八、禽白血病

禽白血病又稱禽白細胞增生病（Avian leukosis），是由禽白血病/肉瘤病毒群引起的禽類多種腫瘤性疾病的通稱，包括淋巴細胞性白血病、成紅細胞性白血病、成髓細胞性白血病、骨髓細胞瘤、血管內皮瘤、腎瘤和腎胚細胞瘤、肝瘤、纖維肉瘤、骨石化（硬化）病、結締組織瘤等。自然條件下最常見的是淋巴細胞性白血病。OIE將本病列為B類動物疫病，我國把其列為二類動物疫病。

本病造成的經濟損失主要有以下幾個方面：

（1）引發腫瘤直接造成感染雞死亡，通常情況下本病的病死率為2%～3%，有時在種雞群可達23%以上。

（2）通過病毒的亞臨床感染（非腫瘤性綜合征），嚴重影響雞群的生產性能和免疫應答能力，造成免疫反應性降低、性成熟推遲、母雞產蛋率下降、蛋重下降、受精率和孵化率下降等。

（3）大部分種雞可以通過種蛋持續或間歇性排毒，垂直感染下一代，而先天性感染的子代雞群會產生免疫耐受，這些雞外表看似健康，但其血液中含毒量ID50可高達109個/ml。

（4）污染以雞胚為原料生產的人和動物的疫苗，導致該病的傳播。

禽白血病是一種世界性分布的疾病，目前在許多國家已得到很好的控制。

（一）病毒特征

禽白血病/肉瘤病毒（Avian leukosis/ sarcoma virus，ALV），屬反轉錄病毒科（reoviridae）甲型反轉錄病毒屬（舊稱C型反轉錄病毒）。病毒粒子近似球形，直徑為80～120nm，有囊膜，其蔗糖浮密度為1.15～1.17g/ml。

根據病毒中和試驗、宿主范圍及分子特性，分離自雞的白血病/肉瘤病毒可分為A、B、C、D、E和J六個亞群，每一個亞群由幾種不同種類的抗原型組成，同一個亞群的病毒具有不同程度的交叉中和反應，但除了B亞群和D亞群外，不同亞群之間沒有交叉反應。

A～D亞群為外源性病毒，宿主為雞，具有完整的病毒顆粒，有傳染性。在蛋雞群中A亞群最為普遍，其次為B亞群，主要引起3月齡以上的雞發生腫瘤。C、D亞群致病力低，也能引起腫瘤的發生，但比較少見。E亞群是內源性病毒，可整合進雞的染色體中，通常不致病。J亞群于1988年在英國發現，外源性，宿主為雞，引起髓細胞瘤，對肉用雞危害嚴重。

此外，從幾個品種的野雞中分離到的內源性病毒歸屬于F、G亞群，從斑鳩中分離到的內源性病毒歸屬于H亞群，從鵪鶉中分離到的內源性病毒歸屬于I亞群。

本病毒群中的勞氏肉瘤病毒（RSV）和其他肉瘤病毒可以感染1日齡雛雞，用其接種1日齡雞胚絨毛尿囊膜后可引起種瘤（痘）斑。接種雞胚成纖維細胞后可引起細胞快速向腫瘤狀態轉化。

本病毒對脂溶劑和去污劑敏感，乙醚、氯仿和十二烷基硫酸鈉可破壞病毒。對熱不穩定，在50℃半衰期為9min，60℃半衰期為40s，56℃30min可使之滅活。該病毒只有在－60℃以下才能較長時間保存而不喪失感染力，但不耐反復凍融。0.3%甲醛48h病毒可完全滅活。

（二）臨床癥狀

自然感染潛伏期長短不等，傳播緩慢，持續時間長，無發病高峰。

由禽白血病/肉瘤病毒引起的種瘤種類很多，其中對養禽業危害較大、流行較廣的白血病類型包括淋巴細胞性白血病、成紅細胞性白血病、成骨髓細胞性白血病、骨髓細胞瘤病、血管瘤、腎瘤和腎胚細胞瘤、肝癌、骨石化（硬化）病等。各病型的表現有差異。

