第四節　小兒呼吸系統疾病分子生物學進展

一、呼吸系統疾病

呼吸系統感染性疾病及支氣管哮喘等非感染性疾病對兒童身心健康影響嚴重。此外，感染性因素或非感染性因素引起的急性肺損傷，也是嚴重威脅兒童生命的肺疾病，越來越受到研究人員的重視。

（一）感染性疾病的分子學發病機制

1.細菌感染疾病

由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的結核病（tuberculosis，TB）仍然是當今世界上最普遍的人類傳染病之一，被認為是僅次于艾滋病的第二大疾病“殺手”^［1］。結核病的發病是一個多因素綜合作用的結果，它的發生、發展和臨床結局，不僅受病原體的毒力和環境因素的控制，而且受到機體遺傳基因及其多態性的影響。隨著人類基因組學的發展以及對于結核病相關遺傳因素研究的不斷深入，研究人員采用候選基因策略以及全基因組關聯分析研究發現了越來越多與結核病易感相關的免疫基因，分別參與宿主對于結核病的固有免疫應答和適應性免疫應答。固有免疫相關的宿主易感基因研究主要包括Toll樣受體（Tolllike receptor，TLR）受體家族、溶質載體家族11成員 1（solute carrier family 11 member 1，SLC11A1）以及錨蛋白重復PH結構域1（Ankyrin repeat and PH domain 1，ASAP1），而適應性免疫相關的宿主易感基因研究主要包括白介素12（interleukin，IL-12）、干擾素 -γ（interferon-γ，IFN-γ），以及細胞因子誘導含SH2結構域蛋白（cytokine-inducible Src homology 2 domain protein，CISH）。

TLR家族是一類重要的模式識別受體，共有11個成員，通過識別并結合結核分枝桿菌抗原，募集接頭蛋白經不同信號轉導途徑進行信號轉導，激活核轉錄因子（nuclear factor-kappaB，NF-κB），NF-κB游離并移位到細胞核中，結合到靶向的DNA，與其他轉錄因子一起協同誘導IL-1、IL-12、IFN-γ的表達。其中，TLR2可識別MTB對蛋白酶抵抗的可溶性成分和MTB胞壁成分（ManLAM），而TLR4可識別MTB對熱敏感的膜相關成分。研 究 表 明，TLR2基 因 Arg753Gln（rs5743708）和Arg677Trp（rs6265786）以及 TLR4基因 Asp299Gly（rs49867900）和 Thr399Ile（rs4986791）與結核病易感相關。

SLC11A1蛋白位于靜息巨噬細胞晚期細胞腔內，當巨噬細胞吞噬病原體后，轉移到吞噬體膜上，并通過改變吞噬溶酶體的內環境（促進吞噬體內的Mn²⁺和Fe²⁺外排），使細菌無法合成防御酶系，最終限制病原體在胞內的繁殖。有研究表明，SLC11A1基因靠近5'的（CA）n微衛星區的改變、第4內含子單個核苷酸的改變、第543密碼子的天冬氨酸變為天冬酰胺以及3'非翻譯區的TGTG缺失等多態性與結核病易感相關。2017年，來自中國的研究者利用目前最新的Cas9基因編輯系統誘導了低脫靶效應的SLC11A1基因敲入奶牛，獲得了具有更好的抗結核病能力的轉基因奶牛^［2］。

在炎癥反應中，細胞因子通過酪氨酸激酶-信號傳導和轉錄激活因子（JAK-STAT）通路將刺激信號傳達到細胞內部，誘導包括CISH在內的多種基因轉錄。CISH由STAT5誘導產生，并且通過負向調節STAT5活化，抑制炎癥反應以及免疫反應。在MTB感染中，CISH對于T細胞分化和活化發揮了重要的調節作用。研究表明，CISH多個位點與菌血癥、瘧疾和結核病易感相關（-639、-292、-163、+1 320和 +3 415，其中 -292（rs414171）起了關鍵作用），并且攜帶rs414171的TT基因型以及 rs809451的GC基因型的兒童患結核病的風險明顯升高（分別為野生純合子的1.78和1.86倍）。

