第七章　納米材料在多模式分子影像中的應用

第一節　導 言

近年來，納米科技的發展對現代生物醫學的進步產生了巨大的影響，尤其在分子影像學領域，利用納米材料的微小尺寸以及獨特的光學、電學和磁學等特性，結合現代醫學影像技術和手段，能夠在細胞、亞細胞和分子水平檢測生物和疾病發生過程。特別是在活體狀態下對一些疾病的產生、發展有重要作用的分子標志物及其傳導途徑進行成像，對其生物學行為進行定性和定量的研究，可以早期診斷疾病、提供疾病發展重要信息和直接評價治療效果。基于納米材料的分子影像技術融合了分子生物化學、納米技術、數據和圖像處理等技術，能夠通過圖像直接顯示細胞或分子水平的生理和病理過程，因而具有高特異性、高敏感性和高分辨率，是最具有發展潛力的醫學科學前沿領域之一。

現代醫學影像技術、高特異性分子探針或高分辨率造影劑、疾病分子標靶是分子影像學研究的三個關鍵因素。目前常用的分子影像學技術包括：光學成像（optical imaging，OI）、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）、正電子發射計算機斷層成像（positron emission tomography，PET）、單光子發射計算機斷層成像（single-photon emission computed tomography，SPECT）、X 射線計算機斷層掃描（X-ray computed tomography，CT）及超聲成像（ultrasound imaging）等。最近拉曼光譜成像（Raman imaging）和光聲成像（photoacoustic imaging，PAI）也顯示出巨大的發展潛力。當然，不同的影像模式均有各自的利弊，而且單一的影像模式常常不能夠給出足夠的信息來解釋相應的生理和病理過程。表7-1列舉了常用的分子影像技術，包括相應的優點和局限性。例如，MRI作為常用的分子影像學研究的手段之一，具有優異的軟組織對比度和高空間分辨率（像素為10～100μm），可以同時獲得解剖以及生理和分子信息等諸多優勢。同樣，CT也能夠無創地給出生物體（特別是骨骼和肺部）的解剖信息。然而MRI和CT都缺乏足夠的敏感性來檢測在細胞和分子水平下的生理和病理變化。相反，核醫學影像技術（例如PET，SPECT）可以利用合適的有足夠的敏感性的放射性分子探針來探測疾病的分子標志物并對其進行定性和定量的研究。對于光學影像技術，熒光和生物發光成像同樣能夠快速、高靈敏地在體內定位特定的分子靶點。但是，核醫學影像技術和光學影像技術都不能給出足夠的解剖學信息，圖像分辨率也明顯低于MRI和CT。因而，有必要通過整合不同的成像模式，即所謂的多模式成像來優勢互補。例如，PET能夠極為敏感和準確地探測到體內細胞新陳代謝和功能的異常，而CT和MRI能給出解剖學信息，尤其是MRI在反映解剖形態和生理功能方面有著顯著的優越性。將這兩種技術在同步采集系統中結合起來可以同時顯示病變部位的解剖位置和結構，以及在細胞和分子水平上功能和代謝等方面的全方位信息，對于疾病的診斷和治療具有十分重要的價值。在臨床應用中，PET/CT或PET/MR雙模式成像在對腫瘤的診斷分期和療效評價中取得了明顯的成功。同樣，可以通過引入放射性光學影像探針，把光學成像模式引入到PET成像中來實現光學和PET雙模成像。而光學和超聲雙模成像能相對便宜地得到實時并且高空間解析度的分子影像，且不用引入電離輻射。其他雙模式分子影像以及多模式分子影像，例如CT/MRI，CT/OI，MRI/OI，PET/MR/OI等，也已經成功地應用在對疾病的檢測和評估中。這種多模式影像不僅可以提高臨床診治疾病的水平，使得對疾病的診斷更加具有合理性，而且有望在分子水平上及早發現疾病，從而真正達到早期診斷（表7-1）。

分子影像探針的構建是分子影像學研究的關鍵環節。傳統的影像探針通常由三部分組成：影像標記或成像造影劑、載體或連接體和靶向分子。影像標記或成像造影劑可以是放射性元素、熒光分子、金屬螯合物、碘等簡單元素或分子，也可以是微泡、全氟化碳液滴、脂質體、以及多種納米或微米級的顆粒。他們能夠作為成像造影劑用于相應的影像模式成像，從而有效提高成像分辨率和敏感性。分子影像探針的靶向性可以通過與生物分子偶聯來實現。選擇合適的疾病相關標志物或靶點對于實現靶向成像是非常重要的。靶向分子包括抗體、多肽、核酸、小分子等。在理想情況下，靶向分子能夠特異性地識別疾病細胞或病變組織。在傳統分子影像探針中，載體或連接體起到運載或連接成像造影劑和靶向分子作用，在有些情況下，載體同時也是成像造影劑。為了得到理想的圖像同時避免相互的干擾，各個組成部分需要合理地協同地組合在一起。

