第三節　刺激微生物活性促進土壤微生物電化學修復

一、概述

在石油污染土壤微生物修復中，石油烴的去除效率取決于土壤中微生物的生物量和相關酶的代謝活性。對于土壤MFC來說，生物電流能夠刺激或者激發土壤中微生物（產電菌、降解菌等）的生長。利用U形土壤MFC修復老化的石油污染土壤，在靠近陽極的土壤中，石油烴降解菌的數量明顯增加，局部（＜1cm，33%含水量）甚至比對照組高出將近2個數量級，并且隨著跟陽極距離的增加土壤中的石油烴降解菌呈下降趨勢；此外，當土壤MFC中的含水量增加時，對應的石油烴降解菌也隨著增加［4］。然而在利用柱型土壤MFC修復柴油污染的土壤時卻得到了相反的結論［43］。在距離陽極較近的土壤中石油烴降解菌的數量反而低于遠距離的土壤，可能是柴油相對于老化的石油烴來說比較容易被降解，陽極表面的烴類基本被降解去除所致。

但是，石油烴中的PAHs和BETX等污染物對土壤中的微生物毒性較強，因此實際污染環境中這些污染物的生物可降解性較低。有研究表明，簡單的、容易被同化吸收的碳源（葡萄糖等）能夠作為改良添加劑，在刺激土著微生物生長的同時促進較難被生物利用的污染物降解。例如，葡萄糖被證明作為一種良好的添加劑，能夠將氯代芳香族化合物［44］、染料剛果紅［45］、除草劑芐嘧磺隆［46］、喹啉［47］、對硝基苯酚［48］、三硝基甲苯［49］等毒性強、難以被生物降解利用的污染物共代謝降解。這些成功案例對某些環境下污染物的去除發揮了積極的作用。葡萄糖氧化酶是常用的脫氫酶，這或許是葡萄糖與有機污染物發生共代謝的機制所在。

對于石油烴的降解，早些年有報道通過碳源添加進而促進其降解的研究，然而這個過程至今沒有在更為復雜的系統中予以考察。在本節中，我們將分析土壤MFC修復石油污染環境的共代謝現象［50］，該系統相對復雜，因為涉及了較多種類有毒有害污染物的生物降解和直接的生物電子傳遞過程。在構造的活性炭空氣陰極土壤MFC中，將葡萄糖添加到石油污染的鹽堿土壤中，以考察土壤MFC的電能產出性能和石油烴降解狀況，同時通過對土壤生物相的分析進一步明確生物電流刺激對土壤微生物群落的影響。

二、實驗部分

1．葡萄糖的添加

實驗中向土壤MFC中分別添加兩個不同濃度的葡萄糖溶液，添加質量分數為0.1%的標記為低葡萄糖組（LG），添加質量分數為0.5%的標記為高葡萄糖組（HG），同時各自設置對應的開路，分別標記為LGOC和HGOC。此外，設置開路（OC）和閉路（CK）的空白對照，空白對照添加跟葡萄糖等體積的蒸餾水。每個反應器裝入340g干土樣。

整個修復反應過程包括起始階段和維持階段兩個階段。第一個階段，即起始階段（0～71d）：LG和LGOC與90mL質量分數為0.1%的葡萄糖溶液混合均勻，HG和HGOC與90mL質量分數為0.5%的葡萄糖溶液混合均勻，CK和OC與90mL蒸餾水混合均勻，然后裝入對應的土壤MFC反應器；隨后用蒸餾水補給蒸發的水，以維持水封狀態。第二個階段，即維持階段（72～135d）：當土壤MFC的輸出電壓全部低于100mV時，LG、LGOC、HG、HGOC分別添加對應濃度的葡萄糖溶液，同時CK、OC添加等體積的蒸餾水用以維持陽極室厭氧的環境。

2．土壤MFC的操作

土壤MFC的構造采用多層陽極裝置。所有反應器放置于（30±1）℃恒溫培養箱中，每個處理組在設置重復的同時，設置對應的開路對照組。

3．電化學分析

土壤MFC連接于1000?外電阻上，采用多通道信號收集卡采集外電阻上的電壓值。極化曲線和功率密度曲線測定前，土壤MFC開路12h，然后將外電阻分別設置為5000?、2000?、1000?、900?、800?、700?、600?、500?、400?、200?、100?，每個阻值保留20min后測定輸出電壓值，并計算輸出功率密度。