ASAP1可以誘導三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）與腺苷二磷酸核糖基化因子（ADP ribosylation factor，Arf）家 族 GTP 結 合蛋白結合，調節細胞骨架以及膜重構。研究者通過GWAS研究發現ASAP1的rs4733781和rs10956514與結核病易感相關，并且發現當下調該基因表達時，樹突狀細胞的遷移以及基質降解受損。因此，rs10956514可能通過影響ASAP1基因表達水平，而減弱DC細胞遷移，進而影響宿主抗MTB的固有免疫應答^［3］。

2.病毒感染疾病

（1）流感病毒：

流感病毒是人類感染最常見的病毒之一。干擾素（interferon，IFN）為人類重要的抗感染因子，IFN對病毒的防御反應主要是通過其與IFN受體的結合介導信號通路的激活，導致一系列受IFN調控的基因的表達，生成多種抗病毒蛋白如黏病毒抗性蛋白（myxovirus，Mx），阻斷病毒基因的復制，從而保護機體免受感染。人類發揮抗流感病毒重要作用的是MxA型。有研究顯示，流感病毒的復制可抑制IFN誘導的MxA蛋白的表達；經IFN-α處理的靈長類細胞，產生的MxA蛋白可有效地控制細胞中流感病毒的復制。由此可見，MxA蛋白是抗感染因子IFN下游重要的抗病毒效應蛋白。有研究表明，不同個體的遺傳因素可通過影響MxA基因的表達和轉錄功能，從而對病毒感染性疾病的發病、IFN的治療效果及預后產生重要影響。但目前，MxA作用的分子機制比如MxA是以蛋白單體還是多聚體的形式發揮抗病毒作用的，尚待闡明。有學者發現，只有二聚體型MxA才能與甲型流感病毒的核蛋白形成穩定的復合物，從而阻止病毒在初級轉錄階段的復制^［4］。

另外，唾液酸（sialic acid，SA）受體是介導人/禽流感病毒感染機體的重要受體，通常以糖苷鍵形式連接在糖蛋白、糖脂和其他多糖的末端。該受體結合于流感病毒表面血凝素（hemagglutinin，HA）的結構是決定流感病毒宿主特異性的主要因素，結合后經胞飲作用，病毒被吞入宿主細胞內，而后經合成病毒蛋白、組裝病毒、出芽等一系列過程導致宿主感染、發病。唾液酸受體末端有兩種構象形式——唾液酸α-2，6半乳糖（SA2，6GAL）和唾液酸 α-2，3半乳糖（SA2，3GAL），分別主要識別人流感病毒和禽流感病毒。有研究發現，流感病毒HA蛋白第190位置的突變可以增強該蛋白與人型SA受體的結合力，從而增強小鼠體內H9N2禽流感病毒的復制^［5］。另外，學者們還進行了抗流感新藥方面的開發研究。比如，有研究發現，新刺孢曲霉素A、五環三萜類化合物及其衍生物可通過競爭性結合HA蛋白中的SA結合位點，有望成為新型抗病毒入侵抑制劑^［6，7］。另外，以per-O-甲基-β-環糊精為支架所設計的多價化合物可以破壞流感病毒HA蛋白與宿主SA受體蛋白的相互作用，從而阻斷流感病毒進入宿主細胞^［8］。

（2）呼吸道合胞病毒：

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是嬰幼兒呼吸道感染最常見的病原。感染RSV后多數患兒僅表現為上呼吸道感染，而少數則出現嚴重毛細支氣管炎（毛支）和肺炎，并可進一步誘發支氣管哮喘。近年來研究發現，多種細胞因子與RSV疾病的易感性或病情的嚴重程度相關聯。

