第九章　微流控芯片在分子影像藥物制備中的應用

第一節　微流控芯片簡介

微流控學（microfludics）是在微米級結構中操控納升至皮升體積的技術與科學，是近十多年來迅速崛起的新交叉學科。流體在微流控芯片微米級通道中，由于尺度效應導致了許多不同于宏觀體系的特點，例如分子間擴散距離短、微通道的比表面積大、傳熱和傳質速度快等特點。

自20世紀90年代初Manz和Widmer提出了以微機電加工技術（microelectromechanical systems，MEMS）為基礎的“微型全分析系統”（miniaturized total analysis systems，或 micro total analysis systems，μTAS）。其目的是通過化學分析設備及化學合成裝置微型化與集成化，最大限度地把化學實驗室的功能轉移到便攜設備中，甚至集成到一定尺寸的芯片上。因此μTAS也被通俗地稱為“芯片實驗室”（lab-on-a-chip，LOC）。其中微流控芯片（microfluidic chips）是μTAS中最活躍的領域和發展前沿，最集中體現了將化學實驗室的功能轉移到芯片上的思想，該技術是一個多學科交叉的結果，既依賴于許多化學分析及合成技術的發展，也依賴于微加工技術的支持與發展，同時還依賴于應用對象（當前主要是醫學和生命科學）的發展和融入。除此之外，材料、電子、光學儀器、計算機等科學領域的發展與介入也是其取得不斷進展與成功所不可缺少的條件。

微流控芯片在化學分析和合成設備的微型化、集成化及便攜化方面的巨大潛力促進了其在化學、生物醫學、藥物合成篩選、環境監測、司法鑒定、衛生檢疫等眾多領域的應用。例如，在生物醫學領域，由于微流控芯片大規模平行處理的能力，很可能使其在人類基因組計劃的進一步研究中發揮核心作用，從而成為后基因組時代的支撐性技術；在化學合成、新藥篩選和開發領域，利用微流控芯片高通量、大規模、平行性等特點，可以大規模地比較各種合成路線和條件，省略大量的初步合成實驗和動物實驗，從而縮短研發周期，加快新藥的研究開發過程；在司法鑒定領域，應用便攜式微流控芯片檢測裝置，可以在犯罪現場檢測疑犯遺留下來的唾液、血液、毛發等，并立刻與基因指紋庫系統儲存的DNA進行對比，從而準確、快速破案。

一、μTAS分類

當前μTAS可分為芯片式與非芯片式兩大類，其中芯片式是發展重點。在芯片式μTAS中，依據芯片結構及工作機制又可分為微陣列（生物）芯片和微流控芯片，前者以微通道網絡為結構特征，后者則以微探針陣列為結構特征。微流控芯片的目標是把整個化驗室的采樣、稀釋、加試劑、反應、分離、檢測等功能集成在可多次使用的微芯片上，因此較微陣列芯片有更廣泛的適用性及應用前景。

二、微流控芯片特點

1.具有極高的效率 許多微流控芯片可在數秒至數十秒時間內自動完成合成、分離、測定等復雜操作，速度常高于相對應的宏觀方法1～2個數量級。其高分析或處理速度既來源于微米級通道中的高導熱和傳質速率（均與通道直徑平方成反比），也直接來源于結構尺寸的縮小。