三、結果

1．土壤MFC的輸出電壓與輸出電量

土壤MFC閉合電路后的第24h左右，低濃度葡萄糖添加組（LG）和高濃度葡萄糖添加組（HG）出現第一個輸出電壓的峰值，與閉路空白組（CK）的第50h出現第一個峰值電壓值相比，提前了約26h，如圖3.13所示，說明添加的葡萄糖溶液在一定程度上加速了土壤中電化學活性微生物菌群的適應速度。CK組的最大輸出電壓值為231mV，同時輸出電壓值在200mV以上維持了約12h。與CK組相比，葡萄糖溶液添加后土壤MFC的最大輸出電壓值和高電壓輸出維持時間都明顯增加。LG組的最大輸出電壓值上升至413mV，同時輸出電壓在400mV以上維持了約72h。值得注意的是，HG組的最大輸出電壓為457mV，僅比LG組高了11%，但是HG組的高電壓（＞400mV）輸出維持時間卻比LG組延長了7倍之多。

當向土壤MFC中添加葡萄糖溶液后，輸出電壓的峰值出現得更早，并且高電壓的維持時間也變得更長。土壤MFC的最大輸出電壓值隨著葡萄糖溶液添加濃度的增加而升高，說明對于該研究中的土壤MFC來說，電能的輸出主要受限于土壤中可利用的碳源。但是有趣的是，當添加的葡萄糖溶液濃度更高時（質量分數由0.1%升高至0.5%），土壤MFC的最大輸出電壓卻沒有明顯升高，但是高電壓的維持時間猛增，可能是由于土壤中的產電菌的生物量有限，也可能是由土壤MFC其他組件（例如陽極的有效表面積一定）的限制所致。

如圖3.14所示，在土壤MFC運行的135d期間，CK、LG、HG的電量產出分別為790C、1171C、2859C（兩個重復的平均值）；添加葡萄糖溶液后，土壤MFC的產電量分別增加了48%（LG）和262%（HG）。值得注意的是，整個修復期間，所有的土壤MFC 1/2以上的電量是在第一階段輸出的。從CK組來說，土壤MFC中石油烴的降解主要發生在第一階段。對于LG和HG組來說，與第二階段相比，第一階段的葡萄糖添加量僅占總添加量的43%，也就是說在第一階段期間有相當部分的電量是來源于石油烴的降解。

對于CK組來說，在前25d的時間內，單位質量石油污染土壤、單位活性炭空氣陰極面積所輸出電量平均為238C/（g·m2）。先前使用Pt催化劑涂刷的空氣陰極，修復類似的石油污染土壤，在相同的時間（25d）內采用了更大的陽極面積286cm2（本研究中碳纖維布陽極有效面積為108cm2），最終單位質量的石油污染土壤、單位陰極面積的產電量僅約為3C/（g·m2）［4］，是本研究中的1/78，我們推測可能是由陰極的設計和土壤MFC的構造不同所致。這兩個土壤MFC修復的石油污染土壤基本相同，結果產出電量的差異竟然如此之大，可以看出優化土壤MFC的構型能夠大大提高MER過程中電能的回收效率。另外，從土壤MFC輸出電量的曲線可以簡單看出，前40d可能是MER的主要時期，在后期土壤MFC的輸出電量較小，但是電量小可能是因為土壤中的微生物正在降解難以利用的大分子烴類。

2．土壤MFC的功率密度與內阻

如圖3.15（a）所示，LG和HG組的開路電壓最大值分別為550mV和557mV，相差較?。粚G和HG組連續10h的開路電壓值求平均后竟然相等，同為537mV。CK組的開路電壓最大值為363mV，10h的平均值為317mV，與LG或者HG組相比下降了69%。

