01　建立大腦圖譜

邁克·霍利茨（Mike Hawrylycz）

美國西雅圖艾倫腦科學研究所著名科學家

金·丹格（Chinh Dang）、克里斯托弗·科赫（Christof Koch）、曾紅葵（Hongkui Zeng）合著

大腦圖譜簡史

有關人類解剖學的最早記載來自公元前200年左右的希臘醫生克勞迪亞斯·蓋倫（Claudius Galen）。他寫的文集在整個中世紀的醫學領域都占據著主導地位，直到意大利帕多瓦的解剖學家安德烈亞斯·維薩里（Andreas Vesalius）的經典著作《人體的構造》（De humani corporis fabrica）問世（見圖1-1）。維薩里被稱作現代解剖學之父。即使在今天，維薩里繪制的大部分解剖圖依然是準確的，令人驚嘆。近兩個世紀以來，學者們認識到大腦是一個獨立的部分，所有哺乳動物都擁有這種組織結構。但是理解大腦神經系統的結構與功能依然是神經科學的一大難題。為了分析并記錄自己的發現，神經解剖學家們繪制了大腦圖譜。

我們對大腦功能整合方式的理解如今還不全面。這并非研究者不夠努力，而是因為神經結構極其復雜，并且它們之間還相互連接。圣地亞哥·拉蒙-卡哈爾為神經科學奠定了基礎。他繪制并區分出了許多種類的神經元，推測大腦是由獨立神經元相互連接形成的網絡，而不是由無數神經元相互融合而成的一個網狀結構。雖然大腦組織只是半透明的，在神經元層面的分辨率不高，但弗朗茨·尼斯爾（Franz Nissl）發現的某種組織染色素能把細胞核中帶負電子的RNA（核糖核酸）染成藍色或其他顏色，這被稱為尼氏染色法。德國神經科學家科比尼安·布羅德曼（Korbinian Brodmann）基于細胞結構的組織，利用這種染色方法確定了大腦皮層的43個區域（見圖1-2）。這些成果如今依然指引著人類對大腦皮層不同區域功能的研究。布羅德曼、康斯坦丁·馮·艾克諾默（Constantin von Economo）、瑪爾特·沃格特（Marthe Vogt）及其他研究者一起，通過辛苦地目測和描繪少數幾種可觀察的細胞特征，比如描繪細胞的形狀、密度、填充物等，開創性地繪制出了人類大腦皮層的細胞結構和神經纖維結構。

自維薩里之后，大多數的大腦圖譜都被繪制在紙上，用各種鮮艷的顏色描繪出大腦的幾百種結構。實驗室研究的大多數重要有機體都擁有這類大腦圖譜，它們為科學家提供了重要的實驗參考。像現代生物學的大多數領域一樣，技術是促進人們探索大腦結構的重要推動因素。在過去20年中，神經成像技術的發展促使神經科學家重新繪制了大腦圖譜。現代的大腦圖譜就像一個電子數據庫，它體現了大量生理學數據與解剖學數據的時空分布。諸如磁共振成像、功能性磁共振成像、擴散磁振造影、腦磁圖、腦電圖和正電子發射斷層掃描等現代技術，顯著改善了用于研究、臨床診斷和手術的大腦成像質量。由這些技術制作的大腦圖譜使用起來非常方便。為了適應個體獨特的大腦解剖結構，人們可以對這些圖譜進行數字化調整或用電腦進行模擬。

現代大腦圖譜最早在臨床上的運用可以追溯到讓·塔萊拉什（Jean Talairach）的開創性工作。塔萊拉什在1967年創立了三維坐標空間，用以輔助深層的大腦手術。這個圖譜源自一位60歲女性大腦的兩個區域。后來塔萊拉什和圖爾努（P. Tournoux）把它更新成了用于指導腦部手術的印刷圖譜。如今的生物醫學成像已經成了疾病診斷和術前指導的重要依據，醫生會用很多時間和精力在成像中搜尋疾病的生物標志物。大腦圖譜也被用于指導神經外科手術，以幫助醫生“立體定位”，并以坐標為參照進行神經外科手術。運用這些數據，醫生便能對某個患者的大腦成像圖從解剖學、神經功能、血管及其相互關系的角度進行解釋。

