二、新城疫

雞新城疫是由新城疫病毒引起的一種急性敗血性傳染病，俗稱“雞瘟”。即所謂亞洲雞瘟。本病一年四季均可發生，尤以寒冷和氣候多變季節多發。各種日齡的雞均能感染，20～60日齡雞最易感。主要特征是高熱、呼吸困難、下痢、神經紊亂、黏膜和漿膜出血為和壞死。具有很高的發病率和病死率，是危害養禽業的一種主要傳染病。OIE將其列為A類疫病，我國將其列為一類動物疫病。

本病于1926年首次發現于印度尼西亞，同年發現于英國新城。Doyle（1927年）首次證實該病由病毒引起，病原與真性雞瘟病原（禽流感病毒）不同，為了有別于真性雞瘟，故以地名而命名為雞新城疫，此后本病迅速向世界各地傳播。我國新城疫的報道最早于1935年河南。梁英、馬聞天等（1946）經病原分離證實為新城疫。20世紀50年代末于全國范圍流行。雖然已經廣泛接種疫苗預防，但該病仍不時在養禽業中造成巨大的損失，是最主要和最危險的禽病之一。

（一）病毒特征

新城疫病毒屬于負鏈RNA目，副黏病毒科、副黏病毒亞科、禽腮腺炎病毒或禽副黏病毒屬（Avμlavirus）的副黏病毒I型（APMV-1）。新城疫病毒是ssRNA病毒，有包膜，病毒顆粒呈多形性，有圓形、橢圓形和長桿狀等。成熟的病毒粒子直徑100～400nm。包膜為雙層結構膜，由宿主細胞外膜的脂類與病毒糖蛋白結合衍生而來。包膜表面有長12～15nm的刺突，具有血凝素、神經氨酸酶和溶血素。病毒中心是ssRNA分子與附在其上的蛋白質衣殼粒，纏繞成螺旋對稱的核衣殼，直徑約18nm。成熟的病毒以出芽方式釋放至細胞外。

新城疫病毒對外界環境的抵抗力較強，55℃作用45min和直射陽光下作用30min才被滅活。病毒在4℃中存放幾周，在－20℃中存放幾個月或在－70℃中存放幾年，其感染力均不受影響。在新城疫暴發后8周之內，仍可在雞舍、蛋巢、蛋殼和羽毛中分離到病毒。病毒對乙醚敏感。大多數去污劑能將它迅速滅活。氫氧化鈉等堿性物質對它的消毒效果不穩定。3%～5%來蘇爾、酚和甲酚5min內可將裸露的病毒粒子滅活。在37℃的孵卵器內，用0.1%福爾馬林熏蒸6h便可把它滅活。

新城疫病毒的所有毒株都能凝集多種禽類和哺乳類動物的紅細胞。大多數毒株能凝集公牛和綿羊的紅細胞。在病毒的血凝試驗中，雞的紅細胞最為常用。該病毒可在9～12日齡的雞胚絨毛尿囊膜上和尿囊腔中培養，大多數毒株也可在兔、豬、犢牛和猴的腎細胞以及雞組織細胞等繼代或傳代細胞中培養。雞胚的成纖維細胞、雞胚和倉鼠的腎細胞常用于新城疫病毒的培養。

（二）臨床癥狀

速發性嗜內臟型：也稱Doyle氏型新城疫。發病突然，有時雞只不表現任何癥狀而死亡。起初病雞倦怠，呼吸增加，虛弱，死前衰竭（圖1-7），4～8d內死亡。常見眼及喉部周圍組織水腫，拉綠色、有時帶血的稀糞。有幸存活下來的雞，出現陣發性痙攣，肌肉震顫，頸部扭轉，角弓反張。其他中樞神經表現為面部麻痹，偶爾翅膀麻痹。死亡率可達90%以上。