IL-8主要由單核巨噬細胞產生，在炎癥反應中能夠招募中性粒細胞，增強其浸潤。有研究發現，IL-8 133C/G位點的多態性與RSV疾病的嚴重程度相關聯。另外，IL-1β、IL1-RA、IL-7、表皮生長因子和肝細胞生長因子等炎癥標志物的水平也被發現與RSV疾病的嚴重程度相關。研究發現嚴重RSV患兒機體產生TNF-α和IL-8的能力下降、且與疾病的嚴重程度相關；另外，氣道中IFN-γ和肺表面活性物質（pulmonary surfactant，PS）的減少與嬰幼兒RSV毛細支氣管炎的嚴重程度相關。SP中的SP-A與宿主的天然免疫有關，可直接清除病原。有研究發現，SP-A2基因和SP-B基因的多態性與RSV感染的疾病嚴重程度相關。其他被發現的與RSV疾病的易感性相關的多態性還有CD14（159C/T）、維生素D受體（vitamin D receptor，VDR）（Thr1Meth；rs10735810）等。但是，也有研究并未發現某些基因的多態性與RSV疾病的易感性或病情的嚴重程度相關聯，學者們認為單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）對RSV感染臨床轉歸的影響甚微。

（二）非感染性疾病的分子學發病機制

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是兒童時期最常見的慢性氣道疾病，在全球范圍內嚴重威脅兒童的健康。20年來我國兒童哮喘的患病率呈明顯上升趨勢。哮喘因其癥狀反復，給患兒及家長都帶來了較沉重的心理負擔。同時兒童哮喘在近年來有趨向于嬰幼兒起病的趨勢，所以針對其發病機制的研究已成為熱點。以下介紹目前普遍認為的可能導致哮喘的分子學發病機制。

1.黏蛋白和肺泡表面活性物質

黏蛋白（mucoprotein，MUC）是呼吸道上皮表面黏液中的主要成分。在正常生理條件下黏蛋白起到維持著黏液的黏彈性和協助纖毛的清除作用。然而在病理條件下過度分泌的黏蛋白致使氣道梗阻，是導致哮喘的主要的原因。研究表明在急性哮喘患者中8%有支氣管黏液溢。而對導致氣道黏液高分泌的原因主要認為有以下幾方面：首先是氣道原發性損傷導致呼吸道黏液高分泌，隨后黏液的增多會導致炎癥細胞浸潤，炎癥介質釋放，同時又會引發黏液細胞的增生，如此循環。在此過程中，環境因素導致氣道原發性損傷，炎性細胞和炎性因子促進MUC合成增加。另外，有研究表明除上述因素外細胞因子也可誘導MUC分泌：IL-4能誘導MUC 基因表達增強；IL-9，IL-13可直接誘導MUC基因的表達；最近又有作者報道，IL6、IL17可引起原代培養氣道上皮細胞MUC5B、MUC5AC基因表達，IL-9、IL-13卻無作用。

肺表面活性物質（PS）為一種磷脂蛋白復合物，其作用有維持氣道通暢，防止黏液栓阻塞而降低氣道阻力，從而起到減緩哮喘癥狀和防止哮喘發生的作用。肺泡Ⅱ型上皮細胞（alveolar type Ⅱ cell，AT-Ⅱ）是合成和分泌 PS 的細胞，同時在哮喘的疾病過程中AT-Ⅱ也是受累細胞之一。研究表明：哮喘患者體內肺泡Ⅱ型上皮細胞發生了結構的改變，并伴有AT-Ⅱ細胞凋亡數量增加，同時在哮喘患者體內檢測到了可能誘導AT-Ⅱ細胞凋亡的因素，而這些都會導致PS分泌不足，從而使氣道反應性增高，繼而誘發哮喘。目前有研究試圖采用外援PS彌補哮喘病人PS分泌不足的問題，從而起到緩解哮喘癥狀從而治療哮喘的作用。