大腦圖譜涉及的領域非常廣泛，有高質量的小鼠圖譜、大鼠圖譜、獼猴圖譜、人類圖譜以及其他有機體的圖譜。除了以組織學、磁共振成像和正電子發射斷層掃描為基礎之外，現代數字大腦圖譜還采用了基因表達、基因連接、基因概率和多元技術，并且采用了復雜的可視化軟件。最近，蒙特利爾神經病學研究所（Montreal Neurological Institute，MNI）的艾倫·埃文斯（Alan Evans）及其同事制定了掃描的平均標準，比如，以對一位年輕人進行多重掃描來命名的科林27標準大腦圖和經常被采用的MNI152標準模板。雖然大腦天生具有三維的幾何結構，但磁共振成像、計算機斷層掃描以及正電子發射斷層掃描通常不能讓我們對大腦中某個結構進行詳盡的分析，因為這些技術的空間分辨率有限。因此我們常常用分辨率很高的二維成像技術在體外對大腦組織進行掃描，然后采用復雜的重構算法，將圖像還原到三維的大腦中。

大腦新趨勢

如今，數字大腦圖譜被普遍用于描述神經結構的空間組織特征，也被用于籌備和指導神經外科手術，它還是解釋基因表達或蛋白質組學數據的參考依據。神經科學研究的一個最終目的是認識大腦，弄清人類從行為到意識的一系列活動的大腦工作原理。為了達成這個目的，數字大腦圖譜便構成了一個用于總結、利用和組織這些知識的坐標系。毫無疑問，數字大腦圖譜依然會是未來神經科學技術實現突破的關鍵。

腦的遺傳基礎

現代分子生物學技術與基因組排序技術的發展為我們理解大腦遺傳學開辟了道路。隨著大規模空間基因表達數據的出現，我們獲得了研究大腦解剖結構的新視角。大腦至少包含幾百種不同的細胞類型，目前我們還不能完全清楚它們的分類。每一個細胞的類型都關系到它的功能以及它的基因表達形式，例如，基因表達的決定因素就包括開/關、高/低。我們可以通過各種技術來收集基因表達數據，而對這些數據的探究有望為理解基因與大腦結構之間的關系提供新見解。

早期的基因表達研究采用了如諾瑟雜交（northern blots）這樣的方法。諾瑟雜交法就是先通過電泳的方法將不同的RNA分子加以區分，然后通過探針雜交來檢測目標片段。這種方法一度成為確認基因表達的黃金標準，但它最終讓位于更可量化的方法。微陣列革命顯著提高了我們通過雜交許多基因來探究單個基因芯片的能力。如今，我們能夠應用快速的數字排序技術對單個RNA片段進行測序，一旦知道它屬于哪種有機體后，便可以將它映射回基因組。

2001年，微軟的聯合創始人保羅·艾倫（Paul Allen）在麻省理工學院邀請了一群科學家參會，其中包括史蒂芬·平克（Steven Pinker）⁽¹⁾和冷泉港實驗室（The Cold Spring Harbor Laboratory，CSHL）的詹姆斯·沃森（James Watson）⁽²⁾，一起探討神經科學的未來以及如何能加速神經科學的研究。這次會議形成的觀點是：完成小鼠大腦基因表達的三維圖譜對神經科學界的幫助將是巨大的。因此，研究者會根據現有遺傳研究的資源和實踐性方面的考慮來選擇小鼠。而研究中用來描繪基因表達的技術被稱為原位雜交技術［馬克斯·普朗克研究所的格雷戈爾·艾歇勒（Gregor Eichele）及其同事實現了原位雜交過程的全自動化］。這種技術運用標記的核酸探針與細胞或組織內部中的核酸進行雜交，能夠保持大腦組織的完整性，因此可以提供空間背景（見彩圖1）。