從功率密度曲線可以看出［圖3.15（b）］，LG和HG組的最大輸出功率密度分別為35mW/m2和43mW/m2，與CK組的24mW/m2相比，分別增加了46%和79%。我們注意到，在CK、LG、HG組輸出功率達到最大值時，對應的外電阻阻值分別為1000?、700?、600?，說明向土壤MFC中添加葡萄糖溶液后，電池的內阻降低了。在1000?的外電阻下，添加葡萄糖溶液后土壤MFC的開路電壓和輸出功率密度均呈現出不同程度的升高，說明葡萄糖刺激了產電菌的生物量和活性，但是與水介質的電能產出相比相差甚遠，側面反映了在土壤MFC中，由于多方面的限制（內阻較大、傳質較難等）使其電能有效轉化率相對較低。

將交流阻抗譜的奈奎斯特圖按照等效電路擬合后，得出電荷轉移內阻（Rct）是土壤MFC內阻的主要成分（＞50%的貢獻率），分別占到CK、LG、HG總內阻的85%、80%、66%，說明在這些土壤MFC中電荷轉移過程是影響電池內阻的主要因素，與水介質的MFC有些相似［51,52］。對于CK、LG、HG組來說，歐姆內阻（Rs）大小基本類似，約為9?。與其相比，電荷轉移內阻在葡萄糖溶液添加后有所降低，并且隨著添加葡萄糖溶液濃度的增加（從0到0.1%，最后到0.5%），電荷轉移內阻逐漸減小，從48?到39?，最后降至16?，如圖3.16所示。圖3.16中Rct=Rcathode+Ranode，其中Rct為電轉移內阻；Rcathode為陰極內阻；Ranode為陽極內阻。

通過交流阻抗譜的測定，我們發現電荷轉移內阻（Rct）是土壤MFC的主要內阻。因為所有的陰極均為一致的活性炭空氣陰極，所以土壤MFC電阻的差異主要來源于碳纖維布陽極。添加高濃度（0.5%）葡萄糖溶液的土壤MFC的電荷轉移內阻最小，僅為16?，與空白對照相比降低了67%，說明作為外源物添加的容易被同化的電子供體葡萄糖促進了生物電子轉移（例如從生物到電極）的活性。

3．土壤的pH值與電導率

在所有的處理組土壤MFC中，開路（OC）土壤的pH值最高，達9.00±0.08，比原始土壤（OS，8.26±0.12）的pH值高出0.74個單位（約9%），如圖3.17（a）所示。同時，與OS相比所有閉路MFC（CK、LG、HG）土壤的pH值均有所升高，分別增加了4%、5%、2%，差異不明顯。閉路土壤MFC的pH值增加幅度與開路相比較小，說明電化學過程中陽極附近質子的產生緩解了土壤pH值的升高。與對應的開路土壤MFC相比，CK、LG、HG的pH值卻呈現出不同程度的下降，進一步說明閉路土壤MFC中發生了質子的積累現象。此外，隨著添加葡萄糖濃度的增加，土壤MFC開路與閉路土壤pH值之間的差異逐漸縮小，顯示葡萄糖溶液可能起到了緩沖液的作用。

經過135d修復后的土壤，其電導率均呈現出了不同程度的下降，如圖3.17（b）所示。與原始土壤的電導率（1.99±0.09）mS/cm相比，OC、CK、LGOC、HGOC、LG、HG的電導率分別下降為（1.52±0.07）mS/cm、（1.45±0.06）mS/cm、（1.53±0.09）mS/cm、（1.59±0.02）mS/cm、（1.78±0.13）mS/cm、（1.62±0.03）mS/cm。土壤電導率的普遍降低可能是由于土壤pH值的上升，導致了某些離子發生了絡合、螯合或者沉淀，結果降低了土壤中自由離子的濃度所致。此外，石油污染鹽堿土壤修復過程中有鹽析出現象發生，也會降低土壤的電導率。與LGOC和HGOC相比，LG和HG的電導率分別增加了23%和12%。

在土壤MFC中，添加的容易被同化利用的葡萄糖首先會被分解為簡單的有機酸分子（例如乙酸）或者被氧化成為葡萄糖酸分子，此外石油烴在被降解利用的過程中也會產生一些有機酸分子，這些有機酸分子直接影響著土壤理化性質的變化，例如中和來自活性炭空氣陰極擴散出來的氫氧根離子、緩沖土壤pH值的變化、提升土壤中的自由離子濃度、增加土壤電導率等。當然，在這些有機酸分子被生物降解利用以后，土壤的理化性質又會發生較大的變化，但并不是簡單的性質“返回”，因為有些理化過程是不可逆的。