2.白細胞三烯

白細胞三烯（leukotrienes，LTs）是哮喘發病機制中重要的炎性介質。其作用有加速炎性細胞在呼吸道內聚集，增加黏液分泌；引起呼吸道平滑肌收縮和促進呼吸道相關細胞增殖等作用。其在哮喘的疾病過程中參與了諸多反應，有研究表明LTs中主要的活性物質是半胱氨酰白三烯 C4、D4 和 E4（LTC4、LTD4 和 LTE4）等，在哮喘患者檢測LTs的水平發現其高于健康人群，提示在疾病過程中通過抑制LTs分泌的上調可作為控制哮喘病情從而治療哮喘的靶標，同時LTs也可作為診斷哮喘的標記物。目前以用于治療的LTs受體拮抗劑-孟魯司特，正是通過與人體呼吸道中LTs受體結合，從而阻斷LTs的病理作用，繼而達到治療疾病的目的。由于其在哮喘治療中的突出效果《全球哮喘防治創議》計劃已將LTs受體拮抗劑作為包括5歲以下幼兒輕度以上持續哮喘患兒的可選擇藥物之一。

3.哮喘相關基因

目前諸多研究都指向支氣管哮喘是一種具有遺傳傾向的變態反應性疾病。而與哮喘相關的基因研究也是熱點。哮喘是一種多基因相關疾病，加之環境因素在其中交互作用，致使哮喘呈現發病機制復雜、癥狀類型多樣且維持時間長短不一。考慮到基因的多效性和環境因素的作用，目前研究將與哮喘相關的基因分為以下四類：

（1）與免疫調節相關的基因：

包括Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）基因等；

（2）與Th2細胞分化相關的基因：

包括IL-13和程序性細胞死亡4（programmed cell death 4，PDCD4）等；

（3）與呼吸道上皮細胞生物功能和黏膜免疫相關的基因：

包括：Th1細胞型趨化因子CCL5等；

（4）與肺功能、呼吸道重塑和疾病嚴重性相關的基因：

包括瞬時受體電位（transient receptor potential，TRP）通道和大腦衍生神經生長因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）。

（三）急性肺損傷

感染性因素和非感染性因素均可引起的急性肺損傷（acute lung injury，ALI），其病理改變是以廣泛性的肺泡上皮細胞和肺微血管內皮細胞的損傷，細胞因子和氧自由基的釋放，中性粒細胞在肺微血管內的滯留和激活，以及微血栓的形成等為特征。重癥的ALI即是急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），ALI還包括其他綜合征，如新生兒或嬰兒呼吸窘迫綜合征（idiopathic respiratory distress syndrome，IRDS），嚴重急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）。

1.肺泡表面活性蛋白

ALI肺泡-毛細管膜的損傷破壞了內皮屏障，造成了肺滲透壓的升高、進行性炎癥反應和非心源性肺水腫，使肺部氣體交換和肺順應性下降，伴隨著肺泡滲出液的形成，造成了肺表面活性物質尤其是肺表面活性物質相關蛋白（pulmonary surfactant-associated protein，SFTP）的失活或缺失。肺表面活性物質（PS）減少和成分改變也是嚴重肺損傷的一個典型病理特征。研究證實，ALI體內存在內源性SP-A代謝異常，支氣管肺泡灌洗液中SP-A異常低下的病人均發展為ARDS，SP-A可作為患者肺損傷程度的指標，并參與ALI和ARDS病理過程的發生與發展。SFTPB的缺乏也可引起嬰兒和成人的呼吸窘迫綜合征。Sftpb基因敲除的小鼠（Sftpb-/-）出生后立刻出現呼吸衰竭，而保留了一個Sftpb等位基因的小鼠（Sftpb+/-）由于還可表達50%的Sftpb而存活。同時，ALI是新生兒呼吸系統常見危重急癥，研究顯示，肺表面活性劑可以治療多種新生兒肺損傷，可作為主要的肺保護制劑使用。