2006年，由保羅·艾倫資助、艾倫·瓊斯領導的一支艾倫腦科學研究所的跨學科團隊，公布了第一份實驗鼠大腦的完整基因表達圖譜。從那以后，艾倫腦科學研究所在網上不斷公開其研究成果，他們整合了成年鼠、幼鼠、人類及其他靈長類動物的基因表達、基因連接數據和神經解剖信息，并且提供了強大的搜索和觀看工具（見圖1-3）。除了數據之外，他們的網站上還有比色和熒光原位雜交圖像瀏覽器、原位雜交的圖像展示、微陣列與RNA測序數據，以及交互式圖譜瀏覽器“大腦探索者”（Brain Explorer），用戶可以瀏覽這些數據集合，對解剖信息和基因表達進行三維查看。全世界每個月大約有55 000名用戶查看艾倫腦科學研究所的大腦圖譜資源。科學家深入探究了這些圖譜，想要在各個腦區中找到與疾病有關的標志基因，確定不同細胞類型的標志物，描繪不同的腦區并對跨物種的基因表達數據進行比較。

2010年5月，艾倫腦科學研究所的人腦圖譜公布。這是第一份解剖學意義上的全基因組三維人腦圖譜。它是6個成年人大腦的轉錄圖譜，其中包含幾百個大腦細分部分的組織學分析和全面的微陣列分析。該人腦圖譜揭示：大腦不同解剖位置具有天差地別的基因表達；組成不同腦區的細胞類型展現出了穩定的分子特性，并且它們在個體之間具有高度的保守性。

特別需要指出的是，這些數據顯示人類84%的基因在大腦中得到了表達，并且，表達模式雖然復雜，但個體之間存在著本質上的相似性。對差異基因表達和基因共表達關系的分析顯示，大腦中的變化反映了主要細胞類型的分布，比如神經元、少突膠質細胞、星形膠質細胞和小神經膠質細胞的分布。所有這些細胞對大腦功能來說都是至關重要的。很有趣的發現是，大腦新皮層表現出了相對同質的轉錄模式，但有著與初級感覺運動皮層相關的特征，而且額葉部分基因的表達非常豐富。大腦新皮層的空間結構很好地反映了它的分子結構。也就是說，如果兩個皮層區域越靠近，那么它們的基因表達模式就越相似。

為了理解大腦組織的遺傳基礎，研究者還在進行其他幾項重要的探索，其中就包括愛丁堡小鼠胚胎數據集工程（Edinburgh Mouse Atlas Project，EMAP）。這個項目記錄了大量小鼠胚胎發育的時間數據和空間數據。其他探索還包括洛克菲勒大學納撒尼亞爾·海因茨（Nathanial Heintz）及其同事實施的基因表達神經系統圖譜（GENSAT）項目，這個項目的目的是利用細菌人工染色體描述轉基因小鼠的基因表達模式。其他類似的探索項目還有大腦基因表達圖譜（BGEM）項目、基因繪制（GenePaint）項目、Eurexpress項目和小鼠基因組信息學（MGI）項目。所有這些項目都提供實用的教程，對用戶很友好。

腦的標準化

根據一個共同的參考框架來描繪大腦的神經科學數據和臨床數據，可以讓科學家和醫生比較不同個體間的結果。建立大腦標準圖譜的一個主要作用是：可以將多樣化的大腦套在一個標準框架內，由此讓我們能更好地理解它們之間相似的特點。另一個作用是：我們可以據此認識到某個不同于普通群體的大腦有多獨特、多不尋常。隨著現代圖像加工技術的發展，數字圖譜可以作為建立大腦標準圖譜的框架，還可以用于調查與之有關的信息。基本的數據庫只允許我們通過單一界面獲取數據。與之相比，復雜的數字圖譜就像一個中樞，人們可以讀取多個數據庫、多種信息資源、相關文件及其注釋。大腦標準圖譜就像腳手架，我們可以借助它來分享、設想、分析、發掘多種形式、范圍和維度的數據。

許多建立大腦標準圖譜的觀點來自20世紀90年代全美醫學研究院的一項重大計劃，它就是“大腦的十年”（Decade of the Brain）。在這項計劃中，一些數字資源和電子資源被創建出來，以便實現神經科學各個子領域的統一與整合。這項工作的成果之一便是形成了神經信息學這門學科。這個研究領域的科學家會運用計算機技術和數學算法來組織和理解大腦數據。神經信息學的最終目標是將大腦結構、基因表達、二維和三維圖像等信息匯總成一個共同的參考框架。圍繞收集大腦數據這個工作已經形成了一些重要的組織，比如國際人類腦圖譜聯盟組織（International Consortium for Human Brain Mapping，ICBM）和國際神經信息學協調委員會（International Consortium for Human Brain Mapping，INCF）。他們的努力促成了一些在神經科學中被廣泛采用的大腦圖譜的問世，其中就有塔萊拉什圖譜和蒙特利爾神經病學研究所的標準圖譜。