最近納米材料技術上的進展對分子探針的研制起到了巨大的影響。雖然傳統的成像造影劑（例如有機染料、放射性同位素）已經廣泛地應用在研究和臨床應用中，納米材料作為成像造影劑在分子影像技術中正發揮著越來越重要的作用。對比傳統的成像造影劑，納米粒子具有可控的微小尺寸及其形狀、優良的生物相容性和高效的運載率等諸多優勢，特別是當粒子尺寸只有1/10或1/100nm時，由于相當大的比表面積和量子局限效應，它們展現出獨特的磁學和光學性能。對比大多數生物功能基團例如酶、抗體或受體等，納米材料具有相應的尺寸大小，因而能夠在分子水平上作用于生物體系。而且，納米粒子通常擁有相當一致的尺寸和形狀，進而表現出近乎一致的物理和化學性質，特別適用于表征生物體內分布、生理代謝等多種過程。因此，將納米粒子與靶向分子探針相結合所構建的納米影像探針，結合現代分子影像模式可以構建多功能化納米影像探針，從而使高分辨率、高敏感性、無創的分子影像技術成為可能，也進一步推動疾病早期診斷、個體化治療的進步與變革。

適用于分子影像的納米粒子包括有機納米粒子（例如脂質體、膠束和高分子囊泡等）和無機納米粒子（例如金屬或金屬氧化物粒子、碳納米管和量子點等）。美國國立醫學圖書館對當前應用的分子影像造影劑進行收錄并建立了分子影像造影劑數據庫（molecular imaging and contrast agent database，MICAD）。可以檢索到的1 119個相應的數據，其中有112個造影劑是納米影像探針。因為多數易制備的有機納米粒子并不具備相應的物理和化學性能，所以大多數有機納米粒子僅用作載體來包裹或封裝功能化的組成部分，例如有機染料、螯合化合物和無機納米粒子等。雖然有些功能化的聚合物納米粒子顯示出可調的熒光光學性能，但它們很難制備而且不易在體內降解。近年來隨著納米粒子制備工藝的完善，有許多性能優良的無機納米粒子造影劑出現，多數已經商業化并處在前期臨床評估的階段，有些還被批準在臨床上使用。經典的例子是1996年美國食品藥品監督管理局（FDA）批準的用于肝造影劑的超順磁氧化鐵納米粒子（菲立磁，Feridex），它們作為MRI造影劑已經廣泛地應用在實驗和臨床的研究中。金納米粒子（例如金納米棒、金納米殼和金納米籠等）也受到廣泛的關注，由于其獨特的表面等離子體共振效應，它們能作為造影劑用于光學、拉曼光譜和光聲成像。另一個經典的例子是半導體量子點，他們在可見光和近紅外范圍內展現出明亮而且狹窄的發射光譜，而且具有極好的光穩定性，使得光學復合成像成為可能。總之，無機納米粒子作為多種分子影像模式的影像探針受到越來越多的關注，在一些影像模式中逐漸取代傳統的影像探針，特別是那些同時適用于多種成像模式的納米成像探針的構建成為分子影像學的趨勢。當然，納米影像探針也有自身的缺點，他們的構建還面臨許多技術上的挑戰。無機納米造影劑或納米探針在實際應用中存在成像模式單一、潛在的毒性、體內代謝慢和體內長期積累等問題。

能夠多模式成像的納米成像探針的構建正成為分子影像的重要研究方向。為達到優勢互補的目的，多個成像造影劑需要協同地組合在一起。例如，金屬或金屬氧化物納米粒子可以和放射性金屬螯合物相結合，分別用于PET/CT或PET/MR雙模成像，既可以對其進行解剖學定位又可以分析腫瘤的性質。同樣，放射性元素修飾的量子點可以把光學成像模式引入到PET成像中來實現光學和PET雙模成像。表面修飾著放射性元素的碳納米管也成功地實現了高靈敏的拉曼和PET雙模成像。表面修飾近紅外熒光分子Cy5.5的超順磁氧化鐵納米粒子可以實現MRI和近紅外雙模成像。超小的超順磁鐵鉑納米粒子可以透過血腦屏障進入腦組織用于MRI/CT雙模式成像。氧化鐵與金的核殼型納米粒子不但可以用于MRI與光聲雙模成像，還可以對腫瘤進行熱療。其他類似的核殼型納米粒子例如金包被的量子點等也在多模式成像上顯示出巨大的潛力。總之，將多種影像造影劑兩兩組合或者三三組合在一起能夠得到一種新型的納米粒子，從而實現雙模式甚至多模式的成像。我們將在下面的章節中詳細地介紹多種納米造影劑在多模式成像中的應用。