速發性嗜肺腦型：也稱Beach氏型新城疫。表現為突然發病，傳播迅速。可見明顯的呼吸困難、咳嗽和氣喘。有時能聽到“咯咯”的喘鳴聲，或突然的怪叫聲，繼之呈昏睡狀態。食欲下降，不愿走動，垂頭縮頸，產蛋量下降或停止。一兩天內或稍后會出現神經癥狀，腿或翅膀麻痹和頸部扭轉。在有些病例中，成年雞死亡50%以上，常見的死亡率為10%；在未成年的小雞中，死亡率高達90%；火雞死亡率可達41.6%，而鵪鶉的死亡率僅達10%。

中發型新城疫：也稱Beaudette氏型新城疫。主要表現為成年雞的急性呼吸系統病狀，以咳嗽為特征，但極少氣喘。病雞食欲下降，產蛋量降低并可能停止產蛋。中止產蛋可能延續1～3周，偶發病雞不能恢復正常產量，蛋的質量受影響。

緩發型新城疫：也稱Hitchner氏型新城疫。在成年雞中癥狀可能不明顯，可由毒力較弱的毒株所致，使雞只呈現一種輕度的或無癥狀的呼吸道感染，各種年齡的雞只很少死亡，但在小雞并發其他傳染病時，致死率可達30%。

我國根據臨診表現和病程長短把新城疫分為最急性、急性和慢性三個型：

最急性型：此型多見于雛雞和流行初期。常突然發病，無特征性癥狀而迅速死亡。往往頭天晚上飲食活動如常，翌晨發現死亡。

急性型：表現有呼吸道、消化道、生殖系統、神經系統異常。往往以呼吸道癥狀開始，繼而下痢。起初體溫升高達43～44℃，呼吸道癥狀表現咳嗽，黏液增多，呼吸困難而引頸張口、呼吸出聲，雞冠和肉髯呈暗紅色或紫色。精神委頓，食欲減少或喪失，渴欲增加，羽毛松亂，不愿走動，垂頭縮頸，翅翼下垂，雞冠和肉髯呈紫色，眼半閉或全閉，狀似昏睡。母雞產蛋停止或軟殼蛋。病雞咳嗽，有黏性鼻液，呼吸困難，有時伸頭、張口呼吸，發出“咯咯”的喘鳴聲，或突然出現怪叫聲。口角流出大量黏液，為排出黏液，常甩頭或吞咽。嗉囊內積有液體狀內容物，倒提時常從口角流出大量酸臭的暗灰色液體。排黃綠色或黃白色水樣稀便（圖1-8），有時混有少量血液。后期糞便呈蛋清樣。部分病例出現神經癥狀，如翅、腿麻痹，站立不穩（圖1-9），水禽、鳥等不能飛動、失去平衡等，最后體溫下降，不久在昏迷中死去，死亡率達90%以上。1月齡內的雛禽病程短，癥狀不明顯，死亡率高。

慢性型：多發生于流行后期的成年禽。耐過急性型的病禽，常為以神經癥狀為主，初期癥狀與急性型相似，不久有好轉，但出現神經癥狀，如翅膀麻痹、跛行或站立不穩，頭頸向后或向一側扭轉，常伏地旋轉，反復發作。在間歇期內一切正常，貌似健康。但若受到驚擾刺激或搶食，則又突然發作，頭頸屈仰，全身抽搐旋轉，數分鐘又恢復正常。最后可變為癱瘓或半癱瘓，或者逐漸消瘦，終至死亡，但病死率較低。

（三）病理變化

剖檢可見以各處黏膜和漿膜出血，特別是腺胃乳頭和賁門部出血（圖1-10）。心包、氣管、喉頭、腸和腸系膜充血或出血（圖1-11）。直腸和泄殖腔黏膜出血。卵巢壞死、出血，卵泡破裂性腹膜炎等。消化道淋巴濾泡的腫大出血和潰瘍是ND的一個突出特征。消化道出血病變主要分布于：腺胃前部—食道移行部；腺胃后部—肌胃移行部；十二指腸起始部；十二指腸后段向前2～3cm處；小腸游離部前半部第一段下1/3處；小腸游離部前半部第二段上1/3處；梅尼厄氏憩室（卵黃蒂）附近處；小腸游離部后半部第一段中間部分；回腸中部（兩盲腸夾合部）；盲腸扁桃體，在左右回盲口各一處，棗核樣隆起，出血（而不是充血），壞死。