2.試樣與試劑消耗極低 通常已低至數微升水平，目前隨著技術水平的提高，已經可以進一步減少到納升水平，既降低了貴重試劑和試樣消耗，也減少了環境污染。

3.用微加工技術制作的微流控芯片部件的微小尺寸使多個部件與功能有可能集成在數平方厘米的芯片上。在此基礎上易制成功能齊全的便攜式儀器，用于各類現場合成與分析。

4.微流控芯片的微小尺寸使材料消耗甚微。當實現批量生產后，芯片成本可望大幅度降低，從而有利于普及。

5.在目前發展階段的微流控芯片仍存在系統總體上既不夠“微”，功能上也遠達不到“全”，制作成本還難以滿足推廣應用的要求等缺點和不足。

三、微流控芯片分類

1.根據芯片材料的不同可分為

①硅芯片；②玻璃芯片；③石英芯片；④高聚物芯片；⑤硅-玻璃、硅-石英、玻璃-高聚物等復合材料芯片。

2.根據功能不同可分為

①高分辨分離芯片；②微采樣（進樣）芯片；③微檢測（傳感器）芯片；④細胞分析芯片；⑤前處理芯片；⑥化學合成芯片；⑦多功能集成化芯片。

第二節　微流控芯片在分子影像顯像劑中的應用

一、微流控芯片在有機合成方面的優勢

在微流控芯片中進行合成反應的研究已經成為微流控芯片和合成化學領域中新的研究熱點之一。自1997年國外學者首次報道了微流控芯片作為一種微反應器在有機合成中的應用之后，微流控反應器（microfluidic reactors）已成功地用于合成多種有機化合物，并迅速成為當今有機合成化學的一項新技術。與常規化學反應器相比，微流控反應器具有以下特點：①微通道的寬度和深度小（一般為幾十到幾百微米），反應物間的擴散距離大大縮短，傳質速度極快；②微通道內比表面積極大，傳熱效率極高；③反應條件容易控制，副反應較少；④原料、試劑用量甚微，而且反應過程中產生的環境污染物也極少；⑤在微流控芯片中得到產物的量與近代分析儀器，如氣相色譜（GC）、氣相色譜-質譜（GC-MS）、高效液相色譜（HPLC）和質譜（MS）的進樣量相匹配，反應進程可直接用現代分析儀器在線監測，大大提高了研究合成路線的速度；⑥催化劑可固定在微通道中而得到高比表面積的催化床，提高催化效率。

二、微流控芯片在PET顯像劑合成中的應用

在微流控芯片中進行PET顯像劑的合成具有顯著優勢。首先，微流控反應合成系統可以操控非常小的反應體積，因此反應物的相對濃度高，反應速率快，從而可以大大降低底物的使用量，降低純化的難度。其次，可以極大地縮短合成時間，真正實現按需生產。第三，能顯著提高反應的放化產率。第四，反應體系小，降低防護成本，提高安全性。第五，反應芯片功能擴展性強，可以充分滿足科研需要。這些特點為快速高效制備短半衰期的¹¹C，¹³N，¹⁸F放射性PET顯像劑化合物提供了一個新的實驗平臺，在生命科學和臨床醫學方面具有廣闊的應用前景。

目前報道的微流控反應合成系統可分為兩大類，一類是由流路通道相連而成的“連續流動型”微流控反應合成系統，沒有內置的閥門，構型簡單，具有耐高壓的優點，特別適合氣-液、氣-液-固多相反應，能夠實現很高的反應速率。“連續流動型”系統的缺點是易交叉污染，受死體積影響大，且難以實現自動控制。另一類是由多種微單元模塊組合成的微反應合成系統，這種模塊式自動合成系統不但成本低廉，易于標準化及靈活集成，而且易于大規模推廣和應用，有良好的產業化和市場前景。

1.連續流微流控平臺

2006年Gillies等設計制作了一個能使反應物得到充分混合和傳送的雙芯片結構微反應器。這個微流控裝置利用光刻技術，將三層鈉鈣玻璃板（尺寸為15mm × 15mm ×1mm）通過熱鍵合構成一個整體。頂層用作試劑的傳送，中間層和底層用50%的氫氟酸溶液刻蝕形成兩個直徑10mm，深度100μm的圓盤，每個微反應器的總內體積約為16μl，試劑在此處混合并進行反應。整個裝置用融硅毛細管連接，使反應按順序進行，第一個芯片用來對被保護的三氟甘露糖前體進行［¹⁸F］氟化，接著在第二個芯片上用溶于甲醇溶液的甲醇鈉進行脫保護，從而獲得原始的［¹⁸F］FDG，其放射化學產率（radiation chemistry yield，RCY）約為50%。由于此微反應器可以對微環境進行很好的控制，因此在芯片上的合成時間極其短暫（4～6秒），并且用該裝置合成時無需加熱。

2007年Steel等報道了一種可以局部加熱的全自動合成［¹⁸F］FDG平臺，該平臺是具有兩級結構的蛇形微流控裝置。這個裝置由玻璃材料制成，從而解決了溶劑之間不兼容的問題。當改變前體量、反應溫度和流速這些參數，得到的［¹⁸F］FDG的放射化學產率非常穩定，說明微反應環境可以得到很好的控制。在1mCi到1Ci的初始活度范圍內成功地合成了［¹⁸F］FDG。在250μl/min的流速下，得到了放射化學產率為40%的［¹⁸F］FDG，總合成時間為10分鐘，其中包括70℃條件下2分鐘的氟化過程和20℃下2分鐘的脫保護過程。這個系統證明了在全自動放射合成條件下可以利用微流控裝置的優勢。結果還表明這個微流控系統的性能可以與商品化常規合成裝置相比，展示出微流控系統用于常規合成［¹⁸F］FDG的可行性。