通過與生物靶向分子偶聯，可以有效地增強納米造影劑的靶向性。目前，納米造影劑的靶向成像主要有兩種方式：非特異性靶向和特異性靶向。前者依賴于納米粒子在腫瘤組織中增強的通透和保留性效應（enhanced peameability and retention effect）。靜脈注射后的納米粒子容易透過滲漏的毛細血管進入腫瘤組織并保留在里面。通過非特異性靶向來增強納米造影劑靶向性的效率比較低，而且易受到納米粒子相關物理和功能參數直接或間接地影響。利用抗體、細胞膜表面受體或特定基因片段的專一作用，在納米粒子表面連接疾病相關標志物分子，與目標細胞表面的抗原或受體發生特異性結合，可以有效地實現納米造影劑的靶向性。特異性靶向分子可以是單抗或多抗，如人表皮生長因子受體（human epidermal growth factor receptor 2，Her2）特異性抗體、黑色素瘤α促黑素受體（α-MSH）抗體和前列腺癌特異性膜蛋白（prostate-specific membrane antigen，PSMA）特異性抗體，也可以是與靶向受體結合的底物、蛋白序列，例如葉酸和環化RGD多肽等。以新生腫瘤血管為靶標的納米影像探針的研究是近年來的熱點之一。近期研究表明多種腫瘤組織內細胞高表達整合素α_vβ₃，可促進腫瘤新生血管的形成。多種納米造影劑與整合素識別肽相連接，可以更好地與腫瘤組織表達的整合素結合，從而有利于腫瘤新生血管的成像。

第二節　基于納米顆粒的分子影像

一、磁共振成像與納米成像造影劑

MRI是目前最強大的全身無創診斷技術之一，能夠通過測量水的質子（或其他奇數核，例如³H、¹³C、¹⁹F、¹⁷O、²³Na、³¹P、¹²⁹Xe）在生物體內的弛豫過程，來給出相應的三維斷層掃描圖像。MRI的信號強度與水在不同組織或器官中的磁弛豫率有直接關系。在外界強的靜態磁場中［B₀，臨床常用1～3特斯拉（tesla，T），而7T或更高的磁場目前在實驗室中常用于小動物顯像］，核自旋平行于或反平行于磁場方向（低能級或高能級態）。絕大多數的質子核傾向處于低能級態，而且高能級質子核的數目分布是與磁場強度成正比的。即使在1T的磁場中，也僅有6/100萬的質子處于反平行方向。與質子自旋共振的電磁射頻脈沖被用來改變質子自旋的方向。那些翻轉的質子自旋傾向于回到初始狀態，這種弛豫過程卷入兩個過程：縱向弛豫（T₁恢復，自旋-晶格）和橫向弛豫（T₂衰減，自旋-自旋）。前者伴隨著能量從激發態到周圍晶格的衰減；后者卷入由于自旋-自旋相互作用引起的在X-Y平面上相干相位的丟失。水中的質子在不同組織或器官有不同的弛豫時間，從而產生內源性的MRI對比度。引入合適的外源性造影劑可以增加弛豫、縮短T₁和T₂弛豫時間，從而增強圖像的對比度。增強磁信號，縮短T₁導致更明亮的圖像；相反T₂減少成像信號強度。造影劑的效率可以用弛豫率（R_x，X = 1或2）定量衡量：R_x = 1/T_x（s^-1），或歸一化弛豫率：r_x = R_x/濃度（mmol^-1·L·s^-1）。弛豫率越高相對應于更快的弛豫時間，從而得到對比度更高的圖像。

MRI影像主要涉及四種物質：①抗磁性物質，沒有未成對的電子，施加外加磁場后會產生一種與B₀方向相反的磁場；②順磁性物質，核外具有不成對的電子，在外加磁場B₀存在時產生磁化，產生的磁場與B₀方向相同，并且當外加磁場除去后則去磁化。如釓的螯合物（Gd-DTPA）、脫氧血紅蛋白、正鐵血紅蛋白等；③超順磁性物質，磁化率較順磁性物質強100～1 000倍。如含鐵血黃素，四氧化三鐵納米粒子等；④鐵磁性物質，即使去除外磁場也有明顯的剩磁。如鐵（Fe）、鈷（Go）、鎳（Ni）等。目前臨床上大量使用的是一種釓（Gd）與二乙烯三胺五乙酸（DTPA）的螯合物（Gd-DTPA），主要是縮短T₁從而增加T₁加權的影像對比度，屬于陽性造影劑。但這些小分子的造影劑有許多缺點，例如：無特異性、快速的腎清除、潛在的機體毒性和低敏感性。目前，通過與有機高分子聚合物（例如脂質體、膠束等）相結合形成功能化的有機納米粒子，能夠有效地改善T₁加權的MRI影像，已成功地應用在前期臨床研究中。雖然其他無機磁性納米粒子也能用作T₁影像造影劑，但效果通常沒有釓修飾的有機納米粒子好。目前最具有代表性的T₂影像造影劑是氧化鐵納米粒子。這些磁性納米粒子的存在強烈地改變其周圍的磁場微環境，導致周圍質子相干相位的快速丟失，從而增加T₂加權的影像對比度，屬于陰性造影劑。我們將在下面詳細介紹多種用于MRI影像的無機磁性納米粒子。