非典型新城疫剖檢可見氣管輕度充血，有少量黏液。鼻腔有卡他性滲出物。氣囊混濁。少見腺胃乳頭出血等典型病變。

（四）流行病學特征

新城疫病毒可經過消化道或呼吸道，也可經眼結膜、受傷的皮膚和泄殖腔黏膜侵入機體，病毒24h內在侵入部位繁殖，隨后進入血液擴散到全身，引起病毒血癥。此時病毒吸附在細胞上，使紅細胞凝集、膨脹，繼而發生溶血。同時病毒還使心臟、血管系統發生嚴重損害，導致心肌變性而發生心臟衰竭，從而引起血液循環高度障礙。由于毛細血管通透性壞死性炎癥，因而臨診上表現嚴重的消化障礙和下痢。在呼吸道則主要發生卡他性炎癥和出血，使氣管被滲出的黏液堵塞，造成高度呼吸困難。在病的后期，病毒侵入中樞神經系統，常引起非化膿性腦炎變化，導致神經癥狀。

雞、野雞、火雞、珍珠雞、鵪鶉易感。其中以雞最易感，野雞次之。不同年齡的雞易感性存在差異，幼雛和中雛易感性最高，兩年以上的老雞易感性較低。水禽如鴨、鵝等也能感染本病，并已從鴨、鵝、天鵝、塘鵝和鸕鶿中分離到病毒，但它們一般不能將病毒傳給家禽。鴿、斑鳩、烏鴉、麻雀、八哥、老鷹、燕子以及其他自由飛翔或籠養的鳥類，大部分也能自然感染本病或伴有臨診癥狀或取隱性經過。歷史上有好幾個國家因進口觀賞鳥類而招致了本病的流行。

病雞是本病的主要傳染源，雞感染后臨床癥狀出現前24h，其口、鼻分泌物和糞便就有病毒排出。病毒存在于病雞的所有組織器官、體液、分泌物和排泄物中。在流行間歇期的帶毒雞，也是本病的傳染源。鳥類也是重要的傳播者。

病毒可經消化道、呼吸道，也可經眼結膜、受傷的皮膚和泄殖腔黏膜侵入機體。該病一年四季均可發生，但以春秋季較多。雞場內的雞一旦發生本病，可于4～5d內波及全群。

（五）預防及治療

對于本病的預防要加強雞群的飼養管理工作，包括建立一套科學合理的雞舍通風系統，減少對雞群的應激等；加強雞場的生物安全措施，包括一系列消毒隔離措施等；通過免疫接種增強雞群對新城疫的抵抗力。

要做好免疫，新城疫的免疫原則如下：

（1）及早實施免疫，提前建立局部黏膜抵抗力。

（2）活疫苗與滅活苗聯合使用。活疫苗免疫后產生免疫應答早、免疫力完全，缺點是產生的體液抗體低且維持時間短。滅活苗免疫能誘導機體產生堅強而持久的體液抗體，但產生免疫應答晚，且不能產生局部黏膜抗體。兩種疫苗聯合使用可以做到優勢互補，給雞群提供堅強且持久的保護。

（3）根據抗體水平，及時補充免疫。當前主要以非典型新城疫發生為主，原因是雞群抗體不均勻有效，因而監測雞群的抗體水平非常重要，要保證HI抗體水平育成期不低于6，蛋雞不低于9。

建議的免疫程序如下。

首免：1～3日齡，Ⅱ系、Ⅳ系或克隆株疫苗。

二免：首免后1～2周，VH、Ⅳ系或克隆株。

三免：二免后2～3周，活苗+滅活苗。

四免：8～10周齡，Ⅳ系或克隆株氣霧免疫或點眼。

五免：16～18周齡，活苗+滅活苗。

產蛋期：根據抗體水平及時補免或兩個月免疫1次活疫苗。在做好免疫的同時，加強飼養管理，做好消毒工作。

存在本病或受本病威脅的地區，預防的關鍵是對健康雞進行定期免疫接種。平時應嚴格執行防疫規定，防止病毒或傳染源與易感雞群接觸。

發生本病時應按《動物防疫法》及其有關規定處理。撲殺病禽和同群禽，深埋或焚燒尸體；污染物要無害化處理；對受污染的用具、物品和環境要徹底消毒。對疫區、受威脅區的健康雞立即緊急接種疫苗。

