植物DNA 條形碼研究現狀與核DNA 條形碼篩選

◎汪小全

會議時間

2012 年 8 月 1 日下午

會議地點

昆明錦江大酒店三樓 2 號會議室

主持人

李德銖

新觀點新學說學術沙龍今明兩天將在此舉行，我有幸與中國科學院植物研究所汪小全研究員和中國醫學科學院陳士林研究員一起作為領銜專家來協調此次沙龍相關活動。我謹代表承辦單位向應邀出席本期學術沙龍的省內外學術專家表示熱烈的歡迎。同時，對《中國科學報》、《科技日報》、《云南日報》以及相關媒體朋友的光臨表示衷心地感謝。

DNA 條形碼是 2003 年由加拿大皇家學會會員 Paul Hebert 院士提出的。Paul 是一位昆蟲學家，因此，DNA 條形碼最初也主要運用于昆蟲分類學的研究中。一直到 2005 年植物學家才開始介入這項研究。中國植物學家介入的時間相對較晚，但是從陳士林研究員今天上午在第七屆西部地區植物科學與開發研討會所做的大會報告中，我們可以看出其在中藥鑒定方面的發展非常快。2009 年由中國植物條形碼工作組提出的植物 DNA 的核心條碼，也呼應了陳士林研究員前期的一些工作，即把核糖體 DNA 的 ITS 片段作為標準條形碼的組成部分提出來。應該說，DNA 條形碼是對傳統物種鑒定的一個非常有力的補充，但不是唯一的辦法，一定還要依賴其他各種手段。但它使標本鑒定的過程有可能實現自動化和標準化，極大地促進了人類認識、了解和利用生物多樣性的能力，同時能在較短時間內建立易于利用的應用系統。植物 DNA 條形碼在生命科學、法醫學、流行病學、醫藥、食品衛生安全等方面具有廣闊的應用前景。我國是植物資源非常豐富的一個國家，云南素有“植物王國”、“動物王國”之稱，在生物多樣性方面，在全國乃至世界都占有非常重要的位置。因此，依靠全國植物學家的學術優勢，依托昆明植物所和相關研究單位以及大學的研究平臺，以植物 DNA 條形碼前沿探討為主題，在云南昆明舉辦中國科協第 62 期新觀點新學說學術沙龍，對深入研討 DNA 條形碼研究的最新進展及相關應用前景，促進新觀點、新思維、新方法的交流、碰撞和融合，推動我國植物 DNA 條形碼研究的發展，進一步提升我國在該領域的國際地位，具有十分重要的意義。

DNA 條形碼最早用了一個線粒體基因 COI，但在植物中線粒體變異很大、保守性很強，較難運用于物種鑒定。直到 2009 年，植物學家才正式在美國科學院院刊上發表用葉綠體的兩個基因 rbcL 和 matK 作為陸地植物的核心片段。實際上它們在大類群的分析上較有把握，但在小類群的分辨上尚有不足。此外，最近一期 Molecular Ecology 上提出 meta －barcoding 的概念，利用 ITS 及新一代測序儀測一兩百個堿基的片段就能比較準確地鑒定出物種。此外，他們在動物的腸胃道中做食性的條形碼，這樣可以解決很多從前生態學家無法觀測或研究的一些問題。陳士林研究員的報告也從中藥的角度展現了一些非常好的案例。這說明，我們中國科學家有可能在這方面趕上甚至引領國際的學術潮流。這項研究在植物學界難度相對較大，起步也較晚，但是目前有一個相對較好的態勢。今年 5 月 29 日，國際生命條形碼計劃( iBOL) 科學指導委員會主席 Pete Hollingsworth 教授專門到昆明來簽訂了下一期的合作協議，這也是對中國地位的一個高度認可。我們期望與會的各位專家學者充分利用此次沙龍平臺，廣泛深入地交流國際、國內在相關領域的最新進展以及各位的研究成果，從不同視角進行交流碰撞，激發出新的思想火花。可以說，DNA 條形碼原本就需要在爭論中成長。

2011 年 12 月到澳大利亞阿德萊德參加第四屆國際 DNA 條形碼大會時，與會代表普遍認為，DNA 條形碼已經趨于成熟，但這也是相對于之前來說的，現在看來仍有不少問題值得深入探討。希望本期學術沙龍能形成一個注重實效、成果豐碩的高水平學術會議。我們要以“敢為天下先”的創新精神促進我國 DNA 條形碼領域的研究和應用。特別感謝各位老師和同學遠道而來參加這個論壇，希望這次論壇能夠取得圓滿成功。