淋巴細胞性白血病：自然病例多見于14周齡以上的雞。臨診見雞冠蒼白、腹部膨大，觸診時營可觸摸到肝、法氏囊和腫大的腎，羽毛有時有尿酸鹽和膽色素沾污的斑。

成紅細胞性白血病：病雞虛弱、消瘦和腹瀉，血液凝固不良，致使羽毛囊出血。

成髓細胞性白血病：病雞貧血、衰弱、消瘦和腹瀉，血凝固不良致使羽毛囊出血。外周血液中白細胞增加，其中成細胞占3/4。

血管瘤：見于皮膚表面，血管腔高度擴大形成“血皰”，通常單個發生。“血皰”破裂可引起嚴重失血而死亡。

一般情況下，禽白血病病雞無特異的臨診癥狀，有的病雞甚至可能完全沒有癥狀，感染率高的雞群產蛋量很低。

（三）病理變化

各病型的病理變化有差異。

淋巴細胞性白血病：剖檢（16周齡以上的雞）可見結節狀、粟粒狀或彌漫性灰白色腫瘤，主要見于肝、脾和法氏囊，其他器官如腎、肺、性腺、心、骨髓及腸系膜也可見。結節性腫瘤大小不ー，以單個或大量出現。粟粒狀腫瘤多見于肝臟，呈均勻分布于肝實質中。肝發生彌散性腫瘤時（圖1-32），呈均勻腫大，比正常增大幾倍，且顏色為灰白色，俗稱“大肝病”，這是本病的主要特征。根據肝臟腫瘤形態和分布特點，可分為結節型、彌漫型、顆粒型和混合型4種類型。

結節型：肝腫大，可見黃豆大到鴿蛋大或雞蛋大的灰白色腫瘤結節，在器官表面一般呈扁平或圓形，與周圍界限清楚，瘤體柔軟、平滑、有光澤。

彌漫型：肝臟腫瘤細胞彌漫性增生，肝內有無數細小的灰白色瘤灶，使肝腫大呈灰白色或黃白色，比正常大幾倍。

顆粒型：肝腫大，有多量灰白色小點，肝表面呈顆粒狀而高低不平。

混合型：主要表現為肝內有大量灰白色或灰黃色大小不等的瘤體，形態各異，有的呈顆粒狀，有的呈結節狀，有的呈彌漫性大片病灶。

脾臟變化與肝相同，體積增大，呈灰棕色或紫紅色，在表面和切面上可見許多灰白色腳瘤病，偶爾也有凸出于表面的結節。法氏囊腫大，剖面皺壁有白色隆起或結節增生，隨瘤體發育法氏囊也增大，失去原有結構。瘤體剖面有時有干酪樣壞死或豆腐渣樣物質。腿骨的紅骨中有明顯的白色結節性瘤病變，有時也可見彌漫性增生、骨髓褪色。肺臟、腎臟腫大，色變淡，切面常有顆粒性增生結節或有較大的灰白色瘤組織。

雞到開產期胸腺已萎縮，呈小豆大或米粒大扁平狀，如遭白血病侵害，胸腺腫大呈指頭狀串珠樣排列，切面白色均勻。胰腺腫大2～3倍。卵巢間質有瘤組織增生，受侵害的卵巢為灰白色呈均勻腫塊狀，整體外觀呈菜花狀。此外，心、肺、腸、睪丸等也可見腫瘤結節。

成紅細胞性白血病：血液凝固不良致使羽毛囊出血。分增生型（胚型）和貧血型兩種。

增生型以血流中成紅細胞大量增加為特點。特征病變是肝、脾、腎彌散性腫大，呈櫻桃紅色或暗紅色，且質軟易脆。骨增生、軟化或呈水樣，呈暗紅色或櫻桃紅色。

貧血型以血流中成紅細胞減少、血液淡紅色、顯著貧血為特征。剖檢可見內臟器官（尤其是脾）萎縮，骨髓色淡呈膠凍樣。

成細胞性白血病：骨髓質地堅硬，呈灰紅或灰色。實質器官增大而質脆，肝臟有灰色彌漫性腫瘤結節。晚期病例，肝、腎、脾出現彌漫性灰色浸潤，使器官呈斑駁狀或顆粒狀外觀。

骨髓細胞瘤：特征病變是骨骼上長有暗黃白色、柔軟、脆弱或呈干酪狀的骨細胞瘤，通常發生于肋骨與肋軟骨連接處、胸骨后部、下頜骨和鼻腔軟骨處，也見于頭骨的扁骨，常見多個腫瘤，一般兩側對稱。