雞新城疫的危害性極大，所以一旦發現要及早進行治療，直到完全治愈，恢復好再將雞回群。另外對于沒有治療價值或已經病死的雞要進行深埋或者焚燒，受到污染的用具和物品要徹底消毒，避免對其他雞群造成傷害。

新城疫突發病雞的治療：

對于突然發病，只是單純新城疫感染的雞群，先免疫后用藥物。

新城疫四系苗4倍量（最后一次新城疫免疫劑量+2個劑量）+植物血凝素800只/瓶集中飲水1次。板青毒克每瓶150kg水，桿必治每袋150kg水，配合，在免疫24h后，開始投服，上下午集中兩次飲水，連用3d。

對新城疫混合感染病雞的治療：

不能排除混合感染的情況，特別是混合有流感。應先用藥，后用苗。

敗毒金剛每瓶150kg水，桿必治每袋150kg水，配合，上下午集中兩次飲水，連用3d。間隔24h后酌情免疫。新城疫四系苗4倍量（最后一次新城疫免疫劑量+2個劑量）+植物血凝素800只/瓶集中飲水1次。

新城疫繼發大腸桿菌病雞的治療：

新城疫繼發大腸桿菌病比較常見，以肉雞最為嚴重。

芪林雙星每瓶150kg水，桿菌先鋒每袋150kg水，配合集中飲水，連用3d。

雞新城疫中藥治療方法：

生石膏1200g，生地黃300g，水牛角600g，黃連200g，梔子300g，丹皮200g，黃芩250g，赤芍250g，玄參 250g，知母300g，連翹300g，桔梗250g，甘草150g，淡竹葉250g，地龍200g，細辛5g，干姜10g，板藍根150g，青黛100g，共同粉碎，0.5%～1%拌料或煲水，藥液飲水，藥渣拌料。

（六）實驗室檢測

依據標準：GB/T 16550—2008。

1.范圍

本標準規定了新城疫的臨床診斷、病毒分離與鑒定、血凝試驗、血凝抑制試驗、反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）和綜合判定。

2.縮略語

下列縮略語適用于本標準。

DEPC——焦炭酸二乙酯。

HA——血凝。

HAU——血凝單位，以完全凝集病毒的血清最高稀釋倍數為一個血凝單位。

HI——血凝抑制。

ICPI——腦內接種致病指數。

IVPI——靜脈接種致病指數。

MDT——致死雞胚平均死亡時間。

NDV——新城疫病毒。

SPF——無特定病原體。

3.病毒分離與鑒定

（1）病毒分離

1）樣品采集　從活禽采集的樣品應包括氣管和泄殖腔拭子，后者需帶有可見糞便，對雛禽采集拭子容易造成損傷，可采集新鮮糞便代替。死禽以腦、肺臟、脾臟為主，也可采集其他病變組織。

2）樣品處理　樣品置于含抗生素的等滲磷酸鹽緩沖液（PBS）（pH7.0～7.4），抗生素視條件而定，在組織和氣管拭子保存液中應含青霉素（2000UI/ml）、鏈霉素（2mg/ml）、卡那霉素（50μl/ml）和制霉菌素（1000UI/ml），而糞便和泄殖腔拭子保存液抗生素濃度應提高5倍。加入抗生素后調pH值到7.0～7.4。糞便和攪碎的組織，應和含抗生素的PBS溶液制成10～20g/100ml的懸浮液，在室溫下靜置1～2h。將糞便或組織的懸浮液在4℃下以3000g離心5min，取上清液進行雞胚接種。

3）雞胚接種　用1ml注射器吸取上清液，按每枚0.2ml，經尿囊腔接種至少5個9～11日齡的SPF雞胚，接種后，35～37℃孵育4～7d，18h后每8h觀察雞胚死亡情況。