4．土壤的酶活

在微生物電化學處理后，土壤的脫氫酶和多酚氧化酶活性均發生了較大程度的下降，如圖3.18所示。與原始土壤的兩種酶活性相比，實驗結束后所有土壤MFC組（包括開路和閉路）的酶活性僅為原來的20%～55%（土壤的脫氫酶活性）和46%～78%（多酚氧化酶活性）。與空白對照組（OC和CK）組相比，LGOC和LG的兩種酶活性沒有顯示出明顯的差異。然而，當添加的葡萄糖溶液濃度升高至0.5%時，與閉路空白組（CK）相比，HG組的土壤脫氫酶和多酚氧化酶活性分別增加了182%和147%，同時HGOC也比OC組增加了69%和23%。

對于烴類污染物的生物降解，土壤中的脫氫酶和多酚氧化酶活性是兩個至關重要的酶，因為它們是烷烴和芳烴被降解過程中的主要生物催化劑［53］。經過MER后的石油污染土壤，其中的脫氫酶和多酚氧化酶活性顯著下降，可能是由生物可利用的碳源逐漸減少所致，該結果與先前報道的利用土壤MFC修復柴油污染土壤得到的結果類似。然而當向土壤MFC中添加質量分數為0.5%的葡萄糖溶液后，土壤的脫氫酶和多酚氧化酶活性顯著增加，說明添加的葡萄糖作為最容易被微生物利用的有機碳源之一，明顯提升了烴類降解微生物的生物量并活化了降解酶的活性，從而提升了石油烴及其組分的降解率。

5．污染物的降解

土壤MFC修復后土壤中的總石油烴降解率如圖3.19所示。

從圖3.19可以看出，在閉路的土壤MFC中添加不同濃度的葡萄糖溶液后，總石油烴的降解率明顯被提高。LG組的第1層土壤總石油烴降解率最高，達到21%，是空白對照開路組（OC，7%）的3倍，是空白對照閉路組（CK，13%）的1.6倍，與先前報道的老化石油烴降解率相比有所提升。OC組的第3層土壤總石油烴降解率最低，僅為4%。總體來看，所有處理組的第4層和第1層總石油烴降解率相當，第2層和第3層土壤總石油烴降解率相當，但是前者總體高于后者。當開路的土壤MFC被添加葡萄糖溶液后，土壤中總石油烴降解率雖然表現為一定的升高，但是與閉路CK組相比反而有所降低。在混合土壤樣品（四層土壤樣品按比例1∶2∶2∶1均勻混合）中，總石油烴的降解率從大到小依次為LG＞HG＞CK＞LGOC＞HGOC＞OC。

與先前的結果類似 ［4,14,16］，長鏈烷烴仍然是受試土壤中烷烴的主要成分，如圖3.20所示，該石油污染土壤經過了嚴重的老化。在混合土壤樣品中，與空白對照組（OC和CK）的烷烴總體降解率（30%～37%）相比，添加葡萄糖的土壤MFC中烷烴的總體降解率明顯升高，增加了24%～77%。值得注意的是，經過微生物電化學修復以后，除了短鏈的烷烴（C13～C19）被大量去除以外，一些長鏈的烷烴（C30～C40）也同時被降解去除，特別是添加葡萄糖溶液的土壤MFC，降解更為明顯。對于C9～C36的烷烴來說，LG和HG組的降解率比空白對照組（OC）高出1.5～1.7倍，該處增加的幅度與先前報道的微生物電化學修復柴油污染土壤中的提高幅度（1.8～1.9倍）相近［20,43］，但是柴油相對于嚴重老化的石油污染土壤（姥鮫烷含量為34μg/g，植烷含量為201μg/g）來說容易降解得多。

如圖3.21所示，很明顯4種PAHs，即菲（PHE，C14）、熒蒽（FLU，C16）、芘（PYR，C16）和（CHR，C18）的加和量仍然占到測定芳烴總量的大部分。以混合土壤樣品為例，這4種PAHs的加和量占到了16種優先控制PAHs總和的70%。此外，土壤MFC中LG和HG組的PAHs總體降解率分別為38%和44%，與空白對照組（OC和CK）相比提升不明顯。同時，LGOC和HGOC的芳烴降解率相對較低。