Wester等發表了一種基于毛細管的微流控合成裝置。該裝置將直徑300μm，長度0.7m，內體積約為50μl的毛細管集成到一個全自動模塊中快速生產［¹⁸F］FDG。毛細管是由聚四氟乙烯（poly tetra fluoro ethylene，PTFE），聚全氟乙丙烯（fluorinated ethylene propylene，FEP）和聚醚醚酮（poly ether ether ketone，PEEK）等耐有機溶劑的塑料材料制得。該裝置在溫度105℃，流速0.3ml/min條件下，合成［¹⁸F］FDG的總時間約為10分鐘（除去¹⁸F產生過程），RCY達到88% ± 4%。與常規相同氟化條件下放化產率42% ± 5%相比，展示了毛細管微流控反應器的優勢。

2.模塊式集成微流控平臺

與連續流微流控平臺相比，Lee等設計了基于聚二甲基硅氧烷（poly dimethylsiloxane，PDMS）又稱硅橡膠材質芯片為核心的模塊式集成微流控合成平臺。該裝置在微流控芯片中集成大量的微閥、微泵，將［¹⁸F］FDG合成中的離子富集、脫水、標記和水解純化這些功能化模塊高度集成在同一塊微流控芯片上。從通入稀釋的¹⁸F^-溶液至生產出RCY為38%、放化純度（radiation chemistry purity，RCP）為97.6%的［¹⁸F］FDG，整個合成過程僅需約14分鐘。將此芯片的合成產物直接注射到小鼠體內，觀察到了清晰的PET腫瘤分布圖像。除此之外，他們還設計了第二代可以擴大生產量的簡化的微流控反應芯片，這個裝置是一個體積約為5μl、配有真空排氣管的圓形反應器。但這類裝置都使用了PDMS芯片，不能承受過高的液壓和氣壓，且對許多溶劑的耐受性較差，因而反應類型受到很大限制。現已有一些新型耐多種有機溶劑的彈性材料可用于芯片制作，因此該技術有望用于多種反應類型的化學合成。該研究工作的另外一個特點是采用計算機輔助設計（computer aided design，CAD）來制作可用的工作芯片，整個裝置制作過程可在兩天時間內完成。

受Lee的研究工作啟發，Elizarov等利用數值模擬和實驗研究相結合的方法，對硬幣形微流控合成芯片進行了進一步優化設計，制作了直徑5mm，高度255μm的圓形反應器。該反應器的優點在于：①反應器的表面積大，加快了熱量轉移并且能較好保持了溫度均一，同時加快了氣體的逃脫；②這種形狀促進了溶液的有效混合并使產品盡可能完全轉移；③提供了足夠的周長用于連接多個進口和出口。此外，該裝置特別在反應室上方制作了蛇形多功能氣槽，氣槽與反應室之間由可透氣的PDMS薄膜隔開，氣槽接真空可加速反應器中水蒸氣的去除。用該裝置合成得到了產率為96%，產品純度達到99.3%的［¹⁸F］FDG，可以直接用于小鼠的顯像。研究結果也表明，在無需放射性物質參與反應的條件下，該方法同樣能夠確定反應器的最佳幾何形狀以及操作條件；而且利用數值模擬，無需制造新的芯片就可以探索新的芯片設計，證明了計算機數值模擬可以作為芯片設計以及操作參數優化的一個強有力的工具。

Keng等最近設計了一種利用電潤濕（electrowetting on dielectric，EWOD）原理來合成PET顯像劑的新的微流控裝置（圖9-1），這是另一種獨特的模塊式微流控合成平臺，芯片是由耐有機溶劑的材料制得，與之前報道的模塊式合成芯片系統相比，克服了PDMS芯片材料的缺點。用此裝置，他們高效可靠地合成了［¹⁸F］FDG，氟化效率達 88% ± 7%（n = 11），水解純化后，放化產率為22% ± 8%（n = 11），并且合成得到的產品重現性良好，成功用于小鼠的PET成像，并達到了用于人類PET成像的質量控制標準（如放化純度、溶劑殘留、pH等），展示了電潤濕微流控合成平臺的優越性。