建立大腦標準圖譜時需要考慮的一個因素是，采用什么類型的坐標系。正如蒙特利爾神經病學研究所的艾倫·埃文斯所說：“大腦圖譜領域中的核心概念是，用標準化的或‘立體定位’的三維坐標系進行數據分析，再報告神經成像實驗中獲得的發現。這使得大腦研究者可以將許多類型的數據整合起來，之后從背景噪聲中檢測出群體平均信號。無論是結構性信號還是功能性信號都可以用這種方法檢測出來。”標準坐標系是建立數字大腦圖譜的基礎。它需要兩個基本構成：對立體定位空間中坐標系原點的規定，以及將每個三維大腦的天然坐標轉化為圖譜坐標的繪圖功能。實現它們的一個主要步驟就是研究小鼠的大腦，在小鼠身上可以將不同類型的神經科學數據進行合并與比較。小鼠正發展成為神經科學實驗中最重要的被試之一。對小鼠大腦的研究在數字大腦圖譜領域中是一項國際性的合作，由國際神經信息學協調委員會提供部分資助。

腦的連接組

最近有研究證據顯示，人類高超的認知能力來自大腦中大量相互連接的網絡，而不是來自某一特定的腦區，比如前額葉的擴展。這尤其適用于診斷與神經連接異常有關的疾病，比如診斷精神分裂癥、孤獨癥和誦讀困難癥。對于區別化地描述不同疾病的特征，比如區分重性抑郁癥、焦慮癥、強迫癥和物質濫用成癮，包括尼古丁上癮等，神經回路的重要性受到了大家的普遍認可。

如今我們認為，神經性精神障礙可能源自神經系統病變，因為復雜的遺傳因素與環境因素都會對神經回路產生影響。正如賈森·伯蘭德（Jason Bohland）和他的同事在2009年的《PLOS計算生物學》（PLOS Computational Biology）中提出“中尺度”連接組時所指出的：“對于具有遺傳易感性的疾病，遺傳多態性與細胞活動發揮著更大的作用，但對于理解癥狀、開發療法，解剖結構學上的神經回路依然很重要。”例如，對于治療帕金森病來說，基于藥物和基于刺激的治療干預不會發生在特定細胞的病變部位，這一判斷便來源于大家對錐體外系運動系統的神經元之間相互作用的認識。

美國印第安納大學的奧拉夫·斯波恩斯（Olaf Sporns）和瑞士洛桑的帕特里克·哈格曼（Patrick Hagmann），最早提出了定義大腦連接圖譜的統一方法。2005年，他們首次提出了“連接組”（connectome）這個術語，用它代表大腦中神經連接的完整圖譜。這個術語直接受到了當時人類基因測序項目的啟發，從那以后，連接組學（connectomics）便涉及收集并分析有關連接組的數據集了。最近，塞巴斯蒂安·宋（Sebastian Seung）的同名書讓“連接組”這個詞變得流行起來了。這本書探討了描繪人類連接組的目標，還討論了科學家在微尺度上建立大腦組織三維圖譜的努力付出。

研究者最早在秀麗隱桿線蟲體內發現了完整的神經回路。科學家對它的細胞生物學和發育生物學的研究可以追溯到1974年，當時的研究者正是諾貝爾獎獲得者悉尼·布倫納（Sydney Brenner）。從那以后，秀麗隱桿線蟲便成了生物學研究中普遍采用的典型有機體。研究者在描繪其神經回路的研究中使用了高分辨率的電子顯微鏡，對幾百幅圖像進行了手工注釋，可謂神經解剖學領域中的偉大壯舉。1986年，這些圖像由英國皇家學會整理出版，約翰·懷特（John White）和悉尼·布倫納為這個341頁的出版物起名為“秀麗隱桿線蟲神經系統的結構”。其他里程碑式的研究成果包括：1991年由丹尼爾·費勒曼（Daniel Felleman）和戴維·范·埃森（David Van Essen）發表的對獼猴視皮層和神經連接進行研究的論文，以及1999年J. W.斯坎內爾（J. W. Scannel）和同事對貓科動物大腦中丘腦系統進行的研究。從那時起便出現了幾個有關神經連接的神經信息學數據庫，比如在線的獼猴大腦連接數據校對工具CoCoMac和大腦結構管理系統（Brain Architecture Management System，BAMS）。