在該研究中，單獨向土壤MFC中添加電子供體（葡萄糖）而無生物電流刺激的話，土壤中的總石油烴和PAHs并沒有表現出明顯的降解（圖3.19和圖3.21），甚至兩者的降解率還沒有不添加葡萄糖溶液的CK組高。也就是說，與傳統的只是向污染土壤中添加作為電子供體的營養物質相比，電化學輔助降解的方式可能是一種更具潛力的修復技術。當將兩種方式結合時，即既添加葡萄糖溶液又輔助以生物電流刺激后，土壤MFC中的總石油烴和PAHs的降解率分別被促進了59%～70%和44%～73%。該結果展示出在石油污染土壤修復過程中，葡萄糖的添加和生物電流的刺激作用存在一定的協同關系，特別是對PAHs的降解，推測是存在一種由電流刺激土壤中的混合菌群產生的葡萄糖與烴類的共代謝作用；同時土壤中脫氫酶和多酚氧化酶活性的增加和電池電荷轉移內阻的減小進一步說明了這個結論。

6．生物群落結構

從DGGE指紋圖譜的表觀上看［見圖3.22（a）］，添加葡萄糖溶液的土壤DNA跑膠后的條帶分布較密，并且光密度相對較強。與空白對照相比，條帶13、16、17、21、22、31和35在葡萄糖溶液添加后被不同程度地增強了。另外，第10號條帶在有葡萄糖溶液添加的MFC土壤DGGE圖譜中可以觀察到，但是在沒有葡萄糖溶液添加的土壤中卻幾乎不能被觀察到。通過生物相似樹分析可以看出，與土壤MFC活性炭空氣陰極距離不同的第2層和第4層土壤生物相被區分開，如圖3.22（b）所示。說明生物電流對土壤中的微生物群落發揮了一定的誘導演變作用，并且這種刺激作用在距離土壤MFC的活性炭空氣陰極越近的區域誘導性越強。

在閉路空白對照組（CK）中，第4層土壤的生物多樣性指數（Shannon-Wiener Index）明顯高于它的第2層，見圖3.22（c），而同時第4層的石油烴降解率也比第2層高，更進一步說明了微生物電化學修復過程中生物電流的刺激作用效果。但是從本質上看，對于嚴重老化的石油污染土壤來說，活性炭空氣陰極附近由于氫氧根離子的累積導致土壤的pH值升高，從而增加了老化石油烴類中某些組分的生物有效性。另外，在距離空氣陰極最近的區域生物電流強度更高，對于土壤中微生物的生長刺激作用也更強，因此在土壤MFC中第4層土壤微生物的生物量較高，以致該層土壤中石油烴類的降解率也較高。當添加葡萄糖溶液后，這種本來較大的差異變得微乎其微，可能主要是因為第1層到第4層土壤里葡萄糖溶液貫穿其中，碳源已不再是微生物生長的決定限制因素。此外，葡萄糖溶液的添加對MFC土壤中的微生物群落均勻度影響不明顯，但是對群落的豐度（richness）產生了稍強的影響，如圖3.22（d）、（e）所示。與閉路空白對照組（CK）相比，LG和HG組的豐度有所下降，說明添加葡萄糖溶液后微生物菌群發生了選擇性的富集生長。

7．克隆測序

將測序條帶與NCBI數據庫比對后發現，變形菌門顯然是優勢菌群，主要包括α-變形菌門、β-變形菌門、γ-變形菌門，如表3.5所列。其中，又以γ-變形菌門占據優勢，有趣的是測序比對的γ-變形菌門中71%竟然是大腸桿菌（Escherichiasp.）。雖然大腸桿菌在土壤環境中，特別是在厭氧的土壤環境中普遍存在，但是在構造的土壤MFC中，大腸桿菌是否在電能的產生和石油烴的降解上發揮重要作用，有待于進一步研究考證。此外，也有可能是在克隆測序時操作失誤，沒有將大腸桿菌的堿基剪除干凈，導致比對結果多與大腸桿菌相似度較高。