血管瘤：可見于內臟表面，血管腔高度擴大形成“血皰”。

近年來出現的J亞群白血病病毒感染，原發腫瘤主要是骨髓，骨髓瘤擴張時可擠破骨質到達骨膜下而成為肉眼可見的腫瘤病灶。病初多見于胸骨、肋骨、骨盆、髖關節、膝關節周圍以及頭骨和椎骨，尤其以胸骨和肋骨的骨髓瘤病灶出現最早，病變部位的骨膜下可見白色石灰樣增生的腫瘤組織，可與其他亞群白血病及馬立克氏病區別。隨著疾病的進一步發展，腫瘤組織可廣泛出現于肝臟、脾臟、腎臟、卵巢和睪丸等器官，此時與其他類型白血病的區別較為困難。

（四）流行病學特征

易感動物：雞、鴨、鵝和野鴨是該群病毒中所有病毒的自然宿主，尤其以肉雞最易感。鷓鴣、鵪鶉將也會感染此病。雞的品種不同其易感性有差異，產褐色蛋的母雞易感性較強。主要侵害26～32周齡雞，35周齡以上很少發病。

傳染源：病雞和帶毒雞是本病的傳染源。公雞是病毒的攜帶者，它通過接觸及交配成為感染其他雞的傳染源。

傳播途徑：經卵垂直傳播是病毒的主要傳播方式，接觸及交配等水平傳播也是本病的重要傳播方式。母雞的輸卵管壺腹部含有大量的病毒并可在局部復制，因此雞胚和卵白蛋白也攜帶有白血病病毒，從而使新生雛雞長期持續攜帶病毒。另外，污染的糞便、飛沫、脫落的皮膚等都可通過消化道使易感雞感染。人工接種污染了禽白血病病毒的各種禽用疫苗可造成本病水平傳播。

流行形式及因素：病毒感染雞群后可出現以下4種狀態，即無病毒血癥無抗體狀態（V－A－）、無病毒血癥而有抗體狀態（V－A+）、有病毒血癥而無抗體狀態（V+A－）和有病毒血癥也有抗體狀態（V+A+）。先天性感染的雞可形成免疫耐受，因而常常出現V+A－現象，這種病雞是該病凈化的主要對象。

（五）預防及治療

藥物治療及免疫接種的效果不佳。該病的防控策略和方法是通過對種雞檢疫、淘汰陽性雞，以培育出無ALV的健康雞群，也可通過選育對禽白血病有抵抗力的雞種，結合其他綜合性疫病控制措施來實現。用于制備疫苗的雞胚尤其要加強病毒的監測，嚴防污染。

目前，國內外通常采用 ELISA檢測ALV群特異性抗原P27的方法，以揭示任何亞群禽白血病病毒的存在狀況，從而可以檢出ALV帶毒雞或排毒雞，故使白血病病雞的凈化和淘汰計劃能夠實現。雞白血病凈化的重點在原種場，也可在祖代場進行。通常推薦的程序和方法是雞群在8周齡和18～22周齡時，將種雞分別編號，用 ELISA方法檢查泄殖腔拭子中ALV抗原，然后在開產期（22～24周齡）檢查種蛋蛋清中和雛雞胎糞中的ALV抗原。陽性雞及其種雛一律淘汰。經過持續不斷的檢疫，并將假定健康的非帶毒雞嚴格隔離飼養，最終達到凈化種群的目的。為了減少或排除水平傳播，所有設備如孵卵器、育雛舍等都應在每次使用前徹底消毒，不同年齡的雞不應混群。雞群應采取全進全出飼養模式。

對于某些污染嚴重的原種場，應及時更換品系。某些祖代和父母代種雞場存在該病時，采取上述凈化措施常常并不現實，應以提高飼養管理水平，及時淘汰瘦弱、貧血及患大腸桿菌病雞，并加強日常衛生管理和消毒措施，尤其是孵化后的階段，以減少該病的水平傳播和疾病損失。