隨著生物 DNA 條形碼技術的快速發展，細胞質( 尤其是葉綠體) DNA 條形碼已在植物界得到廣泛嘗試和應用。相信今天參加這個學術沙龍的專家學者對 DNA 條形碼都比較熟悉，所以一些常識性的內容就不過多介紹了。我主要介紹植物核 DNA 條形碼篩選的背景和應用的可行性。

由于植物的線粒體基因組結構變異頻繁、基因序列保守，且在有些類群中存在橫向基因轉移，因而線粒體基因很難用作植物的 DNA 條形碼。目前植物學家建議的 DNA 條形碼候選基因主要來自于葉綠體基因組( 無論是幾個片段的組合) ，并在一些類群中顯示了較好的應用前景，但仍存在很大的局限性。我主要講四點: ①植物界種間雜交頻繁，約 11% ～ 25% 的物種是雜交起源的，雜交帶更普遍，單親遺傳的葉綠體基因難以鑒定雜交起源的物種和雜交帶個體的歸屬。②已有證據表明，在從苔蘚植物到被子植物的陸生植物各大支系中，大部分現存物種源于新生代中晚期的快速輻射分化，很多是在晚中新世和上新世形成的物種，物種分化時間較短，種間常常不存在生殖隔離。已有的葉綠體 DNA 條形碼候選基因的進化速率較慢，很難分辨這些近緣物種。若要建立這些物種的 DNA 條形碼，需要從快速進化的核基因入手。③植物的葉綠體基因組是內共生起源的，雖然仍在光合作用等方面起非常重要的作用，但在進化的長河中丟失了大量基因或將一些基因轉到了核基因組，變得非常簡化。我們看到的植物形態性狀( 包括分類鑒定利用的性狀) 大多與核基因的表達和調控有關。也就是說，葉綠體基因難以反映絕大部分形態性狀的遺傳基礎和物種的真正屬性。尤其是葉綠體 DNA 漸滲發生時，會出現類似一個母本的“軀殼”承載父本核基因組信息的現象。在這種情況下葉綠體 DNA 條形碼鑒定的是“軀殼”而非實質。④植物資源的利用和管理( 如道地藥材和農作物種子鑒定) 在很多情況下涉及近緣物種，甚至不同品種，迫切需要高度靈敏的 DNA 條形碼。

由于上述原因，作為中長期目標，在雙親遺傳的核基因組中篩選高靈敏度的植物 DNA 條形碼勢在必行。近幾年，我國學者提出核 rDNA 的 ITS2/ITS 作為植物 DNA 條形碼候選基因，得到了國際上較廣泛的關注，并在中藥材鑒定中取得了顯著成效。然而，rDNA 在基因組內一般有多個位點和非常多的串聯重復拷貝，有時致同進化不徹底，在基因組內和基因組間存在序列多態性，加上PCR 擴增時易受內共生真菌 DNA 的“污染”等，這些問題又限制了 ITS2 /ITS 用作核心植物 DNA 條形碼，尤其是在蕨類植物和裸子植物，以及很多被子植物多倍體物種中的應用效果不是很理想。

理論上講，單拷貝核基因最適于作植物核 DNA 條形碼。核基因外顯子序列相對保守，可用于鑒定植物科、屬; 內含子序列的進化速率快，可用于分辨不同物種。但總體而言，核基因條形碼的引物通用性較差，通常需要基因克隆，工作量大，耗費多，有時近緣物種間共享等位基因，較難處理。雖然我們面臨很多挑戰，但大量植物物種的基因組序列已經或正在被測定，覆蓋植物界各大代表類群，海量的基因組序列為單/低拷貝核基因條形碼的篩選提供了便利條件。例如，Claude de Pamphilis 教授研究組2010 年在 BMC Evol. Biol. 上發表了一篇文章，通過比較基因組研究，鑒定出擬南芥、毛果楊、葡萄和水稻四個物種中共享的大量單拷貝核基因; 又如，馬紅教授研究組最近在 New Phytol. 上發表了一篇文章，通過對 7 個被子植物物種和小立碗蘚的基因組序列比較，在被子植物中鑒定出了 1083 個高度保守的低拷貝核基因，并嘗試用其中 5 個基因重建被子植物的系統發育，取得了很好的效果。這些單/低拷貝核基因是我們篩選植物核基因條形碼很好的候選基因。此外，由于 LEAFY 基因在很多植物類群的種間關系研究中非常成功，特別是其內含子序列對近緣物種有很好的分辨率，我的研究組曾建議該基因作為植物核基因條形碼的候選基因( Ran et al. ，2010，J Integr. Plant Biol. ) 。