氧化鐵納米粒子包括磁鐵礦型（Fe₃O₄）和赤鐵礦型（γ-Fe₂O₃）納米粒子，已經被廣泛地研究、銷售并作為MRI造影劑應用在前期臨床甚至在臨床研究中。前者具有由氧原子形成面心立方結構與由鐵原子占據四面體和八面體間隙組成的立方反尖晶石結構。在正常條件下，磁鐵礦會逐漸氧化成赤鐵礦。但在生物醫學應用中磁鐵礦型和赤鐵礦型納米粒子并不相互區分，通常被稱為氧化鐵。在多種氧化鐵粒子中，超順磁氧化鐵粒子（superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPIOs）已經成功地應用于生物醫學，因為它們之間沒有強的磁相互作用，能夠穩定地分散在生理條件下。作為T₂影像造影劑，SPIOs能在正常的MRI磁場強度下達到磁飽和，能穩定地建立一個局部擾動的偶極磁場，從而劇烈地縮短周圍質子的弛豫時間。目前這類造影劑已有一些實現了商業化，如Feridex（菲立磁）、Resovist和Combidex等，主要由多個氧化鐵核和外包的葡聚糖殼組成，大小在50～160nm之間。這些作用于T₂的陰性造影劑具有一定的組織特異性。因為在人體血液中，直徑大于30nm的粒子主要經單核吞噬細胞系統（mononuclear phagocytic system，MPS）所清除，所以靜脈注射后的SPIOs能被巨噬細胞吞噬而分布在相應的組織或器官中，如肝、脾和淋巴結等。利用這種SPIOs的特性可以有效地區分肝細胞癌和轉移癌，因為肝細胞癌組織中不含巨噬細胞，而周圍正常肝組織含有庫普弗細胞（Kupffer cell），在攝取了SPIOs后T₂影像信號降低，而腫瘤組織則呈現相對高信號，這時SPIOs相當于“陽性”的造影劑。在臨床上可以運用該類造影劑來區分肝癌和局灶結節樣增生及肝腺瘤。然而，此種納米造影劑的快速肝和脾清除嚴重減少它們在體內的循環時間，降低其靶向特異性。

改變顆粒的大小可以有效躲過單核吞噬細胞系統的清除或者增加在血液里的循環或滯留時間。但是，隨著納米粒子變小，其磁化強度相應減少，從而降低MRI對比度（圖7-1）。一種粒徑小于30nm的超微超順磁氧化鐵顆粒（ultrasmall superparamagenetic iron oxide，USPIO）近來被用作特異性造影劑，因為它們在血液循環滯留時間較長，不易被單核吞噬細胞系統清除。USPIO不但顯現出T₂效應而且也可以用于T₁成像。利用在動脈粥樣硬化斑塊中的巨噬細胞對USPIO不同的吞噬能力，通過高分辨MRI可以區分出硬斑塊與軟斑塊。最近超微的Fe₃O₄納米粒子（水合半徑小于10nm）也成功地用于腫瘤特異成像（圖7-2）。4.5nm的氧化鐵核與整合素識別肽c（RGDyK）通過一步Mannich反應偶合在一起，能夠很好地結合腫瘤組織表達的整合素α_vβ₃，從而用于腫瘤新生血管的成像。由于相當小的粒子尺寸，超微的Fe₃O₄納米粒子在到達目標靶點前能夠逃避單核吞噬細胞系統的清除。但由于粒子變小，其弛豫能力相應變差。

在外界磁場中，納米粒子的磁化強度取決于粒子的大小、形狀、組成和晶體各向異性。近來，合成的金屬合金磁納米粒子如FeCo和FePt，跟傳統的鐵磁材料相比有更高的磁角動量。由于相當小的表面效應，納米粒子表現出超高的磁化強度和r1/r2弛豫率。Dai和其合作者合成了用碳層穩定的FeCo納米粒子，這種納米粒子已成功地應用于動物體內血管造影。同時，用于腫瘤分子影像和檢測的磁納米粒子的靶向性和敏感性也已經被進一步評價。錳摻雜的尖晶石型鐵磁礦納米粒子具有相當高的磁化強度，當與人表皮生長因子受體Her2特異性抗體耦合后，可以用作特異性的造影劑來標記Her2受體過表達的腫瘤。