2.急性肺損傷相關基因

ALI/ARDS的病情發展過程，治療效果以及預后都存在著明顯的個體差異，隨著對ALI/ARDS的認識不斷改善，尤其近年來高通量測序及大規模基因組分析包括快速高通量基因表達、基因定位等生物技術的應用。越來越多的研究顯示，基因的多態性與ALI易感性和嚴重程度有關。涉及的基因包括腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細胞介素（IL）、人表面活性蛋白、血管緊張素轉換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）基因、血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VGEF）、胞質球蛋白激酶輕鏈基因（myosin light chain kinase，MLCK）、Clara細胞分泌蛋白16（Clara cells secretory protein 16，CCl6）等，但是，基因多態性等位基因在不同人種的頻率存在差異，而這種差異也顯示了不同人種ALI/ARDS易感性的不同。每種基因可能存在多種多態性，但并非都與疾病有相關性，而且在不同群體中及不同的人種其意義并不相同。因此，目前每一種基因多態性均需要更多的樣本量或群體水平去證實，以及更為深入的分子水平的研究以揭示疾病的本質。

3.微小RNA與急性肺損傷

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長約21～25個核苷酸的內源性非編碼的單鏈小分子RNA，是由具有發夾結構的約70～90個堿基大小的單鏈RNA前體經過RNA酶Ⅲ的加工生成，參與基因表達的調控。研究顯示，凋亡與ALI密切相關，最新的關于miRNA與Ⅱ型肺泡上皮細胞（type Ⅱ alveolar epithelial cell，AECⅡ）凋亡相關的研究，應用高氧誘導大鼠ALI，在不同的時間點觀察細胞凋亡率，應用基因芯片技術和PCR技術來篩選和證實與AECⅡ凋亡相關的miRNA，與H₂O₂損傷前比較，在24小時內有一個顯著變化的miRNA表達譜，與凋亡相關的miRNA包括miR-449A-5P、miR-34b/c-5p、miR-200a/c-3p、miR-146A-5P、miR-141-3P等，且基因芯片技術和PCR技術所得結果具有高度一致性。

二、呼吸系統疾病診斷學技術

（一）病原體分離培養技術

1.細菌培養法

細菌培養法是診斷細菌感染性疾病的金標準，由于標本采集困難，培養方法復雜等條件限制，使得細菌陽性培養率低，無法滿足目前臨床診斷的需要。肺炎鏈球菌是導致兒童社區獲得行肺炎第一大病原菌，據國內研究報道呼吸道感染兒童中肺炎鏈球菌的分離率為5.1%～40.5%，該菌為苛養菌，培養要求高，需要在含有血液或血清的培養基上生長，再加上抗生素的使用以及標本留取不規范等原因，嚴重影響了肺炎鏈球菌的培養陽性率。此外，結核分枝桿菌感染也是導致兒童死亡的重要病原之一，我國有統計顯示兒童痰細菌學檢查陽性的肺結核患病率僅為12.3/10萬，傳統培養方法為固體羅氏培養法，耗時長，需4～6周；近幾年來快速液體培養系統逐漸應用于結核分枝桿菌的臨床檢測，1～3周即可獲得檢測結果，縮短了檢測時間并提高了檢測敏感性，同時還可以對耐藥性進行檢測，WHO推薦在有條件的地區逐步啟用液體培養，包括低收入國家。

2.肺炎支原體分離培養技術

肺炎支原體肺炎約占兒童社區獲得性肺炎的10%～40%，近幾年來發病率呈逐年上升趨勢^［9］。培養標本來源主要有咽拭子、痰液和支氣管灌洗液等。傳統的體外培養方法耗時長，培養率低，難以在臨床檢測中開展。肺炎支原體快速液體培養法24小時后便可根據培養基顏色的變化判斷結果，適用于兒童肺炎支原體感染的早期診斷。