總之，核基因條形碼在植物物種鑒定中將發揮重要作用，通過外顯子與內含子組合完全有可能在將來分辨更多的物種、更近緣的物種以及更多的種下等級。有些學者甚至認為新一代基因組測序( NGS) 技術會很快取代目前生物DNA 條形碼的篩選模式，建議直接利用基因組序列作為物種的基因條碼。這樣的問題也值得我們深思。

李德銖:

DNA 條形碼可以解決很多問題，但是并不能解決所有問題，不論是稱為輔助手段還是有力補充，它都不是包打天下的，這是對條形碼的一個相對準確的認識。本期沙龍的主題是“植物 DNA 條形碼的研究現狀”，請各位圍繞這個議題從不同的視角和不同的觀點，提出一些意見、建議甚至質疑。

劉吉開:

我是一個完全的外行。就 DNA 條形碼本身來說，本質上還是個化學問題，DNA 也就是那幾個堿基構成的編碼。DNA 條形碼作為一個迅速發展的技術，應該說是一個非常有用的工具。條形碼本身的科學問題到底有多少，請大家考慮一下。我想強調的是，它更多的還是技術和方法學的問題。它作為一種工具來解決科學問題，剛才幾位也講過了。現在篩選出的幾個有用的片段組合，鑒定率達到 70%、80%，甚至更高，是一個非常了不起的成就。這些片段也是從大量的片段中篩選出來的。這個篩選是盲篩吧? 有沒有理論指導? 有沒有理論假說作為指導，能夠更有效地篩選出高效鑒別的片段? 還是像我們篩藥物的那樣就是盲篩?

李德銖:

有一定的理論指導。條形碼是動物學家提出來的，當時用的是線粒體DNA，動物能量代謝比較快。植物線粒體基因的進化速率特別慢，所以在植物中沒辦法用線粒體。植物的系統發育研究中葉綠體用得比較多，進化速率較快，所以我們更多的是用葉綠體片段。葉綠體先是從 10 個或 8 個片段中篩選，也有一些是從葉綠體全基因組比較分析推測來的，但是總歸會有一些盲篩的嫌疑。比如說韓國金基重教授( Ki － Joong Kim) 在通過對人參屬幾個種的葉綠體基因組做了測序的基礎上，提出了 psbK － psbI，強烈建議用這個片段，但是沒有得到歐美科學家的認可。經過國際 DNA 條形碼植物工作組的協調，提出了rbcL 和 matK 作為一個初始片段，目前得到了大家比較廣泛的接受。

劉吉開:

除了單一物種的鑒定，有無混合物種的鑒定方法?

陳士林:

關于混合品的鑒定，澳大利亞的一位學者最近在 PloS Genetics 發表了一篇文章，他從由中國進口到澳大利亞的中藥材混合品中鑒定出有毒的、禁用的動植物藥材，所利用的就是條形碼技術。在該文章中就引用了我們課題組的 5 篇文章，說明我們的前期工作還是給他們提供了很好的基礎，同時表明 Barcoding這個技術是可以應用到混合品鑒定、飲片的鑒定，甚至可以應用到一部分道地藥材的鑒定中。目前第一步還是應用在種間鑒定，因為類似于飲片的鑒定容易引起爭議，不過作為發文章是有可能的。

汪小全:

在堅實的理論基礎上篩選標記是個很好的建議。植物界物種繁多，形態五彩繽紛，以往鑒定物種多需要花、果性狀，但近年來的研究發現這種豐富的形態多樣性的產生常常與轉錄因子的調控有關。我們現在篩選的 DNA 條碼，比如某一物種在某一基因片段上固定了幾個堿基差異，是長期進化的結果，未必與近緣物種間的形態分化直接相關，但是可以作為一個標記，鑒定物種和混合樣品。

劉吉開:

基因標記是否有特異的 RNA 與之相關? 它們是否也可用于鑒定?

汪小全:

小 RNA 的變異還是非常復雜的，是否可用于物種鑒定，有待研究。

何新華:

在檢疫和禁毒方面還是很有實用價值的。雖然用處很多，但并不是所有植物都是用光合作用的，也有很多低等植物和水生植物是異養的，還有混合型的，那么為什么只用葉綠體基因去鑒別? 沒有葉綠體的植物怎么辦呢?