4）病毒收獲　18h以后死亡和瀕死的以及結束孵化后時存活的雞胚置4℃冰箱4～24h，無菌采集尿囊液。

（2）病毒鑒定

1）血凝試驗　對于血凝試驗呈陽性的樣品采用新城疫標準陽性血清進一步進行血凝抑制試驗。如果沒有血凝活性或血凝效價很低，則采用SPF雞胚用初代分離的尿囊液繼續傳兩代，若仍為陰性，則認為新城疫病毒陰性。

2）血凝抑制試驗　采用新城疫標準陽性血清進行血凝抑制試驗，確認是否有新城疫病毒繁殖。

（3）致病指數測定　經確定存在新城疫病毒繁殖的情況下，應根據下列指標之一進行毒力判定：

1）病毒致死雞胚平均死亡時間（MDT）的測定：

① 將新鮮的感染尿囊液用滅菌的生理鹽水連續10倍稀釋成10－6～10－9 ；

② 每個稀釋度經尿囊腔接種5個9～10日齡的SPF雞胚，每個雞胚接種0.1ml，置于37℃培養；

③ 余下的病毒稀釋液于4℃保存，8h后，每個稀釋度接種另外5個雞胚，每個雞胚接種0.1ml，置37℃培養；

④ 每日照蛋兩次，連續觀察7d，記錄各雞胚的死亡時間；

⑤ 最小致死量是指能引起所有用此稀釋度接種的雞胚死亡的最大稀釋度；

⑥ MDT是指最小致死量引起所有雞胚死亡的平均時間（h），計算方法見式（1-1）。

MDT=　　 （1-1）

式中　NX——Xh內死亡的胚胎數；

　　　NY——Yh內死亡的胚胎數；

　　　X，Y——胚胎死亡時間，單位為h；

　　　T——死亡的胚胎總數。

2）接種致病指數（ICPI）測定：

① HA滴度高于4log2（大于1/16）以上新鮮感染尿囊液（24～48h，細菌檢驗為陰性），用無菌等滲鹽水作10倍稀釋；

② 腦內接種出殼24～48h之間的SPF雛雞，共接種10只，每只接種0.05ml；

③ 每24h觀察1次，共觀察8d；

④ 每天觀察應給雞打分，正常雞記作0，病雞記作1，死雞記作2（每只死雞在其死后的每日觀察中仍記2）；

⑤ ICPI是每只雞8d內所有每次觀察的平均數，計算方法見式（1-2）。

ICPI=　　 （1-2）

式中　∑s——8d累計發病數；

　　　∑d——8d累計死亡數；

　　　T——8d累計觀察雞的總數。

3）接種致病指數（IVPI）測定：

① HA滴度高于4log2（大于1/16）以上新鮮感染尿囊液（24～48h，細菌檢驗為陰性），用無菌等滲鹽水作10倍稀釋；

② 靜脈接種6周齡的SPF小雞，接種10只，每只接種0.1ml；

③ 每天觀察1次，共10d，每次觀察要計分，正常雞記作0，病雞記作1，癱瘓雞或出現其他神經癥狀記作2，死亡雞記作3（每只死雞在其死后的每日觀察中仍記作3）；

④ IVPI是指每只雞10d內所有每次觀察數值的平均值，計算方法見（1-3）。

IVPI=　　 （1-3）

式中　∑s——10d累計發病數；

　　　∑p——10d累計癱瘓數；

　　　∑d——10d累計死亡數；

　　　T——10d累計觀察雞的總數。

（4）結果判定　結果判定細則如下：

1）MDT低于60h為強毒性NDV，MDT在60～90h為中等毒力型NDV，MDT大于90h為低毒力NDV；

2）ICPI越大，NDV致病性越強，最強毒力病毒的ICPI接近2.0，而弱毒株毒力的ICPI為0；

3）IVPI越大，NDV致病性越強，最強毒力病毒的IVPI接近3.0，而弱毒株的IVPI為0。

4.血凝（HA）與血凝抑制（HI）試驗

（1）原理　新城疫病毒表面的血凝素能與豚鼠和雞的紅細胞表面的血凝素受體結合，引起紅細胞凝集。

（2）適用范圍　主要用于檢測新城疫免疫動物血清抗體效價。

（3）試驗材料

1）96孔110°V形血凝板