二、基于納米粒子的CT成像

由于其獨特的屬性，例如高分辨率和高組織穿透性，X射線CT是一種在臨床上最常用的影像技術。身體不同組織和器官例如骨骼、脂肪或空腔對于X射線有明顯不同的吸收，從而導致高對比度的解剖結構影像。但其軟組織對比度比較差，為了檢測到腫瘤或與疾病相關的異常組織，需要引入一定量的影像造影劑。當前臨床上使用的造影劑主要是碘基或釓基分子。它們的主要問題是非特異性和快速的體內排出。對比這些傳統的造影劑，納米CT影像造影劑具有優異的影像對比度和相應的靶向特異性。金納米粒子近來已經用于CT成像，對比度效果比碘高近3倍。然而，需要引入大劑量金納米粒子才能得到腫瘤和相應軟組織的高對比度影像，因此有必要發展不同的納米造影劑。近來Weissleder和合作者報道一種聚合物包被的硫化鉍（Bi₂S₃）作為CT造影劑，它們對X射線的吸收是碘的五倍而且具有相當長的體內循環時間并可用于血管、肝和淋巴結的造影。但它們的組織毒性不容忽略，妨礙了它們在臨床上的應用。最近，氧化鉭作為CT成像造影劑也成功地應用于淋巴結造影，而且它們的組織毒性也相當低。

三、基于納米粒子的核素成像

核素分子影像的主要優點是高敏感性、高準確性、可重復的定量性和高組織穿透性。當前的核素分子影像方法包括PET和SPECT。通常，PET利用發射正電子的放射性同位素（例如¹¹C、¹⁸F、⁶⁴Cu、^94mTc、¹²⁴I等）標記的生物活性物質作為顯影劑，可在不影響環境平衡的生理條件下，研究和診斷人體內早期的病理生理和代謝異常疾病。PET采用正電子直接進行檢測，大大提高了探測敏感性，使疾病的早期定位、定性、定量、定期診斷成為可能。SPECT是利用發射γ射線的放射性同位素進行成像的影像技術。類似于傳統的核素平面成像，SPECT技術采用伽馬相機在不同角度獲得二維的投影圖，通過計算機重建獲得三維的圖形。因為SPECT技術使用旋轉的γ相機和準直儀，部分γ光子被忽略掉，SPECT的成像敏感性明顯低于PET。SPECT的空間分辨率通常也低于PET，因為PET能給出更局部的信息。用于SPECT的發射γ射線的放射性同位素通常比較便宜，例如^99mTc、¹¹¹In、^123/131I等。

放射性同位素已經被引入到多種納米粒子上，包括量子點、金納米粒子和碳納米管等。用納米粒子作為PET成像探針可以實現多功能和多模式成像，并可以由此得到相應納米探針的組織分布和藥代動力學。Dai和合作者為了調查單壁碳納米管（single-well carbon nanotubes，SWNTs）在體內的分布和腫瘤靶向性，在單壁碳納米管的表面修飾上聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）、環狀RGD多肽和銅⁶⁴Cu的螯合物。均勻一致的碳納米管長100nm、直徑有1～3nm。修飾PEG的雙親性脂質分子可以通過與碳納米管之間的疏水作用在其表面形成自組裝分子層，可以提高其的生物相容性和穩定性，使其躲過單核吞噬細胞系統的吞噬，延長其體內循環時間，使碳納米管有足夠的時間到達病變部位并成像。

放射性核素通過與螯合劑形成穩定的復合物來標記納米粒子。然而在納米粒子表面的放射性螯合物不可避免的改變其物理化學屬性、體內分布和藥代動力學。而且，核素有可能從螯合物上離解下來，從而無法反映納米粒子在體內的真實行為。因此，有必要發展一個不涉及螯合物的策略來反映體內結果。近來人們廣泛地篩選了多種不溶的放射性核素納米鹽，發現羥基磷灰石（hydroxyapatite）和氫氧化鋁納米粒子與¹⁸F在生理條件下形成穩定物質。雖然¹⁸F標記的羥基磷灰石在血液循環中顯現出高的穩定性，然而一旦它們被肝捕獲而積累在肝中，逐漸的降解是不能被忽視的，最終導致¹⁸F在骨骼中積累。相反，¹⁸F標記氫氧化鋁納米粒子在當它們被肝或脾清除時卻相當穩定。另一個例子是⁶⁴Cu標記的硫化銅（CuS）。Li和合作者通過沉淀法直接把⁶⁴Cu整合到CuS的晶體結構，形成10nm、單分散的⁶⁴Cu標記的CuS納米粒子。由于EPR效應，它們顯示出相當高的腫瘤攝取率（圖7-3）。