汪小全:

這個問題很好。其實，一些異養和寄生植物仍具有質體( 葉綠體) 基因組，只不過基因組中基因的丟失程度不同。這些類群很多都有 rbcL 和 matK 基因，當然有些物種丟失了這兩個基因( 如地下蘭) 或其中一個( 如鳥巢蘭) 。在列當科寄生植物 Epifagus virginiana( 白花蛇根竹) 中，葉綠體基因組僅約 70kb 長，大量的基因都丟失了。對于這些類群，需要篩選其他基因( 尤其是核基因) 作條形碼標記。

高連明:

條形碼并不是單獨使用 ITS 或葉綠體片段，我們目前推薦的是用核基因和葉綠體基因的組合。目前利用的葉綠體基因就是原來的核心條碼 matK 和rbcL，已經得到了國際生命條形碼聯盟的認可。2011 年 11 月份我們在 PNAS上發表的文章，提出把 ITS 作為種子植物的一個標準條碼。如果說葉綠體的基因擴增不出來，還可以用核基因 ITS 來鑒定。

我再回應一下剛才劉吉開老師的問題。篩選 DNA 條碼是有嚴格標準的。第一，就是通用性，即希望所用的條碼在所有的生物類群中都能夠擴增出來; 第二，序列的可讀性，測序后得出的序列質量要好，不僅要能擴增出來，還要能夠測序并可得到高質量的序列，用于條形碼的獲得; 第三，物種的分辨率，所用條形碼必須要有一定的物種分辨率，能夠把物種分開。這三個標準是必須考慮的，可讀性還要考慮序列長度，一般在 300 ～ 800bp 之間。這樣我們用常規的 Sanger 法測序的正反兩個引物能夠覆蓋條形碼的長度，保證獲得高質量的條形碼。

現在也有很好的方法來篩選 DNA 條碼。如可以對不同科屬的葉綠體全基因組測序，通過比較葉綠體全基因組相同片段的不同分化速率，從中找出進化特別快的條碼，再按上述三個標準進行篩選。另外，核基因條形碼的篩選也可以利用全基因組的信息來篩選，類似的工作也有報道。

第二代測序儀做混合品的鑒定是非常有優勢的，雖然不知道樣品來源，通過測序得到大量數據，分析數據能得到很多的 OTUs ( operational taxonomic unit，分類運算單元) 。通過這些序列分析，我們如果有一個很好的 DNA Bar-coding 參考庫，就可以較容易知道混合品中包括哪些物種了。第二代測序儀的優點在于可以得到大量的數據。

汪小全:

在植物中用葉綠體基因和核基因組合有一個非常好的優勢。植物與動物不一樣，動物中雖然也有類群雜交等問題，但動物的多倍體要比植物少很多。植物中雜交和多倍化基本相伴隨，雜交形成的物種至少占 10% 以上，多倍體系列也很復雜，種間形成的雜交帶很常見。這種情況下的條形碼鑒定結果是葉綠體基因代表母本、核基因代表雙親，二者的組合不僅可以把物種鑒定清楚，還有助于弄清該物種的進化歷史。在將來，一種可能就是葉綠體基因做主碼，先鑒定出科、屬、孤立的物種和物種群，然后針對年輕的物種/物種群，在具體的類群中加 ITS 或一兩個核基因條碼。另一種可能就是在目前的基因組序列中篩選出很好的核基因，在外顯子中設計較通用的引物，那么這個外顯子序列就相當于 rbcL 和 matK，能夠很容易地鑒定到科、屬，PCR 直接測序就能獲得外顯子序列( 雖然有時可能會有雜合峰) ，然后利用內含子序列鑒定近緣物種。如果等位基因間沒有插入/缺失差異，內含子也可以直接測序。其實，隨著技術的發展，即便等位基因間存在插入/缺失，將來也未必要通過克隆的方式解決。

龐大的核基因組能提供海量的變異信息，個體間都能找到大量差異，這可能是未來 DNA 條形碼發展的一個趨勢，值得我們繼續探索。

王紅:

關于異養植物是否可用目前推薦的條碼進行研究這個問題。馬先蒿屬由于其半寄生等特性已經從玄參科中移到了列當科中，列當科大部分植物是全寄生的，除了推薦條碼，還有光敏色素 a、b 這些片段可以用作不同營養方式的一個補充。馬先蒿這個半寄生的大屬在整個北溫帶都有分布，全世界有 600 多種，中國有 350 多個種，我們最近通過利用核心條碼對其中 100 多個種研究顯示，其分辨率達到 95% 以上，接近完美。當然不同的類群會有不同的情況，但目前推薦的條碼對解決馬先蒿種間關系來說是很有效的工具。