3.病毒分離培養技術

病毒分離培養技術是通過病毒感染敏感的組織細胞，并將其分離鑒定出來的一種方法，是診斷病毒感染如流感病毒、呼吸道合胞病毒感染最可靠的證據。但由于病毒分離一般需要1～2周，且陽性率低，約為50%～60%，成本高，因此只能做回顧性診斷，同樣不適合臨床早期診斷的需要。

（二）免疫學檢測技術

1.免疫熒光檢測技術（immunofluorescence assay，IFA）

免疫熒光檢測技術是用熒光素標記的抗體和相應的抗原形成免疫復合物，借助熒光顯微鏡觀察細胞內相應病毒抗原及其存在的位置。IFA 分為直接法和間接法，其敏感性波動在40%～100%，特異性在86%～99%，可用于各種病毒的檢測。目前，免疫熒光檢測技術已經是應用最為廣泛的呼吸道合胞病毒快速檢測技術，已被WHO推薦為快速診斷呼吸道合胞病毒的首選方法。基于間接IFA法推出的商品化免疫熒光檢測試劑Chemicon能同時檢測RSV、流感病毒A 和B、副流感病毒Ⅰ～Ⅲ型和腺病毒，該方法是一種簡單、穩定、敏感、特異的檢測病毒感染的方法，但是熒光顯微鏡特殊儀器限制了其在臨床上的應用。

2.酶免疫測定（enzyme immunoassay，EIA）

酶免疫測定是將酶催化作用的高效性與抗原抗體反應的特異性相結合的一種微量分析技術。

酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是目前應用較為廣泛的診斷細菌和病毒感染的方法之一，具有較高的特異性和敏感性。肺炎鏈球菌的感染，可通過PLY-ELISA檢測尿樣中完整形式的肺炎球菌溶血素分子（pneumolysin，PLY），或通過 PsaAELISA檢測血清標本中抗肺炎球菌表面黏附素A（pneumococcal surface adhesion A，PsaA）IgG，這兩種方法敏感性和特異性都比較好，可作為肺炎球菌性肺炎流行病調查的理想方法。ELISA還廣泛應用于肺炎支原體的檢測，可分開檢測IgM、IgG，其敏感性和特異性均可達到較高水平^［10］。另外，ELISA可應用于病毒如流感病毒、RSV感染后對病毒結構蛋白或患者血清抗體的檢測。支氣管哮喘患者也可采用ELISA對血清中的常見環境變應原特異性IgE抗體進行定性檢測。

EIA還可應用于結核分枝桿菌感染的檢測，近年來快速發展的γ干擾素釋放試驗（interferon gamma release assay，IGRAs）采用酶聯免疫斑點技術，以結核分枝桿菌特異性抗原早期分泌靶蛋白（early secretory antigenic target，ESAT-6）和 培養濾液蛋白（culture filtrate protein-10，CFP-10）刺激外周血分離的單個核細胞，檢測分泌IFN-γ的T淋巴細胞數量；或者采用酶聯免疫吸附試驗，以ESAT-6、CFP-10、TB7.7抗原刺激全血中致敏T細胞，測定全血中特異性T細胞所釋放的IFN-γ水平。IGRAs在確診結核病患兒中的敏感度可達80%，特異度可達98%。但IGRAs診斷方法的不足是不能區分活動性和潛伏性結核病，也不能區分是近期感染還是既往感染。IGRAs不能作為活動性結核病的確診依據，只可作為一種輔助診斷方法。