雖然SPECT的成像分辨率和敏感性不如PET，但通過用不同的放射性核素可以得到多元復合成像（multplexing imaging）。雖然涉及納米粒子的SPECT多元復合成像并不常見，但在原理上是可行的。基于不同的衰減時間、能量和化學性質，不同的放射線核素可以用來標記納米粒子來適用于不同的應用。例如，為了研究一個星期的藥代動力學、腫瘤攝取和治療效果，¹¹¹In標記的嵌合L6（ChL6）單克隆抗體被連接到氧化鐵納米粒子上用來監視納米粒子的腫瘤攝取，以及在經過交變磁場誘導的熱療處理后，評價腫瘤的壞死狀況。

四、基于納米粒子的光學成像

最快和最便宜的分子影像技術之一是光學成像。近年來，通過構建具有生物相容性的近紅外納米粒子以及改進和發展現有的光學成像技術，發展基于納米粒子探針的光學成像新方法，以實現高靈敏、穩定和快速的分子影像，從而有力地促進了光學分子影像模式在癌癥診斷上的應用。由于低廉的價格、高敏感性和多功能化，熒光和生物發光成像技術越來越受到特別的關注。對于熒光光學成像，近紅外（near infrared，NIR）納米粒子探針的構建是實現體內影像的關鍵。在近紅外區域（700～900nm），信號有最大的組織穿透性，而且沒有自發熒光的干擾。生物發光成像是指利用生物發光反應來檢測在細胞和分子水平上功能和代謝等方面的信息。因為沒有背景信號干擾，生物發光成像的敏感性要高于熒光光學成像。然而，生物發光成像的潛在應用僅局限在前期臨床，主要是因為生物發光的組織穿透性比較低，而且常常涉及復雜的轉基因技術。其他光學成像或與光學相關的成像手段例如拉曼成像和光聲成像正成為分子影像學的重要研究方向，是因為它們優異的組織穿透性和高的空間分辨率。但由于涉及不同的物理原理，我們將在不同的章節中分別討論它們。

根據激發機制，NIR熒光納米粒子可分為兩類：降轉換熒光納米粒子（downconversion fluorescent NPs，DCNs）和升轉換熒光納米粒子（upconversion fluorescent NPs，UCNs）。傳統的熒光納米粒子，如熒光染料標記的納米粒子、量子點、單壁碳納米管和金納米簇等，主要屬于降轉換熒光納米粒子。簡單地說，當這類納米粒子被相應波長的光激發，能發射出更長波長的光波。但它們易遭受自發熒光、光解和光漂白的影響。相反，升轉換熒光納米粒子可以把低能量的光裝換成高能量的熒光。

1.近紅外熒光探針

熒光染料標記的納米粒子廣泛地應用于生物醫學領域。有機或金屬有機染料可以通過共價鍵、離子鍵、疏水相互作用連接到或整合進無機納米載體顆粒中。納米載體顆粒通常對激發光和發射光是透明的，例如硅納米粒子和磷酸鈣納米粒子。對比單獨的NIR熒光分子，熒光染料標記的納米粒子對于分子影像顯示出明顯的優點：首先，熒光分子在納米載體上的高負載率有效地增加成像敏感性；其次，化學惰性的載體能保護熒光分子，增加其光穩定性和生物相容性；最后，納米載體為進一步的功能化、靶向化提供一個平臺。

對于光學影像，研究最廣泛的納米粒子是量子點（quantum dot，QD）。它們是納米級的無機熒光半導體晶體，具有優越、獨特的光物理性能，例如高量子產率、寬廣的激發光譜、狹窄并對稱的發射光譜、基于尺寸大小的光學發光和卓越的光穩定性。近年來，為了進一步減少自發熒光并增強組織穿透性，研究者研制了近紅外發光的QD，包括鎘基、非鎘基的QD，它們能夠克服熒光染料標記的納米粒子的缺點，滿足當前生物體內成像的需要。考慮到某些NIR QD潛在的急性或慢性毒性和不穩定性，有必要用低毒性的ZnS或ZnSe對其進行包被，形成核殼型QD，例如CdTe/ZnS、InAs_xP_1-x/InP/AsSe等，這樣可以保護NIR QD防止光氧化反應而且改善量子產率。在NIR QD中的鎘金屬可以被其他低毒元素取代，例如CuInS₂/ZnS核殼型QD，得到的NIR QD顯示了很好的生物相容性。Gao和合作者首先在小動物模型上驗證了QD-抗體偶聯體的腫瘤靶向性。Cheng和合作者也報道了與抗Her2多肽靶向分子偶聯的非鎘NIR QD（InAs/InP/ZnSe，核/殼/殼型）的腫瘤靶向性。它們對Her2陽性表達的腫瘤具有良好的靶向特異性。與其他多數熒光探針一樣，需要外界光源來激發QD來產生熒光信號。這同樣限制了NIR QD在生物體內成像上的應用。為此，Cheng和合作者發展了一個新的策略：他們通過利用切連科夫輻射作為內置光源來激發不同大小的QD，不但可以實現探針的自發光，也可以用于體內多元復合成像。