幾年后，在政府公共資金和私人資金的支持下，一系列獨立的研究項目開始描繪實驗室小鼠的中尺度連接組。其中，艾倫腦科學研究所啟動了一個大規模研究項目，試圖繪制區域性的以及特定大腦細胞類型的大腦三維連接圖譜。“艾倫小鼠大腦連接圖譜”使用了普通小鼠和轉基因小鼠作為被試，實驗采用了基因追蹤法和高通量雙光子斷層掃描系統來呈現小鼠大腦中被標記的軸突。他們從每100微米的長度中抽取一個高分辨率的小鼠大腦冠狀面圖像。即便這樣，每個大腦的數據集都能夠達到750 GB。到2013年底，研究者收集的數據達到了大約1 500 TB，所有的圖像繪制在同一個三維參考系中，這個參考系具有高度的空間保真性，這樣研究者便能識別出支配小鼠行為與大腦功能的神經回路了。

繪制人類大腦的連接組是21世紀最大的科學挑戰之一。人類連接組計劃（Human Connectome Project，HCP）正在應對這個挑戰的關鍵部分，他們采用的方法是闡明人類大腦功能與行為背后的主要神經通路。由于人類大腦非常復雜，而且尺寸相對較大，因此人類連接組計劃采取了更宏觀的方法來描繪大尺度的神經回路。他們的目標是，通過采用多種非創傷性神經成像技術，比如采用磁共振成像、腦電圖和功能性磁共振成像技術來繪制出1 200名健康成人的大腦回路。

在功能性磁共振成像中，準確進行大腦分區對描繪大腦的連接組非常重要，這讓我們又回到了最初有關解剖學的探討。我們能夠利用現代成像技術對大腦皮層進行劃分，然后運用纖維束示蹤成像技術和功能性磁共振成像技術來測量大腦連接模式，并根據這些不同的連接模式來界定大腦皮層區域。這類分析最好結合各種非創傷性成像技術，并在整個大腦的范圍內進行。科學家希望對整個大腦的劃分越來越準確，由此得到的正常人的大尺度連接組也會越準確，這樣我們就可以將它與處于疾病狀態的大腦區域進行比較。

如今的非創傷性成像技術還無法捕捉到神經元層面的大腦活動，描繪脊椎動物細胞層面的連接組則需要對其死亡后有限的大腦組織進行顯微分析。大規模進行這樣的操作無疑是一個巨大的挑戰，因為在高度進化的有機體中，大腦的神經元數量動輒達到幾十億個，單是人類大腦皮層就包含了數量至少在10¹⁰數量級的神經元，神經元之間的突觸連接也達到了10¹⁴的數量級。如今，描繪哺乳動物微尺度連接組的主要挑戰在于：鑒于當下的技術，單是收集數據便要花費數年時間；現有的注釋工具不足以支撐我們對大量的神經元信息進行充分的記述和提取；其中尤為重要的是，我們還沒有發展出描繪相關神經連接并建立連接圖譜的算法。為了解決這些機器視覺與成像處理方面的問題，出現了匯集群體智慧的開放連接組項目（Open Connectome Project）。統計圖譜學是一門新興的學科，它正在形成復雜的模式識別與推理工具用以分析這些大腦圖譜。

大腦的未來

建立大規模大腦圖譜是當今神經科學的一項重大任務。盡管我們不可能在近期系統化地繪制出大腦眾多神經元中的每一個，但現代繪制技術使得大腦圖譜具有了很高的分辨率和功能性特征。