Saiki等利用電化學沉積的方法，將¹⁸F氟化物水溶液濃縮于含有K.222-KHCO₃的MeCN溶液中（富集效率高于60%），然后稀釋到一微室中，該模塊可以在6分鐘內生產出60μl溶于MeCN的高反應性［K⁺/K.222］¹⁸F^-，并在微反應器中進一步了合成［¹⁸F］FDG。

Wong等最近研究了電化學方法濃縮無水［¹⁸F］氟化物合成PET顯像劑的反應。通過利用¹⁸F-親核取代反應合成［¹⁸F］FDG等四種PET顯像劑，取代反應在微流控反應流通池中進行，研究了反應時間、溫度、前體濃度和溶劑對取代反應速率的影響，評估了濃縮在非質子溶劑中的［K +/K.222］¹⁸F復雜化合物的反應活性。在最佳條件下，獲得產物的產率均等于或高于傳統方法的產率。該研究證明，電化學濃縮的方法可以有效減少合成反應時間，從而增加了高溫下不穩定產物的放化產率。

3.其他類型PET顯像劑的微流控芯片合成應用

除了合成［¹⁸F］FDG之外，也有許多其他類型PET顯像劑采用微流控芯片技術合成的報道。2004年，Lu等采用一個水力學驅動的微型反應器合成了¹¹C和¹⁸F標記的幾種羧酸酯（圖9-2）。反應器是一個簡單的T型玻璃芯片（圖9-3）。在流速為10μl/min時，反應物1和2b生成4b的衰減校正后放化產率為56%，當流速降到1μl/min時，產率增加到88%，其他幾種羧酸酯的產率也隨著試劑濃度的升高和流速的降低而增大（圖9-4）。他們還在上述T-形微反應器中利用2-［¹⁸F］氟乙基對甲苯磺酸進行了¹⁸F-氟乙基化反應，兩種反應前體通過注射泵經由進口A和B注入微通道（芯片結構見圖9-3），實驗觀察到在室溫下該反應不能進行，但將裝置加熱到80℃時，在流速1μl/min的條件下得到RCY為10%的合成產物，總合成時間為10分鐘，該實驗進一步證明了利用微反應器進行PET顯像劑合成的靈活性和多樣性。

2005年，Brady等利用一個相似的玻璃微反應器，對含有-NH，-OH和-SH等官能團的各種基體進行了¹¹C標記，利用［¹¹C］CH₃進行直接的¹¹C甲基化。從微反應器中得到的放射性混合物可以利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）快速簡便地分離開來，得到的小體積放射性顯像劑有利于安全靜脈注射管理。

因為許多生物活性物質都含有羧基，例如酰胺、酯類、內酰胺和內酯，所以利用［¹¹C］CO的¹¹C羧基化反應在顯像劑中引入¹¹C標記羧基官能團是一種非常有效的方法。但是，將氣相的［¹¹C］CO直接引入微反應器進行標記合成具有很多困難：

（1）［¹¹C］CO捕獲效率很低，加之試劑之間混合不完全導致產物的RCY較低。

（2）高溫、高壓以及有機溶劑的不兼容性，使得基于塑料（如PDMS）的微反應器未達到合成的最佳標準。為此Miller等設計了一個快速進行多相¹¹C羧基化反應的簡易、廉價的微反應器。該微反應器的主要特點是在一個聚四氟乙烯管內裝填了可重復利用的含鈀催化劑的硅膠，從而提供了一個覆蓋有鈀催化劑的大面積活性表面，促進了合成反應的進行。利用這套裝置進行了幾種鹵代芳烴的放射合成來標記酰胺，并有較好的產率和純度。該研究表明，利用固定化催化劑的微管反應器對于PET顯像劑合成的發展具有很大的潛能。