2.升轉換熒光納米探針

升轉換熒光納米粒子的基本結構是兩個三價的鑭系離子（如Tm³⁺、Er³⁺、Yb³⁺）作為摻雜劑嵌在納米載體中，一個用于吸收（Yb³⁺），另一個用于發射（Er³⁺）。宿主納米載體包括無機熒光晶體例如氟化物（如LaF₃，YF₃，NaYF₄），氧化物（Y₂O₃）和磷酸鹽（LaPO₄）。像QD一樣，升轉換熒光納米粒子擁有很強的熒光強度而且在生理條件下表現出相當的穩定性。因為他們的吸收和發射光在近紅外區，幾乎沒有自發熒光干擾，他們有能力對較深的組織進行成像。

3.體內拉曼光譜和成像

拉曼光譜學基于拉曼散射光譜，對與入射光頻率不同的散射光譜進行分析可以得到晶格及分子的振動、轉動方面信息。拉曼散射是一非彈性散射，入射光與分子振動或系統聲子發生相互作用，導致非彈性散射光的能量增加或減少，而由這些能量的變化可知相應的振動模式或聲子模式。然而，自發的拉曼散射非常弱，有時熒光完全覆蓋拉曼散射條帶。多種拉曼光譜分析技術現在得到了進一步的發展，表面增強拉曼散射（surface-enhanced Raman scattering，SERS）光譜用來增強敏感性，而拉曼顯微儀（Raman microscopy）可以改善空間的分辨率，共振拉曼光譜則用來取得特殊的分析信息。不僅因為其多元復合成像的能力而且因為極高的特異性和敏感性，SERS光譜正成為最有前景的分子影像技術之一。它的敏感性甚至遠遠高于光學成像。

已發現能產生SERS效應的金屬包括金、銀等少數金屬納米粒子，它們能使被測定物的拉曼散射產生極大的增強效應，其增強因子可達10¹⁴～10¹⁵，這使得在納米粒子表面的單分子檢測和鑒定成為可能。這種SERS納米粒子通常是由三部分組成：金屬核，嵌入的報告分子和外包的硅層或聚合物層。有兩種機制用來解釋SERS效應：電磁增強和化學增強。前者是指金屬表面等離子共振振蕩產生被增強的局部電場。后者涉及在報告分子和金屬核之間的一個新的電子轉移能級，即分子在金屬上的吸附常伴隨著電荷的轉移引起分子能級的變化。SERS納米粒子能夠給出非常詳細的光譜信息而且其信號在紅外區遠遠高于QD，這將非常適合多元復合成像和生物體內成像。Nie和合作者用SERS納米粒子在光譜檢測和腫瘤靶向成像方面做出了先驅性的工作。他們用聚乙二醇包被的金納米粒子，同時嵌入拉曼報告分子（例如 crystal violet、Nile blue、cresyl violet、DTTC）。這種PEG包被的SERS納米粒子在生理條件下顯示了優異的生物相容性和穩定性，而且能夠在紅外區給出遠遠高于QD的信號。與腫瘤靶向分子［如單鏈可變區片段（single-chain variable fragment，ScFv）抗體］偶聯，得到的SERS納米粒子對過表達表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的腫瘤具有顯著的靶向性。

SERS納米粒子用在拉曼分子成像上可以達到皮摩爾數量級上的敏感性，而且可以實現多元復合成像。Gambhir和合作者用SERS納米粒子在活體內實現了多元復合成像。在活老鼠皮下注入的十個不同的SERS納米粒子可以在光譜上清晰地分辨。此外，五個最具特色的SERS納米粒子通過靜脈注射在肝中能被無創拉曼成像成功地鑒定和區分出來。通過在其表面修飾上抗EGFR的親和體（affibody），SERS納米粒子可以用于EGFR陽性腫瘤的靶向成像。單壁碳納米管近來也被用于拉曼分子成像。與RGD偶聯的單壁碳納米管已經成功地實現腫瘤新生血管的特異性拉曼成像。