神經成像領域中的一些新進展使得深入、大規模地描繪神經元成為可能，這個目標看起來似乎不像一開始想象的那么大膽。例如，利用組合顏色標記法來描繪神經元的“腦彩虹”便是基于幾種類型熒光蛋白的隨機表達來實現的。哈佛大學的約書亞·薩內斯（Joshua Sanes）和杰夫·利奇特曼（Jeff Lichtman）可以用100種不同的顏色來標記單個神經元。用可辨別的色彩標記神經元后，研究者便可以追蹤并重建它們的細胞結構，比如，追蹤一塊大腦組織中的細長突起。這類神經元標記技術使我們能夠對微小的神經元進行分類和顯影。斯坦福大學的斯蒂芬·史密斯（Stephen Smith）開發了另一種對多樣的突觸代碼進行分類的方法。這種方法被稱為陣列斷層成像技術，它還可以用電子顯微鏡對神經突觸連接進行組合標記。

不久前，來自德國于利希鎮的凱特琳·阿蒙茲（Katrin Amunts）和卡爾·齊爾斯（Karl Zilles），在實驗室把單個人腦切成近7 500個薄片，然后進行掃描，并以20微米各向同性的分辨率重建了大腦的虛擬三維模型。他們采用的是蒙特利爾神經病學研究所艾倫·埃文斯開發的半自動重構工具。這堪稱神經科學領域的一大壯舉。這個被稱為“BigBrain”的大腦圖譜具有近乎細胞級的分辨率，也就是說，它的精細程度差不多達到了細胞層面。由于研究者收集了幾乎所有的切片進行三維圖像重構，因此BigBrain的數據集是傳統磁共振成像的12.5萬倍。磁共振成像的圖譜無法呈現大腦細胞層面和大腦皮層的信息，但BigBrain圖譜能夠做到這一點。然而，要想讓BigBrain圖譜成為完善的大腦圖譜，還需要對它進行注釋，換言之，需要提供對大腦解剖結構的描述，以概括出大腦的精細結構。

BigBrain圖譜表明，現有的高分辨率三維顯微鏡依然不夠精細，無法描繪出大腦最細微的結構。然而，三維成像領域同樣取得了進步。2013年，《自然》雜志上的一篇文章提到的一種方法引起了廣泛關注，科學家將大腦放入三維的親水聚合物網絡中，然后用電泳去掉大腦的油脂。這樣大腦可以既保持完整，又具有光學透明性，大分子也能滲透進去。利用小鼠的大腦，研究者呈現了完好大腦組織中遠程投射、局部神經回路、細胞關系與亞細胞結構的圖像。這種技術被稱為“CLARITY”的腦透明3D成像技術，它采用原位雜交的完整組織以及在非切片組織中進行多輪染色去色的免疫組織化學法，來顯現基因表達或蛋白質結合的情況。這種技術仍需改進，但它對人類腦死亡后的造影可能會有幫助。

為了處理這些新圖譜產生的大量數據，找到其他的計算加工技術也很有必要。2012年，麻省理工學院塞巴斯蒂安·宋發起的公眾科學項目“EyeWire”，試圖通過一個互動游戲來集思廣益，讓每位貢獻者都嘗試繪制出視網膜的連接組。本主題部分的第4章會簡要介紹解決這個問題的另一種方法。

大規模的大腦圖譜正通過分子數據、細胞數據、功能數據和連接組數據為神經科學界提供研究資料。從印刷大腦圖譜到數字大腦圖譜的轉變具有革命性，數字大腦圖譜更方便我們瀏覽，使我們能夠對大腦進行三維重構和可視化，從最小的細胞核到宏觀尺度的腦區都可以涵蓋到。數字大腦圖譜還改變了臨床神經科學，醫生在術前至術后的各個階段都在以某種方式使用數字大腦圖譜。在不遠的未來，我們還有可能完成對大腦結構三維微尺度圖譜的注釋。幾年后，我們有可能獲得人類大腦皮層某個重要部分中近乎全部的樹突連接和軸突連接信息。由此說明，大腦的皮層回路是多么錯綜復雜。大腦圖譜將會把更多的科學工作流與臨床工作流整合進來，為科學研究提供幫助，為診斷、監控和治療大腦疾病提供新方法。