此外，種雞在交配前，種公雞和種母雞分開飼養；進行其他疫苗接種時，應減少一枚針頭連續注射種雞的數量，從而可減少該病水平傳播的機會。

（六）實驗室檢測

1.禽白血病病毒P27抗原酶聯免疫吸附試驗

參照標準：NY/T 680—2003。

（1）實驗材料

1）試劑

抗p27蛋白抗體：應用提純的禽成髓細胞性白血病病毒p27蛋白免疫家兔制備。

陽性抗原：含雞白血病/肉瘤病毒群特異性p27蛋白抗原的雞蛋清。

陰性血清：無雞白血病/肉瘤病毒群特異性p27蛋白抗原的SPF雞蛋清。

酶結合物：辣根過氧化物酶標記的抗p27蛋白抗體。

磷酸鹽緩沖液（PBS）：配制見附錄A。

包被液：配制見附錄A。

洗滌液：配制見附錄A。

樣品稀釋液：配制見附錄A。

底物溶液：配制見附錄A。

終止液：配制見附錄A。

2）器材

酶聯檢測儀；

聚苯乙烯板；

微量加樣器，容量50～200μl；

37℃恒溫箱培養。

3）樣品

雞蛋樣品：將待檢雞蛋小的一端朝上放置，打碎蛋殼，用移液器無菌吸取蛋清，密裝于滅菌小瓶內。

細胞培養物：用移液器無菌吸取細胞培養物，密裝于滅菌小瓶內，4℃或－30℃保存或立即送檢。試驗前將送檢樣品統一編號，試驗時不做稀釋。

（2）操作方法

1）用包被液將抗p27蛋白抗體作4000倍稀釋，每孔100μl加入96孔聚苯乙烯板中，4℃過夜。

2）取出包被好的聚苯乙烯板，將液體倒棄，每孔加250μl洗滌液漂洗3次，每次2min，甩干。

3）每孔加150μl質量濃度為1%的明膠封閉液，37℃反應60min。

4）重復2）。

5）在A1、A2孔各加100μl標準陰性對照，A3、A4孔各加100μl標準陽性對照。

6）將待檢樣品加入其他各孔，每個待檢樣品加兩孔，每孔100μl，37℃反應60min。

7）重復2）。

8）每孔加100μl工作濃度的辣根過氧化物酶標記的抗p27蛋白抗體，37℃反應60min。

9）重復2）。

10）每孔加100μl新配制的底物溶液，室溫，避光反應10min。

11）每孔加100μl終止液。

12）置酶聯檢測儀于450nm測定各孔吸光度（OD）值。

（3）結果判定

1）陰性對照OD均值等于（A1孔OD值+A2孔OD值）/2；陽性對照OD均值等于（A3孔OD值+A4孔OD值）/2。

2）陰性對照OD均值小于0.15，陽性對照OD均值減去陰性對照OD均值大于0.3時試驗成立，否則重做。

3）S/P值等于（樣品孔OD均值-陰性對照OD均值）/（陽性對照OD均值-陰性對照OD均值）。

待檢樣本S/P≤0.2判為陰性，表示待檢樣品中無ALVsp27蛋白抗原。

待檢樣本S/P>0.2判為陽性，表示待檢樣品中有ALVsp27蛋白抗原。

2.病毒分離培養檢測和鑒定

參照標準：GB/T 26436—2010。

（1）試劑和儀器

1）試劑　DMEM液體培養基（pH7.2）、0.25%胰酶、磷酸鹽緩沖（0.01mol/L PBS，pH7.2）、抽提緩沖液、青霉素（10萬U/ml）、鏈霉素（10萬U/ml）、抗ALV單抗、抗ALV單因子雞血清、異硫氰酸熒光素（FITC）標記的山羊抗小鼠IgG抗體、ALV-p27抗原酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒、聚合酶鏈式反應（PCR）試劑、RT-PCR試劑、生理鹽水（0.9%氯化鈉）、無水乙醇（分析純）、丙酮（分析純）、甘油（分析純）、75%酒精、碘酒、細胞生長液（含有5%胎牛血清或小牛血清的DMEM液體培養基）、細胞維持液（含有1%胎牛血清或小牛血清的DMEM液體培養基）、大腸桿菌（TG1）、蛋白酶K、70%冷乙醇、乙酸鈉（分析純）、三氯甲烷（分析純）、異戊醇（分析純）、10×加樣緩沖液、瓊脂糖、DL2000DNA Marker、TAE電泳緩沖液、氯化鈣（0.1mol/L）、氨芐青霉素（100μg/μl）、雙蒸水、LB液體培養基、TE緩沖液、RNase、細胞裂解液、0.1%的DEPC（焦碳酸乙二脂）、水等。