4.光聲成像

光聲成像（photoacoustic imaging，PAI）是一種新興的分子成像技術，并已吸引了大量的研究興趣。和許多其他成像方式相比，PAI具有獨特的優勢，有很大的可能進入臨床研究應用。作為一個非電離輻射，非侵入性和高敏感性的分子成像技術，PAI結合光學和聲學成像的優勢，既保持成像的高靈敏性又克服傳統光學成像技術的深度限制。基本上，光能量被吸收和部分轉化為熱能，造成瞬態熱彈性擴張從而發射超聲波，然后由超聲波傳感器檢測到而形成圖像。PAI克服了成像深度的限制，能探測到深處可達5cm的小病灶。此外，PAI通過內源性或外源性成像造影劑提供高成像對比度，能夠實現實時成像。血紅蛋白或黑色素等內源性對比分子已被用于熱灼傷的探測、腫瘤新生血管形成的監測、血氧映射、腦功能成像和皮膚黑色素瘤檢測。然而，大多數疾病如癌癥并沒有合適的內源性PA造影劑分子，因此有必要研制新的外源性造影劑，從而在低濃度也能得到足夠的PA信號。

納米技術領域的最新進展大大促進了光聲造影劑的開發和設計。光聲信號的變化幅度和反差依賴于許多因素，如光吸收，光-聲轉換效率和目標介質的傳熱效率。多種光吸收粒子，如金基的納米結構、碳納米管，已經成功地用作PAI造影劑。雖然碳納米管作為PAI造影劑具有一定的前景，但由于它的近紅外吸收系數低，導致其成像敏感性相對較低。此外，其毒性仍令人擔憂。而金的納米棒，納米籠和納米殼等一系列金納米結構表現出卓越的光學性能、生物相容性和安全性，因此它們被廣泛地應用在光學成像和PAI領域。這些粒子在可見光和近紅外區域有很強的消光峰，是因為局部的表面等離子體共振。這種消光峰由兩部分組成，散射峰和吸收峰，可以通過控制改變粒子的尺寸大小、形狀和其他納米結構物理維度來有效地控制相應的散射和吸收峰的大小和波長。那些吸收明顯大于散射的金納米粒子將適用于PA成像。例如，帶有電介質核的金納米殼顯示出很強的光學共振但其光吸收比較微弱，因此它們不是的理想PAI造影劑。金納米棒和納米籠是非球面對稱的結構，可以通過改變其長寬比使其在近紅外區的光吸收截面達到最大，從而更適合于PA成像。金納米棒和納米籠雖然是好的PAI造影劑，但他們普遍有比較大的粒徑（～50nm），它們在生物體內的應用因而受到限制。Gamhbir和合作者最近報道，環狀RGD多肽修飾的單壁碳納米管可以作為PA成像造影劑來標識α_Vβ₃整合素，從而對腫瘤新生血管靶向成像。然而，它們在活體中的最低檢出濃度相對較高（50nmol/L）。因此，同一研究組對單壁碳納米管探針表面進行修飾從而提高了其成像敏感性。近紅外染料（吲哚菁綠，indocyanine green，ICG）通過π-π堆積作用連接在單壁碳納米管上，從而得到染料標記的單壁碳納米管。即使在皮摩爾濃度下，染料增強的單壁碳納米管也能給出可接受的PAI信號。這些修飾的納米探針給出的PAI信號比相同濃度的未修飾的單壁碳納米管高出300倍（圖7-4）。

第三節　挑戰與展望

得益于生物納米技術在過去幾十年里的迅速進步，基于納米粒子的分子探針以及相應的診斷技術得到相當的發展。構建理想的納米探針是分子影像學發展的關鍵要素之一。具有腫瘤靶向性的納米探針的構建與其潛在的臨床應用極大地促進了分子影像和個體化醫學的研究。其中最有代表性的例子是氧化鐵納米粒子，它們作為成像造影劑已成功地應用于臨床MRI。最近開發的特異性和敏感性的近紅外熒光納米影像探針表現出對腫瘤靶向成像的巨大潛力。由于納米粒子組成、功能和形態的多樣性，多種分子成像模式（如PET/MR、MRI/光學、MRI/PAI等）有可能有機地結合起來并且能夠做到優勢互補。結合超靈敏的、高空間解析度的“最先進的”分子影像技術，多種多模式、多功能納米影像探針成功地在前期臨床或臨床上應用于腫瘤的靶向成像，準確檢測腫瘤位置和解剖結構，能為腫瘤組織切除提供手術指導。

為了實現基于納米粒子的分子影像的臨床轉化，許多問題（包括生物相容性、藥代動力學、靶向效率，和納米粒子的急性或慢性毒性）仍然有待解決。由于巨大的挑戰，迄今只有幾個納米探針有很大的前景投入到臨床上使用。因此，有必要對現有的納米造影劑進行改進，在保留其成像特性的基礎上，對其表面進行修飾和功能化，實現多模式和靶向成像。同時，發展新的納米造影劑，以提高成像的敏感性、分辨率和特異性。

（成 凱　程 震）

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