在選擇的24條帶中，經過核苷酸序列比對后發現，既存在常規的烴類降解菌食烷菌（Alcanivorax，第35號條帶），也存在某些未經鑒定的與石油烴及其他有機污染物降解相關的菌類：第8號條帶UBN-1與萘相關、第9號條帶NBA-1與蒽相關、第16號條帶UPD-1與石油烴相關、第24號條帶URD-1與三亞甲基三硝胺相關。顯然，在該研究的石油烴污染土壤修復中，應該是土著混菌的共同作用將石油烴降解。此外，一些條帶的序列經過比對后發現與厚壁菌門的菌種相似度較高，可能也參與土壤中石油烴的降解。因為厚壁菌與變形菌一樣是較為常見的石油烴降解菌，經常在油類污染土壤中被發現。這些菌是否在微生物電化學修復中發揮作用，發揮怎樣的作用均可作為今后研究的延續。

同時，常被作為MFC中的模式產電菌進行研究的地桿菌（Geobacteraceae）也在該受試土壤中發現，同時相當含量的大腸桿菌也被發現。研究表明，大腸桿菌可通過自身的分泌物完成電子從胞內向胞外固體電子受體（電極）的傳遞，在水介質MFC中被驗證具有產電的能力［21］。因此，在構造的土壤MFC當中，很可能大腸桿菌是產電菌優勢菌，但是由于大腸桿菌的普遍存在性，也有可能它只是存在而已。土壤中微生物種類成千上萬，有可能既存在與傳統產電菌（地桿菌）類似的菌種，也有可能存在新的產電菌（可能是大腸桿菌），對于土壤微生物電化學中產電菌的研究是一個至關重要的問題。

8．相關性分析

土壤MFC中的參數相關性分析如表3.6所列。

從表3.6的相關性分析首先可看出，葡萄糖的添加濃度與土壤MFC電量的產出、內阻、脫氫酶活性、多酚氧化酶活性均呈現出顯著的相關性（p＜0.05）。這從側面說明添加葡萄糖溶液后，土壤MFC的產電性能和修復能力得以提升。而且，葡萄糖添加濃度與土壤微生物種群豐度表現為一定的負相關性（-0.509～0.528），說明葡萄糖作為碳源選擇性富集了某些特定的菌群。土壤pH值和電導率是土壤的兩個基本性質，對土壤中代謝種類及其途徑均有直接的影響。相關分析表明，土壤pH值和電導率與脫氫酶（-0.829*和0.827*）、多酚氧化酶活性（-0.781*和0.770*）顯著相關。同時，土壤電導率與總石油烴的降解率顯著正相關（0.825*），pH值與輸出電量顯著負相關（-0.999*）。烷烴降解率與輸出電量呈現了本研究中最高的相關性（1.000**），說明電能的產生主要來源于容易被生物降解利用的石油烴組分（烷烴等）。

第2層土壤（遠離陰極的土層）生物多樣性主要取決于土壤中石油烴的生物可利用性（0.836*），同時第4層土壤（臨近陰極的土層）生物多樣性與最大電流密度（-0.997*）和輸出電量（1.000*）顯著相關。土壤pH值（0.873*）和電導率（0.969**）也顯著影響土壤微生物的均勻度。土壤MFC的內阻與輸出的電量、酶活性、石油烴及其組分的降解率均呈負相關，說明減小電池的內阻是提升土壤MFC電能產出和修復效率的重要途徑。除MFC內阻外，外電阻的大小也直接影響回路中電流大小。為了增加電流強度，將1000?的外電阻減?。ㄖ?00?），或許能增加土壤MFC修復能力，但電能產出會減少，其結果有待進一步考察。

四、小結

添加葡萄糖，有效促進了土壤MFC電能的產出和石油烴的降解。當土壤MFC中添加葡萄糖后，土壤脫氫酶和多酚氧化酶活性均升高，從而提升了石油烴類降解菌的活性；添加的葡萄糖使土壤MFC中的微生物群落發生了選擇性富集；在土壤MFC中，電流刺激的共代謝過程大大促進了土壤中總石油烴和PAHs的降解；遠離空氣陰極土壤中的生物多樣性主要取決于土壤中石油烴的生物可利用性，而臨近空氣陰極的土壤中生物多樣性受生物電流的影響更大。