2）儀器　錐形瓶、熒光顯微鏡、恒溫培養箱、冷凍臺式離心機（≥12000r/min）、－20℃冰箱、－80℃冰箱、Eppendorf管（離心管）、棉棒、載玻片、蓋玻片、細胞培養平皿、37℃搖床、96孔培養板、SPF隔離器、紫外光凝膠成像分析儀、微量移液器、低溫恒溫水槽（16℃）、吸水紙。

（2）分離病毒用細胞

1）雞胚成纖維細胞（CEF）　雞胚成纖維細胞制備方法見附錄B。

2）雞胚成纖維細胞自發永生株（DF1）細胞

DF1細胞培養基制備方法見附錄C。

（3）病料的采集與處理

1）全血、血清或血漿　取疑似病雞的全血、帶有白細胞的血漿或血清，無菌接種于長成單層的CEF或DF1，置于含5%二氧化碳的37℃恒溫培養箱中培養。

2）臟器　采集疑似病雞的脾臟、肝臟、腎臟、按臟器質量的1～2倍加入滅菌生理鹽水（含青霉素和鏈霉素各1000IU/ml）研磨，直至成勻漿液，將懸液移至離心管中充分搖振后，4℃ 1000r/min離心5min，收集上清液。

3）疫苗樣品　疫苗樣品處理后接種CEF培養擴增病毒。但為了鑒別是否是外源性ALV，接種DF1細胞或其他抗E亞群白血病雞細胞（C/E）。

4）咽喉、泄殖腔拭子　取咽喉棉拭子時，將棉拭子深入喉頭口及上顎裂來回刮3～5次取咽喉分泌液；取泄殖腔棉拭子時，將棉拭子深入泄殖腔轉3圈并沾取少量糞便；將棉拭子頭一并放入盛有1.5ml磷酸鹽緩沖液的無菌離心管中（含青霉素和鏈霉素各1000IU/ml），蓋上管蓋并編號，10000r/min離心5min后取上清備用。

（4）病毒的分離培養與鑒定

1）病毒的分離培養

① 接種培養：病料接種細胞單層后，置于37℃培養箱中培養2h。然后吸去細胞生長液，換入細胞維持液，培養5～7d。

② 細胞傳代：將①培養的細胞傳代于加有蓋玻片的平皿中，培養5～7d。

2）病毒的鑒定

① 間接免疫熒光抗體反應（IFA）

a.固定：將蓋玻片上的單層細胞，在自然干燥后滴加丙酮-乙醇（6∶4）混合液室溫固定5min，待其自然干燥，用于IFA，或靜置于－20℃保存備用。設未感染的細胞單層為陰性對照。

b.加第一抗體：用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.4）將單克隆抗體（如抗ALV-J亞群特異性單克隆抗體）或抗ALV單因子雞血清（抗ALV單因子雞血清的制備見附錄D）稀釋到工作濃度，在37℃水浴箱作用40min，然后用磷酸鹽緩沖液洗滌3次。

c.加FITC標記二抗：按商品說明書用磷酸鹽緩沖液稀釋FITC標記的山羊抗小鼠IgG抗體或山羊抗雞IgY抗體（當第一抗體為ALV特異性單克隆抗體，選用FITC標記的山羊抗小鼠IgG抗體作為第二抗體；當第一抗體為雞抗ALV單因子血清，則選用FITC標記的山羊雞IgY抗體作為第二抗體），37℃水浴箱作用40min，用磷酸鹽緩沖液洗滌3次。

d.加甘油：滴加少量50%甘油磷酸緩沖液于載玻片上，將蓋玻片上的樣品倒扣其上。在熒光顯微鏡下觀察。

e.結果觀察與判定：被感染的CEF細胞內呈現亮綠色熒光，周圍未被感染的細胞不被著色或顏色很淡，在放大200～400倍時，可見被感染細胞質著色，判為ALV陽性，無亮綠色熒光者判為陰性。

② ALV-p27抗原ELISA檢測

a.抗原樣本制備：將病料同1）、①和1）、②所述方法接種細胞，培養7～14d后取上清液直接檢測；也可取細胞培養物凍融后檢測；或用從泄殖腔采集的棉拭子。

b.P27抗原ELISA檢測：ALV-p27抗原可用商品試劑盒檢測，對不同來源的樣品，按廠家的說明書操作。當樣本在DF1細胞或CEF上檢出ALV-p27抗原時，判為外源性ALV陽性，否則判為陰性。直接用泄殖腔棉拭子樣品檢出p27，說明有ALV，但不能嚴格區分外源性或內源性。