2）微量移液器（50μl、25μl）帶滴頭

3）微量振蕩器

4）新城疫病毒血凝素分型抗原和標準分型陽性血清

5）1%SPF雞或新城疫抗體陰性雞紅細胞懸液（配制方法見附錄A）

6）pH7.2 0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）（配制方法見附錄B）

（4）HA試驗方法

1）在微量反應板的1～12孔均加入0.025ml PBS，換滴頭。

2）吸取0.025ml病毒懸液加入第1孔，混勻。

3）從第1孔吸取0.025ml病毒液加入第2孔，混勻后吸取0.025ml加入第3孔，如此進行對倍稀釋至第11孔，從第11孔吸取0.025ml棄之，換滴頭。

4）每孔再加入0.025ml PBS。

5）每孔均加入0.025ml 體積分數為1%雞紅細胞懸液（將雞紅細胞懸液充分搖勻后加入）。

6）振蕩混勻，在室溫（20～25℃）下靜置40min后觀察結果（如果環境溫度太高，可置4℃環境下反應1h）。對照孔紅細胞將呈明顯的紐扣狀沉到孔底。

7）結果判定　將板傾斜，觀察血凝板，判讀結果（見表1-3）。

能使紅細胞完全凝集（100%凝集，++++）的抗原最高稀釋度為該抗原的血凝效價，此效價為1個血凝單位（HAU）。注意對照孔應呈現完全不凝集（－），否則此次檢驗無效。

（5）HI試驗方法

1）根據（4）的試驗結果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀釋倍數作為終點，終點稀釋倍數除以4即為含4HAU的抗原的稀釋倍數。例如，如果血凝的終點滴度為1∶256，則4HAU抗原的稀釋倍數應是1∶64（256除以4）。

2）在微量反應板的1～11孔加入0.025ml PBS，第12孔加入0.05ml PBS。

3）吸取0.025ml血清加入第1孔內，充分混勻后吸0.025ml于第2孔，依次對倍稀釋至第10孔，從第10孔吸取0.025ml棄去。

4）1～11孔均加入含4HAU混勻的病毒抗原液0.025ml，室溫（約20℃）靜置至少30min。

5）每孔加入0.025ml體積分數為1%的雞紅細胞懸液混勻，振蕩混勻，靜置約40min（室溫約20℃，若環境溫度太高可置4℃條件下進行），對照紅細胞將呈現紐扣狀沉于孔底。

6）結果判定　以完全抑制4個HAU抗原的血清最高稀釋倍數作為HI滴度。只有陰性對照孔血清滴度不大于2log2，陽性對照孔血清誤差不超過1個滴度，試驗結果才有效。HI價小于或等于3log2判定HI試驗陰性；HI價等于4log2為可疑，需重復試驗；HI價大于或等于5log2為陽性。

5.反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）

（1）儀器設備　所用儀器設備如下：

1）PCR儀；

2）高速臺式冷凍離心機：最大離心力12000g以上；

3）生物安全柜；

4）冰箱；

5）水浴鍋；

6）微量移液器；

7）組織勻漿器；

8）電泳儀；

9）電泳槽；

10）紫外凝膠成像儀。

（2）試劑　所用試劑如下：

1）RNA提取試劑Trizol；

2）三氯甲烷；

3）異丙醇；

4）75%乙醇：用新開啟的無水乙醇和DEPC水配制，－20℃預冷。

（3）操作程序

1）樣品的采集和處理　取200μl離心后的上清提取RNA。也可選擇含病毒的雞胚尿囊液進行RT-PCR鑒定。

2）病毒核酸RNA的提取　RNA核酸的提取應在樣品制備區。應保證無菌及核酸污染，實驗材料和容器應經過消毒處理并一次性使用。提取RNA時應避免RNA酶污染。同時設立陽性對照和陰性對照。