2009年，Briard等使用市售的連續流微反應器平臺為基礎，用微毛細管作為反應環，通過一步氟化的方法，合成了一種高親和力的轉運蛋白配體N-［¹⁸F］氟代乙酰基- N-（2，5-二甲氧基芐基）-2-苯氧基苯胺。該裝置能耐受300psi的壓力，因而可以承受過熱條件（例如CH₃CN的190℃）下的合成反應。從圖9-5可見在110℃、總合成時間約為4分鐘條件下，獲得產物12的最高RCY為85%，可以用于小鼠和猴子的micro-PET成像研究。利用同樣的裝置他們也合成了產物13。用類似方法，他們通過改變各種反應條件（反應環的長度，反應溫度，前體體積比以及流速大小），還成功合成了廣泛用于D₂受體PET顯像的［¹⁸F］fallypride14，并獲得了最佳RCY的產物14。Lu等也利用同樣的微反應器合成得到了化合物16，Patel等用微反應器輔助反應，在160℃條件下，經過約8分鐘的反應時間，將一種能夠有效對代謝型谷氨酸受體進行成像的放射性配體進行標記合成，獲得了RCY為31%的產物16，而通常手段用對應的溴芳前體合成所得的RCY則只有4%～6%，證明使用微反應器進行反應對合成產率提高很明顯。

2010年Chun等報道了在微反應器中，由［¹⁸F］氟化物離子與二芳基碘鎓鹽通過鄰位取代反應快速高效地合成［¹⁸F］氟代芳烴的方法（圖9-6）。在控制得當的條件下，其反應符合化學動力學規律，并由此測得了該反應的活化能。

2011年，Bejot等利用模塊式微流控反應器合成了用于蛋白質標記的N-琥珀酰亞胺-4-［¹⁸F］氟苯甲酸酯（N-succinimidyl 4-［¹⁸F］fluorobenzoate，［¹⁸F］SFB）。［¹⁸F］SFB可以用于對敏感生物分子進行放射標記，但是不能通過直接的¹⁸F-親和取代反應獲得。經過微型固相純化，最終得到放化產率（非衰減校正）55% ± 6%，RCP ＞ 98% 的［¹⁸F］SFB，獲得的［¹⁸F］SFB可進一步用于標記表皮生長因子蛋白。

2012年，Selivanova等第一次成功地在連續流微反應器中一步完成對含有兩種不同輔基的肽類的放射氟化（圖9-7）。

Saiki等報道了采用一次性的微流控芯片進行無載體的［¹⁸F］氟化物的電化學濃縮。Gillies等將由三層聚碳酸酯（PC）材料構成的微流控平臺擴展應用于¹²⁴I標記的顯像劑合成，生產出了用于檢測細胞死亡的顯像劑¹²⁴I標記的膜聯蛋白，2分鐘后標記效率約40%，得到了與傳統合成方法接近的結果。他們還用同樣的方法，一步完成了對抗癌藥物阿霉素的¹²⁴I放射碘化，2分鐘內得到的標記效率約為80%。2010年，Wheeler等用放射金屬 ⁶⁴Cu²⁺對 1，4，7，10-tetraazacyclododecane-1，4，7，10-tetraacetic acid（DOTA）與peptide cyclo（Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys）的螯合物進行了標記，得到的產率大于90%。

小 結

從目前的發展水平看，微流控分析芯片已突破其發展初期在加工技術及基本流控技術上的主要難關，正在進入一個開展更深入的基礎研究、廣泛擴大應用領域及深度產業化的轉折時期。以微流控芯片為核心的系統將取代當前化學實驗室的很多設備，使化學分析及合成進入病房、生產現場甚至家庭。而在過去幾年中，作為一種放射標記反應的新方法，微流控反應器在合成PET顯像劑方面吸引了人們的極大興趣，基于微流控的PET放射化學的許多研究集中于反應器的設計和合成驗證，許多研究者使用各自設計的微反應器完成了¹⁸F-FDG的多步放射合成。微流控反應合成系統在PET顯像劑等分子影像試劑合成中的應用呈現了許多優勢，例如提高了產率和純度、加快了反應速度、可更好地控制反應進程、產物具有更好的可信度；反應過程更安全、更有效地利用了熱室空間，節約了防護材料；能夠節約昂貴的前體、降低分離的難度，降低了合成成本；微反應器可一次性使用，具有類似于試劑盒性質放射化學過程的質量保證；有利于自動化以及與后處理過程相集成；減少了反應體積從而獲得了常規合成方法很難達到的放射性同位素濃度。以上所有這些優勢的結合對于現在以及今后臨床應用PET藥品生產管理規范（GMP）都是極其重要和必要的。除此之外，微流控芯片開創了一條研究基礎放射化學反應的嶄新道路。

（張 宏　徐光明　雍蓓蓓）

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