（5）ALV亞群鑒定

1）利用J亞群ALV特異性單克隆抗體進行IFA檢測，可以鑒定J亞群ALV，但不能鑒別其他ALV亞群如A亞群、B亞群、C亞群、D亞群。

2）對分離到的病毒用RT-PCR（上清液中的游離病毒）或PCR（細胞中的前病毒cDNA）擴增和克隆囊膜蛋白gp85基因，測序后與基因序列數據庫中的已知A亞群、B亞群、C亞群、D亞群的gp85基因序列做同源性比較，即可對病毒進行分群。ALV病毒分群方法見附錄E。

（6）熒光定量PCR擴增ALV-J　該方法適用于雞群的檢疫或ALV-J感染的凈化，可在較短時間內完成大量樣品的特異性檢測，血漿或泄殖腔棉拭子樣品可直接用于檢測。

3.血清特異性試驗

（1）儀器和試劑

1）試劑　磷酸鹽緩沖液、禽白血病抗體ELISA檢測試劑盒、FITC標記的山羊抗雞IgY抗體、甘油。

2）儀器　酶標儀、熒光顯微鏡、37℃恒溫培養箱。

（2）樣品的采集　樣品的采集見2.、（3）。

（3）抗體檢測

1）ELISA檢測　可選用禽白血病A亞群、B亞群及J亞群抗體ELISA檢測試劑盒。

2）IFA檢測

① 抗原：抗原制備方法見附錄F。

② 操作步驟：在相應的蓋玻片上或抗原孔中加入用磷酸鹽緩沖液（1∶50）稀釋的待檢雞血清，在37℃下作用40min，用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，再加入工作濃度的FITC標記的山羊抗雞IgY抗體（第二抗體），在37℃作用40min，用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，再加少量50%甘油磷酸鹽緩沖液后在熒光顯微鏡下觀察。

③ 結果的判定：結果的判定方法同2.、（4）、2）、①、e，不論是商品雞群還是SPF雞群，只要檢出A亞群、B亞群及J亞群抗體陽性的雞，就表明該群體曾經有過外源性ALV感染。

附錄A

（規范性附錄）

試劑的配制

A.1　磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01mol pH7.4）

氯化鈉　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　8g

氯化鉀　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.2g

磷酸二氫鉀　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.2g

十二水磷酸二氫鉀　　　　　　　　　　　　　　　2.83g

蒸餾水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　加至1000ml

A.2　包被液（0.05mol/L pH9.6）

碳酸鈉　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1.59g

碳酸氫鈉　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2.93g

蒸餾水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　加至1000ml

A.3　洗滌液

PBS　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1000ml

吐溫-20　　　　　　　　　　　　　　　　   　　　　0.5ml

A.4　樣品稀釋液

含體積分數10%的新生牛血清的洗滌液。

A.5　磷酸鹽-檸檬酸緩沖液（pH5.0）

檸檬酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　3.26g

十二水磷酸氫二鈉　　　　　　　　　　　　　　　　12.9g

蒸餾水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　700ml

A.6　底物溶液

用二甲基亞砜將3’3’5’5’-四甲基聯苯胺（TMB）配成1%的濃度，4℃保存，使用時按下列配方配制底物溶液。

磷酸鹽-檸檬酸緩沖液　　　　　　　　　　　　   　　　　9.9ml

1% 3’3’5’5’-四甲基聯苯胺　　　　　　　　           　　　　0.1ml

30%雙氧水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1μl

A.7　終止液

硫酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　58ml

蒸餾水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　442ml

附錄B

（規范性附錄）

SPF雞胚成纖維細胞（CEF）的制備

選擇9～10日齡發育良好的SPF雞胚，先用碘酒棉再用酒精棉消毒蛋殼氣室部位，無菌取出雞胚，去頭、四肢和內臟，放入滅菌的玻璃器皿中，用無血清的DMEM液洗滌雞胚。用滅菌的剪刀剪成米粒大的小組織塊，再用無血清的DMEM洗滌2～3次，然后加0.25%胰酶溶液（每個樣品約加1ml），在37.5～38.5℃水浴中消化10～15min，吸出胰酶溶液消化產生的懸液，再加入適量的營養液（用無血清的DMEM液，加青霉素、鏈霉素各200～500IU/ml）吹打，用4層紗布過濾。取少量過濾后的細胞懸液做細胞計數，其余在1000r/min下離心5min。將細胞沉淀再混懸于細胞培養液中，制成每毫升含活細胞數為100萬～150萬的細胞懸液，分裝于培養皿中進行培養，形成單層后備用（一般在24h內應用）。