用Trizol提取核酸RNA的操作步驟如下（樣品以雞胚尿囊液為例）：

① 在無RNA酶的1.5ml離心管中加入200μl尿囊液后，加入1ml Trizol，振蕩20s，室溫靜置10min；

② 加入200μl三氯甲烷，顛倒混勻，室溫靜置10min，以12000r/min離心15min；

③ 管內液體分為三層，取500μl上清液于離心管中，加入500μl預冷（－20℃）的異丙醇，顛倒混勻，靜置10min，以12000r/min離心15min，沉淀RNA，棄去所有液體（離心管在吸水紙上控干）；

④ 加入700μl預冷（－20℃）的75%乙醇洗滌，傾倒混勻2～3次，以12000r/min離心10min；

⑤ 調水浴至60℃，室溫下干燥10min；

⑥ 加入40μl DEPC水，60℃作用10min，充分溶解RNA，－70℃保存或立即使用。

3）配置RT-PCR反應體系　在樣品處理區內由專人按表1-4給出的程序分步進行。注意只能在試劑準備區打開和配制試劑，配制完畢后應及時將剩余試劑放回貯存區域。將適量的核酸樣品小心加入裝有反應液體的反應管內，蓋緊蓋子做好標記。參照表1-4反應體系配置RT-PCR擴增。

4）RT-PCR　按照表1-4中的加樣順序全部加完后，充分混勻，瞬時離心，使液體都沉降到PCR管底。在每個PCR管中加入一滴液體石蠟（約20μl）。同時設立陽性對照和陰性對照。

循環條件為：

① 第一階段，反轉錄42℃/45min；

② 第二階段，預變性95℃/3min

③ 第三階段，94℃/30s，55℃/30s，72℃/45s，30個循環；

④ 第四階段，72℃/7min。

最后的RT-PCR產物置4℃保存。

5）電泳　操作程序如下：

① 制備1.5%瓊脂糖凝膠板；

② 取5μl PCR產物與0.5μl加樣緩沖液混合，加入瓊脂糖凝膠板的加樣孔中；

③ 加入DNA分子質量標準物；

④ 蓋好電泳儀，插好電極，5V/cm電壓電泳，30～40min；

⑤ 紫外線燈下觀察結果，凝膠成像儀掃描圖片存檔，打印；

⑥ 用分子質量標準物比較判斷PCR片段大小。

（4）結果判定　結果判定細則如下：

1）出現0.5kb大小左右的目的片段（與陽性對照大小相符，瓊脂糖濃度1.5%，標準物質Marker為DL2000），而陰性對照無目的片段出現方可判為新城疫病毒陽性；

2）對于擴增到的目的片段，需進一步進行序列測定，從分子水平確定其致病性強弱。

3）根據序列測定結果，對毒株F基因編碼的氨基酸序列進行分析，如果毒株F2蛋白的C端有“多個堿性氨基酸殘基”，F1蛋白的N端即117位為苯丙氨酸，可確定為新城疫強毒感染。“多個堿性氨基酸”指在113位到116位殘基之間至少有三個精氨酸或賴氨酸。

附錄 A

（資料性附錄）

1%雞紅細胞懸液制備

采集至少三只SPF公雞或無禽流感和新城疫抗體的非免疫雞的抗凝血液，放入離心管中，加入3～4倍體積的PBS混勻，以2000r/min離心5～10min，去掉血漿和白細胞層，重復以上過程，反復洗滌3次（洗凈血漿和白細胞），最后吸取壓積紅細胞，用PBS配成體積分數為1%的懸液，于4℃保存備用。

附錄B

（資料性附錄）

pH7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）配制

氯化鈉（NaCl）　　　　　　　 　　　8.0g

氯化鉀（KCl）　　　　　　　　　　　0.2g

磷酸氫二鈉（Na2HPO4）　　　  　　　1.44g

磷酸二氫鈉（NaH2PO4）　　　　   　　0.24g

加蒸餾水至1000ml

將上述成分依次溶解，用鹽酸調至pH7.2，分裝，121℃、15min高壓滅菌。