源物質進入胞內的一種方式。利用受體介導來特異性轉移反義寡核苷酸有助于反義顯像。受體介導的吞噬作用有兩個明顯特點：①具有細胞、組織或器官專一性；②配體進入細胞的轉移效率很高。

未來發展方向

盡管應用核素標記ASON分子探針在體外和在體顯像中均取得了令人振奮的結果，但是所有的研究還都僅限于細胞及動物實驗階段，將反義顯像轉化至臨床仍有很多工作需要開展。這包括簡化ASON探針合成、化學修飾及核素標記過程，增加探針體內穩定性，強化與靶mRNA特異性雜交能力等。在體顯像還需滿足標記探針克服體內轉運過程中的生物屏障、準確的體內靶向定位、體內信號放大、在靶組織中有效的滯留和在非靶組織中迅速清除等條件。幾乎所有疾病的產生都是由于基因異常表達或表達產物的功能異常所導致。理論上，反義顯像能在基因水平診斷包括腫瘤、遺傳性疾病、炎癥、病毒感染等很多疾病，這一巨大的應用前景值得對反義顯像進行更為深入的研究和探索。

（蘭曉莉）

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