附錄C

（規范性附錄）

DF1細胞培養基配制

C.1　商品化的DMEM液，pH7.2，加5%胎牛血清。青霉素、鏈霉素各250IU/ml。

C.2　培養條件：37℃，5%二氧化碳。

附錄D

（規范性附錄）

抗ALV單因子雞血清的制備

選擇經鑒定無任何其他潛在病毒的ALV參考株作為種毒（如經ALV-J全基因組cDNA克隆質粒DNA傳染SPF雞的CEF所產生的分子克隆化ALV），接種C/E CEF后復制和擴增病毒。病毒接種CEF繼續培養5d后，再傳代一次，將傳代長成單層的CEF換成含1%小牛血清的DMEM維持液，繼續培養72～96h后收取上清液（通常可達最高病毒效價），分裝在離心管中，每支1ml，于－70℃冰箱保存，2～3d后，取出一支，用細胞培養液作10倍系列稀釋后，分別接種于含有新鮮配制的CEF單層96孔培養板上，每個稀釋度8個孔，在37℃下培養6d后，棄上清液，用磷酸鹽緩沖液洗一次后，加入預冷的丙酮-乙酸（6∶4）固定，待自然干燥后，用抗ALV-J的單克隆抗體進行IFA，以IFA的結果來判定病毒感染的終點，測定其中ALV的組織細胞半數感染量TCID50。

選用6周齡以上SPF雞，SPF隔離器飼養。每只雞皮下接種含104個TCID50的ALV懸液，4～6周后采集血清。IFA抗體滴度應≥1∶100。

附錄E

（規范性附錄）

ALV亞群鑒定程序

E.1　克隆載體和宿主菌

商品化的PCR產物克隆載體質粒，或其他類似載體質粒。可用多種大腸桿菌作為宿主菌，如TG1等。

E.2　病毒模板的制備

按照以下程序或商品化提取細胞DNA試劑盒的說明書提取細胞DNA。

（1）接種病毒細胞經磷酸鹽緩沖液洗滌3次。加入適量0.25%胰酶，37℃濕箱中放置5～10min，將細胞消化吹打后收集于1.5ml離心管中。

（2）2000r/min離心收獲細胞，然后加入500μl抽提緩沖液（100mmol/L氯化鈉，10mmol/L Tris-HCl，pH8.0， 0.5%SDS）懸浮后，加入5μl蛋白酶K（100μl/ml），56℃水浴中消化5h。

（3）加入等體積的苯酚-三氯甲烷溶液（苯酚∶三氯甲烷∶異丙醇=25∶24∶1）約500μl抽提1次，將上層液體轉移到另一1.5ml離心管中，加入1/10體積3mol/L的乙酸鈉和2倍體積無水乙醇后，置于－20℃冷卻2h或更長時間。

（4）取出后12000r/min離心10min，沉淀DNA，棄去上清液，再小心加入70%冷乙醇輕洗DNA沉淀，棄去上清液。

（5）經乙醇沉淀后的DNA，空氣中室溫自然干燥后，溶解于50μl雙蒸水中，即為模板DNA。

E.3　囊膜蛋白env基因的擴增

E.3.1　引物

可根據已發表資料合成、擴增ALV-J的前病毒DNA特異性PCR引物，本例示范引物如下。

正向引物：5’-CTTGCTGCCATCGAGAGGTTACT-3’，相當于ALV-J原型毒株HPRS-103前病毒基因組DNA序列的第5394～第5416對堿基。

