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五、等電點測定

蛋白質的氨基酸組成不同,因而有不同的等電點(pI),等電點是測定重組蛋白生產工藝穩定性的重要指標。常用的等電點測定方法有等電聚焦電泳(IEF)及毛細管電泳(CE)。其中前者為藥典法定方法。

(一)等電聚焦電泳(IEF)

依據各種蛋白質pI不同,以聚丙烯酰胺凝膠為電泳支持物,并在其中加入兩性電解質載體。兩性電解質載體在電場作用下,按各自pH形成從陽極到陰極逐漸增加的平滑和連續的pH梯度。在電場作用下,蛋白質在此pH梯度凝膠中泳動,當遷移至pH等于pI處時,不再泳動,電流達到最小,而被濃縮成狹窄的區帶。根據標準品的pI對其相應的遷移距離作直線回歸,將供試品的遷移距離代入直線回歸方程,即可求得蛋白的等電點。

(二)毛細管等電聚焦電泳(CIEF)

毛細管等電聚焦電泳,是通過內壁涂層使電滲流減到最小,再將樣品和兩性電解質混合進樣,兩個電極槽中分別為酸和堿,加高電壓后,在毛細管內建立了pH梯度,溶質在毛細管中遷移至各自的等電點,形成明顯區帶,聚焦后用壓力或改變檢測器末端電極槽儲液的pH使溶質通過檢測器。具有分辨率高、簡便快速等特點。
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