3.其他免疫學檢測技術

如光學免疫分析法、免疫層析法及快速測流免疫檢測技術等方法也被應用于兒童呼吸系統疾病診斷的各個領域。

（三）分子生物學檢測技術

1.核酸分子雜交技術

核酸分子雜交技術的原理是利用特異的探針能與互補的核苷酸序列特異結合，通過測定探針上標記的信號來達到檢測目的基因的目的。探針的標記物有放射性核素和非放射性標記物，如地高辛和熒光素等。常用的核酸分子雜交技術主要有Southern 雜交、Northern 雜交、原位雜交（in situ hybridization，ISH）、熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）以及芯片雜交。在診斷學方面，核酸分子雜交技術可用于直接檢測細菌如肺炎鏈球菌，病毒如流感病毒、呼吸道合胞病毒等的核酸，并可同時做出分型，且其陽性率與IFA大致相同，敏感性也有較好的相關性，是分子生物學中常用的傳統基本技術。

2.PCR 技術

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術是在核酸模板、引物和4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應，該技術可在數小時內對僅有幾個拷貝的基因放大百萬倍，以其敏感性高、特異性好、檢測效率高而迅速發展。常用的方法有實時定量PCR（real time quantitative-PCR，RQPCR）、反轉錄 PCR（reverse transcription-PCR，RTPCR）和巢式 PCR（nested PCR，NPCR）等，對呼吸道常見致病菌和病毒檢測的特異性和敏感性較高，并且可以區分亞型。近年來，隨著自動化設備的研發，全自動一體化PCR檢測方法在微生物檢測領域開始得到應用，節省了人力并展現出更好的穩定性。例如，Genexpert^?系統是基于PCR方法的全自動一體化核酸檢測系統，依托該系統的結核分枝桿菌核酸及耐藥基因全自動半巢式PCR（Xpert MTB/RIF）擴增檢測，已獲得歐盟CE認證和我國CFDA認證，并在幾十個國家上市銷售，幫助快速診斷結核/耐藥結核患者，有較高的檢出靈敏度和特異性^［11］。

3.恒溫擴增技術

核酸恒溫擴增技術與PCR類似，其優勢在于對儀器的要求較低，在某一恒定溫度下實現目標核酸序列的擴增，反應時間進一步縮短，更為“快速簡便”，具有較好的發展潛力和應用前景。目前呼吸領域常用的恒溫擴增技術包括DNA環介導恒溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）和實時熒光恒溫擴增（simultaneous amplification and testing，SAT）等^［11］。例如，針對結核分枝桿菌復合群gyrB和IS6110基因的全自動LAMP擴增技術通過將恒溫擴增、實時熒光檢測相結合用于結核分枝桿菌復合群快速半定量性檢測，具有很好的靈敏性和特異性。

4.候選基因突變的篩查方法

（1）通過分子構象進行篩查：

早先的基因突變篩查主要包括基于單鏈DNA構象差別來檢測點突變的單鏈構象多態性檢測（single strand conformation polymorphism，SSCP）、基于異源雙鏈DNA片段與同源雙鏈DNA片段的差異來檢測基因突變的異源雙鏈分析（heteroduplex analysis，HA）和用于檢測較大片段基因突變情況化學錯配裂解法（chemical mismatch cleavage，CMC）等。

（2）測序技術：

伴隨高通量技術和人工智能的發展，DNA序列測序成以其直接、準確、成本合理逐漸成為基因突變檢測的主流方法。通過進行DNA的序列測定即讀取DNA的核酸序列，不僅可以確定突變的部位，還可以確定突變的性質。第一代測序技術為末端終止法測序技術，由Sanger在 20 世紀 70 年代中期發明；第二代測序技術又被通稱為高通量測序技術，推進了基因組相關研究的進展；目前測序技術已經發展到第三代單細胞測序和第四代納米孔測序，測序在基因突變檢測中扮演了越來越重要的角色^［12］。

5.其他技術

如近些年來新近發展起來的基因芯片技術、DNA指紋技術等，已被廣泛應用于基因突變的檢測、耐藥的監測的各個領域。這些方法準確、快速，特異性高，信息量大，臨床應用前景廣闊。

（申阿東）

參考文獻

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