反向引物：5’-AGTTGTCAGGGAATCGAC-3’，相當于ALV-J原型毒株HPRS-103前病毒基因組DNA序列的第7811～7794對堿基。

引物用雙蒸水稀釋為25pmol/μl，－20℃保存備用。

E.3.2　PCR

以E.2中提取的細胞DNA為模板，擴增ALV-J的囊膜蛋白基因（env）特異性2.2kb條帶，其PCR反應體系（50μl）見表1-9。

將上述成分分別加入滅菌的PCR管中，輕輕混合均勻，離心后置于PCR擴增儀，按照以下擴增程序進行反應。

首輪循環：95℃ 5min，50℃ 1min，72℃ 1min。

中間循環：95℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 90s，進行30個循環；

72℃延伸10min；4℃保存。

E.3.3　PCR產物DNA電泳

用微量移液器取4.5μl PCR產物加入0.5μl 10×進樣緩沖液（0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯苯胺，15%聚蔗糖400），在濃度為0.8%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，同時在另一加樣孔加入5μl DL2000 DNA Marker。在TAE電泳緩沖液中，90V電壓，電泳5min后，于紫外光凝膠成像分析系統中觀察并記錄結果。

E.3.4　PCR產物的回收與定量

可采用商品化PCR產物回收試劑盒進行回收。

（1）將病毒env基因的PCR產物在0.8%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，90V電壓，電泳50min。

（2）將目的條帶切割下來，置于已經稱重的1.5ml離心管中。

（3）再次稱重，計算含目的條帶的凝膠塊質量。

（4）按每毫克加入100μl 碘化鈉，在55～65℃水浴鍋中使瓊脂糖凝膠融化。

（5）加入5μl二氧化硅水溶液，混勻后室溫靜置5min。

（6）12000r/min離心，去掉上清液。

（7）加入1ml洗滌液洗滌沉淀。

（8）12000r/min離心，去掉上清液，再次離心，用微量移液器吸出剩余液體。

（9）干燥后，加入15μl雙蒸水，用微量移液器吹打混勻后，室溫下靜置5min，2000r/min離心，將上清液轉移至另一離心管中。

（10）取1μl回收產物在0.8%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，另加5μl DL2000 DNA Marker，可以估計回收DNA的濃度。

E.4　PCR產物的克隆

E.4.1　鏈式反應

將載體與純化回收的PCR產物于16℃下連接6～8h。

連接體系為：

載體　　　　　　　　　　　　　　　　25ng

純化env基因PCR產物　　　　　　　　100ng

溶液I　　　　　　　　　　　　　　　　5μl

加雙蒸水至10μl

E.4.2　質粒轉化用感受態大腸桿菌的制備

用氯化鈣法制備大腸桿菌TG1菌株的感受態細胞，步驟簡述如下：

（1）一個盛約50ml LB液體培養基的錐形瓶，接種大腸桿菌TG1株，在37℃恒溫振蕩器中振蕩培養至半混濁半透明狀態。

（2）在無菌條件下將細菌轉移到一個無菌的－20℃保存的50ml離心管中，冰上放置10min，使培養物冷卻至1℃。

（3）4℃ 4000r/min離心10min，回收細菌細胞。

（4）倒出上清液，將管倒置1min，以使殘余的培養液流盡。

（5）用10ml經冰預冷的0.1mol/L氯化鈣重懸每份沉淀，冰浴上放置30min。

（6）4℃ 4000r/min離心10min，回收細菌細胞。

（7）倒出上清液，將管倒置1min，以使殘余的培養液流盡。

（8）每50ml初始培養物用1ml經冰預冷的0.1mol/L氯化鈣重懸每份沉淀，4℃保存備用。

附錄F

（規范性附錄）

IFA法抗體檢測用ALV感染細胞的制備

在已鋪滿CEF（C/E）單層細胞的細胞瓶或培養皿中接種0.5ml含103TCID50的ALV（如ALV-J）懸液，37℃、5%二氧化恒溫培養箱中培養，24h后換含1%小牛血清的DMEM培養基繼續培養。繼續培養5d后將細胞單層用胰酶溶液消化分散成懸液，經離心后，重新懸浮于含5%小牛血清的DMEM培養基中。將細胞濃度調至每毫升含5×105個細胞。在加入玻片的培養皿中加入5ml細胞懸液，或在96孔細胞培養板上每孔加入100μl細胞懸液，在37℃繼續培養4d。將玻片從培養皿中取出或96孔細胞培養板棄去培養基，在磷酸鹽緩沖液中漂洗一次后，滴加預冷的丙酮-乙醇（6∶4）固定液室溫固定5min，自然干燥后，用塑料薄膜包裹后置－20℃保存。